מדידת In Vivo שינויים עצביים חוץ-תאית במהלך טבעי מתגמל בהתנהגויות של אוגרים סוריים הנשי

המטרה הכוללת של הליך ניסוי זה היא למדוד שחרור נוירוטרנסמיטורים בבעלי חיים שמתנהגים ערים. למרות שסרטון זה מדגים יישום למדעי המוח ההתנהגותיים, עם היכולת לאפיין שחרור נוירוטרנסמיטורים ספציפיים, ביחס לאירועים התנהגותיים ספציפיים, ניתן להשתמש בטכניקה זו במגוון תת-דיסציפלינות אחרות של מדעי המוח, כגון הזרקת תרופות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא האופי המוכן שלה למדוד שחרור כמעט בזמן אמת של נוירוטרנסמיטורים in vivo.

התחל בהזרקת 500 מיקרוגרם של פרוגסטרון ב-0.1 מיליליטר שמן זרעי כותנה, תת עורי, ארבע שעות לפני הכנסת הזכר כדי לגרום לקליטה מינית. הקפד לבדוק כל בעל חיים בתחילת השלב החשוך של המחזור היומי שלו, מכיוון שהתנהגויות חברתיות של מכרסמים נתונות לשינויים בתנאי בדיקת אור לבן ואור אדום. הפוך את פתרונות הכיול לטריים ביום הבדיקה בצינורות צנטריפוגה מזכוכית של 20 מיליליטר.

עבור תמיסת האנליט, ממיסים 7.4 מיליגרם של חומצה L-גלוטמית לתוך 10 מיליליטר מים טהורים במיוחד על ידי היפוך עדין של הצינור. לאחר מכן, צור את תמיסת ההפרעה על ידי המסת 176.1 מיליגרם AA ב-10 מיליליטר מים טהורים במיוחד. הגדר את הכיול על ידי הנחת מערבל מגנטי על בסיס מעמד טבעת מעבדה בסיסי.

הניחו מעוטרת של 20 מיליליטר על גבי המערבל המגנטי והדקו במקומו באמצעות מהדק בינוני בעל שני שיניים. חבר את הכוס המעוטפת לאמבט מים במחזור כדי לחמם את תמיסת החיץ ל -37 מעלות צלזיוס. הוסף מוט ערבוב מגנטי ו -20 מיליליטר של 100 מילי-מולרי פוספט מלוח, או PBS, לכוס המעוטפת.

לאחר מכן, הנח את מחזיק כיול החיישן על גבי הכוס המעוטפת, והנח מראש כיול ארבעה ערוצים ampחיים יותר למעלה, אבטח אותו במקומו באמצעות זווית ישרה clamp. לאחר מכן, חבר את הקדם-מגבר להתקן מיזוג ורכישת נתונים כדי להקליט נתוני כיול. בדוק את הרגישות של כל חיישן ביולוגי אנזימטי לגלוטמט לפני ההקלטה הניסיונית על ידי הנחת הגשושית לתוך מחזיק הכיול, על גבי מעוטרת, טבילת חלל החישה וחלק מחוט הייחוס של כלוריד הכסף בתמיסת החיץ.

התחל הקלטה חדשה בממשק המחשב באמצעות תוכנת רכישה להורדה בחינם. ולאחר מכן, חבר כל חיישן שנבדק ליציאה במגבר קדם כיול של ארבעה ערוצים. אפשר לחיישנים להגיע לקו בסיס יציב.

התחל להוסיף את הזרקות האנליטים כאשר החיישנים הגיעו לקו בסיס יציב. השתמש בחור במחזיק הכיול כדי להכניס קצה פיפט לתמיסת החיץ. לאחר מכן, השתמש בכלי הערת המפתח המהיר בתוכנת ההקלטה כדי להוסיף הערות כאשר מתבצעת הזרקה.

לאחר מכן, בצע 10 זריקות מיקרוטולריות של גלוטמט על ידי פיפטינג של 40 מיקרוליטר מתמיסת האנליט לתמיסת החיץ. המתן עד שהחיישן יתייצב בין תוספות. לאחר מכן, הוסף שלוש זריקות של תמיסת אנליט לפני הוספת זריקה בודדת מתמיסת AA המפריעה.

רפדו את תא הבדיקה במצעים שנלקחו מהכלוב הביתי של החיה. הסר את האובדורטור החוסם מצינורית ההנחיה והכנס את אלקטרודת סיבי הפחמן או את הגשושית האנזימטית דרך פיר המנחה. חבר את החיישן למערכת ההקלטה.

לאחר מכן ייצב את חיבור החיישן על ידי הברגת חיבור סיכה על תושבת הראש. לאחר מכן, הניחו את החיה בתא הבדיקה. התחל להקליט את הווידאו ואת האות האמפרומטרי הנעול בזמן בתוכנה.

אפשר לחיישן להתייצב בשיווי משקל במוח לפני ניסוי ניסיוני. לאחר מכן, הכניסו זכר גירוי לתא הבדיקה. לאחר ההרכבה הראשונה עם החדרת הפין על ידי הזכר המעורר, המשך להקליט במשך 10 עד 30 דקות נוספות, בהתאם למטרות הניסוי.

לבסוף, לאחר בדיקה התנהגותית, נתק את החיישן הנשי. הסר את שני האוגרים מתא הבדיקה, כמו גם את המצעים, כדי לנקות את החדר באמצעות אתנול 70%. התחל בצפייה והערות הסרטונים, באמצעות תוכנה חינמית להורדה מסחרית, בהילוך איטי כדי לקודד במדויק התנהגויות זמן נעול לאות האמפרומטרי.

הערות התחל לורדוזיס במסגרת כאשר הנקבה יוזמת כיפוף גב של גבה, ומסיטה את זנבה כלפי מעלה. ביאורים סוף לורדוזיס כאשר הנקבה מסיימת תנוחה זו, המתרחשת לעתים קרובות כאשר הנקבה מסתגלת מחדש למיקום אחר בחדר הבדיקה. לאחר מכן, הוסף הערות התחל AI כאשר הנקבה נמצאת בתנוחת הלורדוזיס והזכר מזיז את חוטמו לכיוון האזור האנוגניטלי של הנקבה, שם עלולים להתרחש רחרוח, ליקוק או נדנוד של אזור הפרינאום שלה.

ביאורים סיום AI כאשר הזכר מסיר את חוטמו מקרבה לאזור האנוגניטלי של הנקבה. לאחר מכן, הוסף הערות להר התחלה כאשר הזכר מתקרב ומניח את כפות רגליו הקדמיות על הנקבה בתנוחת הרכבה, ללא קשר לכיוון ניסיון ההרכבה. כמו כן, הערות התחל הפנמה כאשר דחיפה מוצלחת מבטיחה את הגישה של הפין הזכרי הרכוב לנרתיק הנקבה.

במידת הצורך, הוסף הערות לשפיכה, אותה ניתן לציין על ידי תנועת דריכה עם כף הרגל האחורית של הזכר. לבסוף, ציינו את End Intromission ו-End Mount בו-זמנית בפריים כאשר הזכר הסיר את שתי כפות רגליו הקדמיות, ולכן אין לו מגע עם הנקבה. בשל חוסר היכולת התכוף לדמיין את הנסיגה שלו, קודד בו זמנית את שתי ההתנהגויות הללו כדי לאפשר עקביות ואמינות בכל התקפי ההזדווגות.

תחת הכרטיסייה file, בחר את ייצוא פונקציה ובחר את TSV הכרטיסייה כדי לשמור את מדידות המתח כסיומת TSV file. פתח כל קובץ עם תוכנת גיליון אלקטרוני ושמור כ-XLS/XLSX. לבסוף, הוסף ידנית הערות לתחילת התקף ההזדווגות במקביל לתחילת התנהגות הלורדוזיס הכוללת גם התנהגות הר, וגם בתחילת התקף הזדווגות חדש אם הנקבה נשארת בתנוחת הלורדוזיס.

במהלך התקפי הזדווגות, ארעיות דופמינרגית בגרעין המכהן מתעוררת במהלך החדרת הנרתיק, או ההפסקה, על ידי הזכר. דפוס דומה נצפה בבעלי חיים אחרים בכל הנוגע לשחרור גלוטמט. עם ארעיות מהירה המתאימה להפסקות בודדות בליבת הגרעין הגבי האקומבנס במהלך התקף הזדווגות.

לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו, לא כולל ניתוחים סטרוטקטיים מכינים ביום אחד. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לוודא שכל חיישן מתפקד. למרות שסרטון זה מדגים הקלטת בדיקה אחת, ניתן להרחיב גישה זו להקלטה כפולה בו זמנית.

אבל זה מוסיף שכבה של מורכבות שאינה טריוויאלית. סרטון זה מודגם בתנאי תאורה כדי להקל על הראות. עם זאת, אנו מבצעים את הניסויים ההתנהגותיים שלנו בתנאי חושך, ופרמטר זה יכול להשתנות בהתאם לצרכים הניסיוניים הספציפיים.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ניתוח היסטולוגי עוקב של פרוסות מוח על מנת לזהות ולאשר מיקום מדויק של חיישן. בנוסף, ניתן לבצע ניתוח נתונים נוסף, תוך שימוש בנתוני ההתנהגות המקודדים, ביחס לכל הפרמטרים המעניינים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מדעי המוח לחקור שחרור נוירוטרנסמיטורים, כולל נוירוטרנסמיטורים לא אלקטרו-אקטיביים כמו גלוטמט כמעט בזמן אמת בבעלי חיים שמתנהגים ערים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לכייל בדיקות גלוטמטרגיות, בדיקות השתלה, להריץ ניסוי התנהגותי המודד שינויים בשחרור נוירוטרנסמיטורים למרכיבי התנהגות שונים, ולקודד נתונים אלה לניתוח שלאחר מכן. אל תשכח שכאשר אתה עובד עם בעלי חיים יש להיות רגיש לנוחיותם ולרווחתם הכללית כדי להבטיח את התוצאות הטובות ביותר שלך ושל בעלי החיים.