הכנת הדוגמא וניתוח של נתונים ביטוי גנים מבוססת RNASeq דג זברה

המטרה הכוללת של ניתוח RNASeq זה בדגימות של זחלי דג זבברה היא לזהות פרופילים של ביטוי גנים עבור עוברים וזחלים של דג זבברה ולהפיק מסקנות השוואתיות כמותיות לגבי שינויים בביטוי גנים בין דגימות. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובה לשאלות מפתח בכל תחום שבו עוברים או זחלים של דג זבברה הם בעלי ערך מידעי, כגון כיצד דיכוי של גן מטרה אחד מוביל לשינויים בביטוי גנים או לשיבוש של מסלולים מסוימים ביחס לתנאים אחרים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שדגי זבברה מאפשרים ייצור של מספר רב של בעלי חיים, וניתן להשיג בקלות נתוני טרנסקריפטום של בעל חיים שלם.

בנוסף, ניתן לבצע בידולי תאי סוגים ספציפיים בקלות באמצעות מיון של בעלי חיים טרנסגניים. את הפרוצדורות יעמידו Lain Hostelley, סטודנט לתואר מתקדם, ו-Jessica Nesmith, פוסט-דוקטורנטית מהמעבדה שלי. ראשית, גדלו עוברים עד לגיל שלושה חודשים, המהווה את שלב הבשלות הרבייתית.

הפרידו שני דגים זכרים בוגרים ושלושה דגים נקבות מהזן הרצוי למכלי הזדווגות מחולקים המכילים מי מערכת טריים, בערב שלפני איסוף העובריים. למחרת בבוקר, לאחר הדלקת האורות, הסירו את המחיצה ואפשרו לדגים להזדווג באופן טבעי עד להופעת עובריים בתחתית המכל. אספו את העובריים במרווחי זמן של 30 דקות לצלחוני פטרי נפרדים המכילים תווך לעובריים, עד להשגת המספר הרצוי.

כדי לקבוע את שלב ההתפתחות של העוברים, תרבתו אותם בקבוצות של 50 עד 75 לכל צלחת פטרי בקוטר 10 סנטימטר, כדי לעודד תזמון התפתחותי עקבי של כל העוברים. לאחר מכן, שמרו את הצלחות בטמפרטורה של 28.5 degrees Celsius. מדדו את גיל העובר באמצעות מספר הסומיטים לאחר תחילת הסגמנטציה ועד לכ-24 שעות לאחר ההפריה (HPF), והפרידו את העוברים בהתאם לגיל ההתפתחותי.

לאחר קטילת העוברים בשלב הרצוי בהתאם לפרוטוקול הכתוב, העבירו קבוצה של 20 עוברים לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה מסומנת בנפח 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, הסירו כל עודף של מצע גידול עוברים משפופרת המיקרו-צנטריפוגה. הוסיפו לשפופרת 200 מיקרוליטר של ריאגנט ליזיס.

השתמשו בעלי ושלשול כדי להומוגניזציה מכנית של העוברים. לאחר מכן, הוסיפו 800 µL נוספים של ריאגנט ליזיס כדי להגיע לנפח כולל של 1 mL. כדי להפיק את ה-RNA, הוסיפו ריאגנט ליזיס לדגימה שנאספה והדגירו אותה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.

הוסיפו 0.2 milliliters של כלורופורם עבור כל 1 milliliter של ריאגנט ליזיס שנעשה בו שימוש, והפכו את המבחנות ידנית במשך 15 שניות. לאחר דגירה של הדגימות בטמפרטורת החדר למשך שתי עד שלוש דקות, סובבו את הדגימות בצנטריפוגה ב-12,000 ×g וב-4 degrees Celsius למשך 15 דקות. העבירו את הפאזה המימית המופרדת למבחנה נקייה והוסיפו 0.5 milliliters של איזופרופנול עבור כל 1 milliliter של ריאגנט ליזיס שנעשה בו שימוש.

לאחר דגירה של המבחנות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות, סבב את הדגימות בצנטריפוגה למשך 10 דקות. לאחר מכן, הוסף 75% ethanol ל-RNA וסבב את המבחנות בצנטריפוגה ב-7,500 ×g ובטמפרטורה של 4 °C למשך 5 דקות. הסר את supernatant לחלוטין ואפשר לדגימה להתייבש באוויר בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, השביה מחדש את ה-RNA ב-15 עד 30 µL של מים שעובדו ב-DEPC. כדי לטהר RNA באיכות גבוהה לאחר הוצאת המשקע ושטיפת הדגימה בהתאם לפרוטוקול הכתוב, השתמש בספקטרופוטומטר בליעת אור כדי לבחון את ריכוזו וטוהרו של ה-RNA שהופק. ודא שערך היחס 260/230 הוא כ-2.0 לפני שליחת דגימות ה-RNA לספק או למעבדה לצורך RNASeq וניתוח שינויים בביטוי גנים המבוסס על כימות קריאות ריצוף.

כדי להשוות תנאי ניסויי בודד מול ביקורת, פתחו את הנתונים של הגנים בעלי הביטוי הדיפרנציאלי בתוכנה לניהול גיליונות נתונים. בחרו בחץ התפריט הנפתח לצד כפתור המיון, ובחרו במיון מותאם אישית בתוך הגיליון. בחלון שייפתח, סמנו את התיבה תחת עמודה ובחרו למיין לפי עמודת ה-LFC.

בעמודת המיון (sort), ודאו כי הערכים (values) נבחרים. בעמודת הסדר (order), בחרו מיון מהגדול לקטן ולחצו על אישור. כדי לקבוע גנים המובעים באופן דיפרנציאלי שנמצאו בשני תנאים ניסיוניים, בגיליון הנתונים של הניסוי לעומת הביקורת, בחרו את התא הראשון בעמודה ריקה.

לאחר מכן, הקלידו את המשוואה הבאה לתוך התא. לחצו על Enter או Return כדי להריץ את המשוואה. בחרו את התא המכיל את המשוואה ולחצו על הריבוע בפינה הימנית התחתונה של התא.

החזיקו את לחצן העכבר לחוץ וגררו את האזור שנבחר עד למטה לאורך העמודה, עד לבחירת ה-feature ID האחרון, כדי להעתיק את המשוואה לכל תא בעמודה. בחרו שוב במיון מותאם אישית (custom sort) והוסיפו רמה שנייה של מיון על ידי לחיצה על סמל הפלוס בפינה השמאלית התחתוית. ברמה הראשונה, תחת "מיון לפי" (sort by) ובעמודה המתאימה, בחרו ב-duplicate.

תחת sort on, בחרו values, ותחת order, בחרו Z to A. ברמה השנייה, ב-then by, תחת column, בחרו LFC. תחת sort on, בחרו values, ותחת order, בחרו largest to smallest, ולחצו על okay. כדי להסיר סוגריים מעמודת סמלי הגנים לפני ההמשך, בחרו את העמודה כולה המכילה את סמלי הגנים.

בחרו בעריכה (Edit), ולאחר מכן בהחלפה (Replace) בתפריט הקבצים הנפתח. הקלידו סוגריים פותחים, כוכבית, וסוגריים סוגרים בשורת החיפוש (Find what) של חלון ההחלפה, והשאירו את שורת ההחלפה ב- (Replace with) ריקה. בחרו בהחלף הכל (Replace all) כדי להסיר את כל המופעים של הסוגריים.

כדי לקבוע מסלולים מועשרים, העתיקו את סמלי הגנים הרצויים ללוח השבקי. עברו ל-ConsensusPathDB, ולאחר מכן בחרו ב-gene set analysis בסרגל הצד השמאלי של דף האינטרנט, ולאחר מכן ב-over-representation analysis. בתיבת paste a list of gene and protein identifiers, הדביקו את רשימת הגנים.

בחרו את סמל הגן (gene symbol) בתיבת סוג מזהה הגן/חלבון ולחצו על proceed. תחת סעיף הקבוצות המבוססות על מסלולים (pathway-based sets), סמנו את התיבה לצד pathways as defined by pathway databases. לחצו על find enriched sets כדי לקבל את רשימת המסלולים המכילים גנים המופיעים ברשימת הקלט.

בחר את כל המסלולים המועשרים להצגה ברשת מסלולים על ידי סימון כל תיבה לצד שמות המסלולים, או על ידי לחיצה על "all" (הכל) תחת "select" (בחר) בכותרת העמודה מעל תיבות הבחירה. לאחר מכן, בחר "visualize selected sets" (הצג קבוצות נבחרות). התאם את מסנני החפיפה היחסית והמועמדים המשותפים על ידי בחירה באחת התיבות במרכז החלק העליון של הדף והזנת האחוז הרצוי, החפיפה היחסית או מספר המועמדים המשותפים, ולאחר מכן בחר "apply" (החל).

כדי לקבוע את האונטולוגיות הגניות המועשרות, העתיקו את סמלי הגנים של הקבוצה הרלוונטית ללוח השבחה. עברו לכלי ניתוח העשרה של GO (GO Enrichment analysis tool) בקונסורציום האונטולוגיה הגנטית (Gene Ontology Consortium). בצד שמאל של הדף, תחת "your gene IDs here", הדביקו את רשימת סמלי הגנים בתוך התיבה.

מתחת לתיבת מזהי הגנים (gene IDs), בחרו במונח GO, תהליך ביולוגי (biological process). לאחר מכן, בחרו ב-danio rerio מתחת לתיבת מונחי ה-GO ולחצו על submit. בצעו QRT PCR והשוו ל-RNASeq, בהתאם לפרוטוקול הכתוב.

ריצוף של RNA שהופק מזחלים שהוזרקו מורפולינוס נגד alms1 או bbs1 חשף את הגנים שהיו במצב של ביטוי יתר (upregulated) או ביטוי מופחת (downregulated) באופן ייחודי במודלים של תסמונת אלסטרם ו-BBS, כמו גם את הגנים ששנו באופן משמעותי בשני המודלים. כדי להבהיר בצורה מדויקת יותר את הפרופיל המולקולרי של מודל אלסטרם, זוהו המסלולים והאונטולוגיות של הגנים (gene ontologies) שהיו מועשרים בגנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי. כפי שמוצג כאן, סה"כ 31 מסלולים היו במצב של ביטוי יתר.

מלבד הקבוצה הרחבה של מטבוליזם, המסלולים שהושפעו בצורה המשמעותית ביותר היו מערכת החיסון המולדת והנרכשת, עם 32 ו-20 גנים בהתאמה. כמו כן, נמצא הגבהרה של אירועי איתות של קולטן תאי B במורד המסלול. מספר מסלולי איתות היו מוגברים גם הם בקרב הגנים שהביטוי שלהם עלה, באופן העולה בקנה אחד עם הקשר של תסמונת אלסטרום (Alstrom Syndrome) עם תפקוד לקוי של השערה ראשונית (primary cilium).

בנוסף, שלושה מסלולים הקשורים להפרשת אינסולין נמצאו במצב של ביטוי מוגבר (upregulated): חומצות שומן הקשורות ל-GPR40, חומצות שומן חופשיות ואצטילכולין. לבסוף, שישה מונחי GO נמצאו מועשרים בקרב הגנים בעלי הביטוי המוגבר במודל Alstrom, כולל בידול תאי דם אדומים, הומאוסטזיס של תאי דם אדומים, הומאוסטזיס של תאים מיאלואידיים ותהליכים הומאוסטטיים. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע את ניתוח המסלולים ומונחי ה-GO בפחות משעה.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי בחירת פרמטרי המסלול וערכי הסף היא השיקול החשוב ביותר בפירוש תוצאות של השוואות ביטוי ב-RNASeq. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן להשתמש בשיטות נוספות, כגון יישום עם קווי מוטנטים ואנליזת טרנסקריפטום של סוגי תאים בודדים, כדי לענות על שאלות נוספות, כגון פרופיל טרנסקריפטומי של סוגי תאים ושינויים בביטוי גנים תחת בקרה של גנים ספציפיים. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו משתמשים בנתוני טרנסקריפטומיקה של דגי זברא (zebrafish) שהופקו ב-RNASeq לצורך זיהוי שינויים משמעותיים בביטוי גנים בין דגימות ניסיוניות.