היישום של לייזר מיקרו-הקרנה בחינת יחיד ותיקון כפול Strand Break בתאים בתרבית

המטרה הכוללת של הליך זה היא לגרום נזק ל-DNA באזור תת-גרעיני של תא באמצעות לייזר מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח של תיקון DNA כגון כיצד חלבונים מגויסים ונשמרים באתרים של נזק ל-DNA. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת הדמיה בזמן אמת של החלבון המעניין כך שניתן לבנות את פרופיל הגיוס והשימור.

התחל הליך זה על ידי הצבת שקופית תא המכילה את התאים המעניינים בחממה עליונה שנשמרה על 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. רשום שדות תמונה באמצעות שלב מיקרוסקופ אוטומטי מקודד. בחר מאפיין מוכר של כלי התרבות כמו המחסום בין בארות.

אסוף תמונה והקלט את מיקום ה-X-Y. זה יאפשר יישור ורישום של מיקומי ה-X-Y של שדות נבחרים לאחר הכנת הדגימה. לאחר השלמת רישום התמונה, בחר שדה למיקרו-הקרנה ומקד את הדגימה.

עבור תאים המבטאים חלבונים בעלי תווית פלואורסצנטית, בחר את מישור המוקד עם החתך הגרעיני המקסימלי בערוץ הפלואורסצנטי המעניין. התמקדות בחתך המקסימלי של הגרעין היא קריטית מכיוון שהיא מבטיחה שנקודת המוקד מרוכזת בגרעין לניטור גיוס החלבון המעניין לאתר הנזק המושרה. בחר תכונה ברורה בתוך הגרעין כגון גרעין והזיז את מישור המוקד למעלה ולמטה תוך התבוננות בשינוי זה במראה.

מישור המוקד האמיתי יהיה בתוך המעבר מאור לחושך. כדי למקד את הדגימה, בחר במישור המוקד שבו לתכונה שנבחרה יש את הניגודיות החדה ביותר. השלב הבא הוא רישום המיקום של תחום העניין.

צור אזור עניין של שלושה על שלושה פיקסלים ריבועיים, או ROI, בתוך תוכנת המיקרוסקופ. הנח את החזר ה-ROI הזה על גרעין התא שייפגע והגדר את החזר ה-ROI הזה כ-ROI הפגום. אסוף תמונה לפני הנזק כולל מיקום החזר ה-ROI של הנזק.

רכוש תמונה המכילה שדה בהיר בתעלת התפרחת עבור החלבון המעניין. התאים מוכנים כעת למיקרו-הקרנת לייזר. לצורך הדגמה זו, ייעשה שימוש בלייזר 405 ננומטר בהספק של 100%.

מינון הלייזר של 405 ננומטר נשלט על ידי אפנון קצב הסריקה וביצוע סריקה אחת של החזר ה-ROI של הנזק שנבחר. בניסוי זה, השתמש בשמונה ו-0.5 פריימים לשנייה למיקרו-הקרנה ב-405 ננומטר. בחירת עוצמת הלייזר המתאימה לפגיעה בתאים היא קריטית להפרדת מסלולי תיקון DNA שונים.

בצע רכישת תמונות דולג זמן של תעלות שדה בהיר ופרחת לאחר נזק. התאם את משך ותדירות ה-time-lapse כדי לייעל את איסוף הנתונים, וללכוד באופן אידיאלי את הצטברות החלבון הפלואורסצנטי בנזק, החזר ROI ודיסוציאציה שלו לאורך זמן הניסוי. לאחר השלמת מהלך הזמן, בחר שדה חדש של תאים לנזק והמשך במיקרו-הקרנה והדמיית זמן-lapse עד שתגיע למספר הרצוי של תאים פגומים.

מומלץ 10 עד 25 תאים לכל תנאי שנבחר. כדי להגדיל את מספר התאים הכולל לניתוח אימונופלואורסצנטי, פגע בשדות נוספים בתוך כלי התרבית כדי ליצור מהלך זמן רב-שדות של התגובה שלאחר הנזק. רשום את מיקום ה-X-Y של כל שדה ואת השעה שבה התרחש הנזק.

ניתן לתקן תאים מיד לאחר הנזק או לאפשר להם לתקן לפרקי זמן נבחרים לפני הקיבוע. כדי להתחיל בניתוח זה, פתח את התמונות שנרכשו באפליקציית ניתוח תמונה כגון NIS-Elements. עבור כל תא למדידה, צור תחילה החזר ROI ייחוס המייצג את הגרעין.

השתמש באלגוריתם סף על אות הפלורסנט המכיל את הפיקסלים המרכיבים את הגרעין, ולאחר מכן המר אזור זה להחזר ROI. לאחר מכן, צור החזר ROI של שישה על שישה פיקסלים והנח אותו מעל החזר ה-ROI של הנזק. החזר ROI גדול יותר זה הוא כעת החזר ה-ROI של הנזק לניתוח.

עבור כל תא שיש למדוד, רשום את עוצמת התפרחת הממוצעת עבור החזר ה-ROI של הייחוס והנזק. עבור כל מסגרת של מהלך הזמן, התאם את החזר ה-ROI של הייחוס כדי להבטיח שהאזור הגרעיני מכוסה במדויק על ידי ה-ROI והתאם את החזר ה-ROI של הנזק כדי להבטיח שהנקודה הפגועה מכוסה. רשום את עוצמת הקרינה הממוצעת של האות הפלואורסצנטי בתוך כל החזר ROI עבור כל מסגרת של מהלך הזמן.

עבור כל תא, נרמל את עוצמת הקרינה הממוצעת של החזר ה-ROI לזה של החזר ה-ROI הייחוס המתאים לו בכל מסגרת של זמן-lapse. כאן, עוצמת הקרינה הגרעינית הממוצעת משמשת כ-ROI הייחוס והנורמליזציה מתבצעת על ידי הפחתת עוצמת הקרינה הממוצעת של ROI הייחוס מעוצמת הקרינה של ה-ROI של הנזק הממוצע. חזור על הנורמליזציה עבור כל התאים הפגועים וכן עבור לפחות שני תאי בקרה שלא נפגעו.

לבסוף, גרף ערכי עוצמה מנורמלים לאורך זמן כדי להראות שינויים בדינמיקת הגיוס כפונקציה של טיפול ניסיוני. תאים המבטאים ביציבות XRCC1-GFP הוקרנו וצולמו לפני ואחרי השראת נזק. גיוס XRCC1-GFP לנזק החזר ההשקעה נצפה ונמדדה הדינמיקה של הגיוס.

היווצרות שברים דו-גדיליים נבדקה באמצעות שני סמנים. עבור שני הסמנים, גירוי שני שניות במינון נמוך ב-355 ננומטר לא מעורר תגובה לאחר חמש דקות ו-20 דקות ותגובה חלשה ומשתנה ב-10 דקות לאחר ההקרנה. מיקרו-הקרנה במינון גבוה של 10 שניות ב-355 ננומטר גורמת לאות פלואורסצנטי מוגבר בתוך החזר ה-ROI של הנזק בחמש, 10 ו-20 דקות לאחר ההקרנה, אשר מופחת לאחר 40 דקות.

תוצאות אלו מצביעות על כך שסמני השבירה הדו-גדיליים של ה-DNA מגיבים במיקרו-הקרנה של 355 ננומטר באופן תלוי מינון. לעומת זאת, גירוי לייזר של 405 ננומטר הביא להצטברות משמעותית של שני הסמנים בתוך החזר ה-ROI של הנזק ללא קשר למינון המיושם. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כארבע שעות למשך 10 תאים אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ביצוע טכניקה זו, חשוב להתאים את אורך גל הלייזר ואת הכוח המופעל לתהליך התיקון המנוטר. לאחר הליך זה, ניתן לבצע אימונופלואורסצנציה כדי לענות על שאלות לגבי גיוס חלבונים נוספים או שינויים במצב הזרחן או שינויים אחרים לאחר התרגום. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לחקור גיוס דינמי של חלבוני תיקון DNA ולקבוע טוב יותר כיצד תחומי חלבון ומוטציות משפיעים על הזיהוי והתגובה לנזק ל-DNA.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש במיקרוסקופ קונפוקלי הסורק בלייזר כדי לגרום נזק ל-DNA ולפקח על גיוס חלבוני תיקון DNA. אל תשכח שעבודה עם לייזרים וכימיקלים כמו פורמלדהיד עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון ציוד מגן אישי בעת ביצוע הליך זה.