לכימות מיקרואורגניזמים בריכוזים נמוכים באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי הולוגרפי (סוג התושבות שלהם. מופיעים)

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא להדגים זיהוי של מיקרואורגניזמים ברמות נמוכות מאוד באמצעות מיקרוסקופיה הולוגרפית דיגיטלית. טכניקה זו רגישה יותר ממיקרוסקופ אור מסורתי ומספקת מידע בזמן אמת על התנהגויות חיידקים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומים הביולוגיים והקוסמולוגיים כמו חיפוש אורגניזמים פתוגניים במים או חיים בתוך מערכת השמש שלנו על ירחים קפואים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא ש- DHM היא טכניקה נפחית מה שאומר שאנו יכולים ללכוד מידע תלת מימדי על הדגימה שלנו באופן מיידי ללא כל צורך במיקוד פיזי מחדש. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על אבחון זיהומים בזרם הדם או בנוזל השדרה, בגלל היכולת לזהות ריכוזי חיידקים נמוכים. כדי להתחיל בהליך זה, ביום הניסוי, בצע קריאה ספקטרופוטומטרית של תרבית האב של החיידקים שצפויה להיות בטווח של 0.6 עד 0.7.

לאחר מכן קחו דגימה של תרבית האב וספרו את התאים ישירות באמצעות תא ספירה של פטרוף-האוסר כדי לספור תאים חיים ומתים כאחד. העבירו דגימה של 10 מיקרוליטר מהתרבות הלא מדוללת עם מיקרופיפטה לחדר. דמיין אותו תחת מיקרוסקופ אובייקטיבי יבש גבוה באמצעות ניגודיות פאזה.

לאחר מכן, ספרו את החיידקים ב-20 ריבועים לפחות וערכו ממוצע שלהם. חשב את הריכוז כממוצע של 20 ריבועים כפול גורם הדילול. כדי לספור רק תאים חיים, בצע דילול סדרתי של כל אחת מדגימות החיידקים שנבחרו בתמיסת מלח סטרילית של 0.9% על ידי העברת 20 מיקרוליטר מתמיסת החיידקים לבאר אחרת ודילול שלה ב-180 מיקרוליטר מי מלח.

חזור על ההליך עד שהריכוז הנמוך ביותר הוא כ-10 לשלושת התאים למיליליטר. לאחר מכן, קח 100 מיקרוליטר מהדגימות משני דילולים לפחות וצלח אותן על לוחות המדיה המוצקה המתאימים. מורחים אותם בעזרת מפזר סטרילי ומבצעים לפחות שלושה שכפולים של כל דילול.

לאחר מכן, דגרו אותם בטמפרטורה מתאימה למשך הלילה או עד שהמושבות גדלות. לאחר מכן ספרו את המושבות. חשב את היחידות היוצרות מושבה וממוצע אותן על פני השכפולים.

בהליך זה, בצע דילולים סדרתיים של תרבית המאסטר עבור DHM וספירת CFU לאחר DHM על צלחות מדיה של מרק ליזוגני. לדלל את החיידקים ל-25 מיליליטר של תווך מינימלי שיעודד תנועתיות אך יעכב את חלוקת התאים כך שריכוז התאים לא ישתנה באופן ניכר במהלך הניסוי. כדי להקליט סרטוני DHM, באמצעות מזרק סטרילי, צייר כ -10 מיליליטר מדילול העניין.

לאחר מכן חבר את המזרק לתא הדגימה של DHM באמצעות אביזרים וצינורות סטריליים. הזרם את הדגימה מהמזרק דרך תא הדגימה ברציפות באמצעות משאבת מזרק. כאשר הדגימה זורמת דרך תא הדגימה, רכוש הולוגרמות ברצף בקצב פריימים מתאים.

אפשר מספיק זמן לכל 10 מיליליטר הדגימה לזרום דרך ה-DHM. כדי להבטיח שחיידקים לא גדלים או מתים במהלך הניסויים, חסנו את לוחות המדיה המועשרים ב-100 מיקרוליטר של המדיה המושקעת לאחר לכידת התמונה של DHM על ידי פיזורה עם מפזר סטרילי. לאחר מכן דגרו אותם בטמפרטורה המתאימה למשך 24 שעות לפני ספירת המושבות.

ספירת תאים מדויקת חיונית לקביעת גבולות הזיהוי מבחינה כמותית. חשוב לבצע את כל הדילולים בזהירות רבה באמצעות מיקרופיפטות מכוילות ולאשר את כל הספירות על ידי צפיפות אופטית, ציפוי וספירה ישירה בתא פטרוף-האוסר. כדי לנתח את הנתונים לנוכחות חיידקים בסרטוני ההולוגרמה שנרכשו, בצע סינון חסר בינוני על ידי המרת התמונות תחילה לפורמט 32 סיביות.

לאחר מכן חשב את ערך הפיקסלים החציוני. לבסוף, הפחיתו את הערך החציוני הזה מכל פיקסל מתאים כדי לבטל חפצים נייחים בהולוגרמה. לאחר מכן, ספור את מספר טבעות השטח הגלויות ותאי המיקוד באופן ידני.

כל סדרת הולוגרמות תלווה בקובץ חותמת זמן. השתמש בקובץ חותמת הזמן כדי לחשב את הכמות הכוללת של הדגימה שנשאבה בזמן צילום התמונה. לאחר מכן, חשב את צפיפות התאים על ידי חלוקת המספר הכולל של התאים שזוהו בנפח הכולל של הדגימה המצולמת.

ממוצע של חמש עד 10 פריימים לסטטיסטיקה מדויקת. תרשים זה מציג את התאים החזויים לכל שדה ראייה בהתבסס על נפח דגימה של 365 מיקרומטר על 365 מיקרומטר על מילימטר אחד. עבור ריכוזים שבהם מספר התאים לשדה ראייה יורד מתחת לאחד, נדרשות תמונות מרובות על מנת להשיג זיהוי.

זהו רצף הולוגרמה DHM של תרבית Serratia marcescens ב-2,100 תאים למיליליטר הנמדד על ידי ספירת צלחות. הרצף מראה תא אחד בערך כל שנייה עד שתיים, וזה מתאים מצוין לתחזית. וזהו רצף הולוגרמה נוסף של DHM של תרבית Serratia marcescens ב-620 תאים למיליליטר שנמדד על ידי ספירת צלחות.

רצף זה מציג תא אחד בערך כל שש עד שבע שניות. בעת שימוש במיקרוסקופיה הולוגרפית דיגיטלית להדמיית תאים, זכור להשתמש בטכניקות עיקור מסננים להכנת כל הפתרונות. זה ימנע הכנסת חומר חלקיקי למכשיר.

בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להכין תרביות תאים בריאות ולהצטייד במדיום גידול נוסף, צלחות ומדיום תנועתיות בהישג יד. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו צביעה פלואורסצנטית על מנת לענות על שאלות נוספות כגון אחוז התאים החיים לעומת המתים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום המיקרוביולוגיה לחקור תנועתיות תלת מימדית בתאים מתורבתים ובדגימות סביבתיות.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לספור חיידקים באמצעות מיקרוסקופיה הולוגרפית ולאמת את התוצאות באמצעות טכניקות ספירה אחרות. אל תשכח שעבודה עם תרביות חיידקים עלולה להיות מסוכנת ביותר. תמיד יש לנקוט באמצעי זהירות מתאימים בעת גידול וטיפול באורגניזמים חיים.