דיגיטלי Inline הולוגרפי מיקרוסקופית (DIHM) של נושאים בחולשת פיזור
February 8th, 2014
המקומות תלת ממדיים של אובייקטים בחולשה-פיזור יכולים להיות מזוהים באופן ייחודי באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי מוטבע הולוגרפית (DIHM), הכולל שינוי קל במיקרוסקופ רגיל. התוכנה שלנו משתמשת היוריסטי הדמיה פשוטה יחד עם ריילי-זומרפלד גב ההתפשטות להניב את המיקום ואת הגיאומטריה של אובייקט שלב מיקרוסקופי תלת ממדים.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לשחזר את המיקום התלת-ממדי בגיאומטריה של שרשרת של תאי חיידקים שוחים. זה מושג על ידי גידול תאי חיידקים תחילה לריכוז הנכון כדי לספק דגימה מתאימה להדמיה. כשלב שני, מקור אור ה-LED מוגדר ומיושר, ומאפשר לקבל תמונות הולוגרפיות.
לאחר מכן, נעשה שימוש בתוכנת השחזור על מנת להשיג את הקואורדינטות התלת-ממדיות של שרשרת תאי חיידקים. התוצאות מראות את היכולת לשחזר את המיקום והתצורה התלת מימדית של תאי החיידקים על סמך הדמיה הולוגרפית. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו מיקרוסקופיה קונפוקלית, הוא שהדמיה נפחית ללא תוויות אפשרית בקצבי פריימים גבוהים.
כדי להתחיל לחסן, 10 מיליליטר של מדיה KTY עם גבישי קרח ממלאי קפוא של סטרפטוקוקוס זן V 4 0 5 1 1 97 דוגרים את תרבית המתנע בשייקר סיבובי למשך הלילה ב-35 מעלות צלזיוס ו-150 סל"ד. לאחר שהוא גדל, חסנו 10 מיליליטר של מדיום KTY טרי עם 500 מיקרוליטר מתרבית המתנע הרוויה. דגירה במשך 3.5 שעות בטמפרטורה של 35 מעלות צלזיוס ו-150 סל"ד עד שהתאים מגיעים לצפיפות אופטית באורך גל של 600 ננומטר של 0.8 עד 1.0.
זה מייצג בערך פי חמישה עד 10 עד שמינית תאים למיליליטר. לאחר מכן יש לדלל את התאים ב-1 עד 400 במדיה טרייה כדי לקבל את הריכוז הסופי של כמיליון תאים למיליליטר. לאחר מכן, מלאו מזרק בג'לי נפט והכינו טבעת שומן בגובה מילימטר אחד על שקופית מיקרוסקופ.
לאחר מכן הניחו טיפה של תמיסת הדגימה במרכז. הנח בעדינות זכוכית כיסוי מעל הדגימה ולחץ קלות על הזכוכית כדי לאטום את הקצוות, וודא שהנוזל נמצא במגע הן עם השקופית והן עם זכוכית הכיסוי. תא הדגימה המתקבל צריך להגיע לעומק של 100 עד 200 מיקרומטר.
סובב עדשת טבילה בשמן פי 60 למקומה והוסף טיפת שמן. לאחר מכן הנח את תא הדגימה על המיקרוסקופ stage כשזכוכית הכיסוי פונה כלפי מטה. ודא שלא נוצרות בועות אוויר בין החלקת כיסוי הזכוכית לעדשה.
התמקד במשטח התחתון של תא הדגימה ולאחר מכן מקד את הקבל. לאחר מכן, כבה את התאורה הסטנדרטית והנח את ראש ה-LED מאחורי צמצם הקבל של המיקרוסקופ. ודא שהמעבה מוגדר למצב שדה בהיר והגדר את ספק הכוח LED לתפוקה מקסימלית.
לאחר מכן סגור את צמצם המעבה במלואו ודחף את ה-LED בתושבת שלו עד שהתאורה תתרכז על צמצם עדשת האובייקטיבי. הפעל את המחשב ולאחר מכן הפנה את נתיב האור ליציאת המצלמה של המיקרוסקופ. התאם את קצב הפריימים ל-30 פריימים לשנייה ואת גודל התמונה לחמש 12 על חמש 12 פיקסלים בתוכנת רכישת התמונות.
בדקו היסטוגרמה של עוצמת התמונה כדי לוודא שאף חלק בתמונה אינו רווי או חשוף פחות. זמן החשיפה למסגרת צריך להיות קצר ככל האפשר תוך שמירה על ניגודיות טובה. אם תאים נאספים קרוב לממשק, מקדו מחדש את המיקרוסקופ כך שתאי החיידקים יהיו מעט לא ממוקדים.
התאים צריכים לשכב בסביבות 10 עד 30 מיקרון ממישור המוקד לשחזור אופטימלי. לאחר המיקוד מחדש, רכוש סדרה של מסגרות וידאו ושמור כקובץ VI לא דחוס. לאחר מכן הפעל את תוכנת DIHM הזמינה להורדה בחינם כדי להמיר מסגרת וידאו לערימת תמונות ממוקדת מחדש מבחינה מספרית.
מסגרות לדוגמה מסופקות עם התוכנה כדי להתחיל בשחזור. הזן את מסגרת העניין ואת הרקע שלה כקבצי תמונה נפרדים לתיבות. תמונת הרקע מייצגת בצורה הוגנת את הרקע של הסרטון בהיעדר הולוגרמה ותשמש לדיכוי כל רעש דפוס קבוע שעלול להפריע ללוקליזציה ולניתוח ההולוגרפי.
לאחר מכן, הזן פרמטרים של מחסנית פלט בתיבות ההגדרות הכלליות. תחילה, הזן את המיקום הצירי של המסגרת הראשונה במיקוד ההתחלה. לאחר מכן הזן את מספר הפרוסות בערימה המשוחזרת במספר צעדים, ולבסוף, הזן את המרחק בפועל בין כל פרוסה בערימה בגודל צעד.
הגדר את גודל הצעד כך שיהיה זהה למרווח הפיקסלים הרוחבי כדי לבנות מחדש אובייקטים עם הפרופורציות הנכונות באמצעות הנתונים לדוגמה. ערך זה צריך להיות 0.233 מיקרומטר. לאחר מכן, הזן את התאורה, אורך הגל ומקדם השבירה הבינוני של המצלמה ואת תדירות הדגימה לרוחב.
בתיבה פיקסל למיקרון, ניתן למצוא את תדירות הדגימה הרוחבית של המצלמה על ידי חלוקת הגדלת עדשת המטרה בגודל הפיקסלים של חיישן המצלמה. באמצעות נתוני הדוגמה, המספר יהיה 60 x חלקי 14 מיקרומטר שווה ל-4.29 פיקסלים למיקרון. לאחר מכן, אם מרכז האובייקט כהה בהולוגרמה, לחץ על לחצן מעבר הצבע Z היפוך.
פעולה זו תחיל מסנן המחלץ עצמים מתחת למישור המוקד בדגימה המקורית. לאחר מכן הפעל את מסנן מעבר הלהקה, האחראי על דיכוי תרומת הפיקסלים הרועשת לתמונה. הוא מוחל על כל פרוסת תמונה מיד לאחר היצירה.
לאחר מכן, בדוק את מתג פלט הביניים במצב כבוי וודא שהם פועלים. כאשר מתגים אלה מופעלים, זה יגרום ליצירת שני סרטונים. הפלט הראשון הוא מחסנית המיקוד מחדש עם שם קובץ המסתיים במחסנית V.המחסנית השנייה היא פעולת השיפוע בפועל עם שם קובץ המסתיים בשיפוע A VI.באופן אידיאלי, מחסנית שנייה זו תכיל את מושא העניין המודגש כאובייקט בהיר על רקע כהה.
לאחר הגדרת כל הפרמטרים, לחץ על הפעלה בחלון הראשי כדי לבצע את הפקודות. המסגרת שנבחרה תופיע בתיבה הראשית של התוכנה. לאחר מכן השתמש בכלי הזכוכית המגדלת שנמצא בסרגל הכלים משמאל לתמונה כדי להגדיל ולהקטין את התצוגה.
השתמש בכלי המלבן כדי לבחור אזור עניין או החזר ROI וללכוד כמה שיותר שולי הולוגרמות בתוך המלבן כדי למטב את השחזור. לבסוף, לחץ על כפתור התהליך כדי ליצור את שתי ערימות התמונות הנפרדות. בדוק את הערימות המתקבלות באמצעות תמונה J הזמינה באתר זה.
אם ניתן לראות בבירור את האובייקט המעניין בערימת תמונות מעבר הצבע, המשך לקטע העיבוד כדי לחלץ את קואורדינטות האובייקט. כדי להתחיל בעיבוד, לחץ על לחצן חילוץ התכונות כדי להפעיל את פונקציית מיקום הקואורדינטות X, Y, Z. לאחר מכן הזן נתיב וסיומת לקובץ קואורדינטות הפלט, בחר סגנון קרן POV בתיבה סגנון קואורדינטות הפלט.
זה גורם לתוכנית לכתוב קובץ אובייקט שניתן להמחיש באמצעות חבילת התוכנה החינמית למעקב אחר קרני POV, אותה ניתן להשיג מאתר זה, לעבד מחדש את התמונות כדי לחלץ את קואורדינטות האובייקטים. התוכנית תספק סדרה של קואורדינטות X, Y, Z בהחזר ה-ROI שנבחר שנכתב לשם הקובץ בתיבת כבלי הפלט. חילוץ קואורדינטות אובייקטים לוקח הרבה יותר זמן מיצירת ערימות.
ודא שקובץ ה-POV ray לדוגמה שסופק עם קוד השחזור קיים באותה תיקיה כמו קובץ קואורדינטות הפלט. ערוך את קובץ הנקודה pov לדוגמה והחלף את שם הקובץ בפסיקים הפוכים בשורה. כלול את הקובץ שלי NC עם שם קובץ הנתונים שנוצר על ידי קוד השחזור.
לאחר מכן התאם אישית את מיקום המצלמה, התאורה, המרקם ואפשרויות העיבוד בקרן POV. בסיום, לחץ על לחצן ההפעלה כדי לעבד תמונת bitmap. זוהי תמונה של שרשרת חיידקי סטרפטוקוקוס שהייתה מכוונת לרגע.
סיים למישור המוקד. אובייקטים בתצורה זו קשים לשחזור ובדרך כלל מניבים כתם קרוב למישור המוקד. מוצגת כאן תמונה מעובדת כהלכה המייצגת את רוב הפריימים בסדרה זו שבהם השרשרת אינה מכוונת ישירות לאורך הציר האופטי.
הצורה והמיקום של האובייקט משוחזרים בנאמנות בעיבוד כפי שניתן לראות בלוח מימין. לאחר שליטה בטכניקה זו, ניתן לעשות זאת תוך דקות.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
מחקר זה מדגים את השימוש במיקרוסקופיה הולוגרפית דיגיטלית מקוונת (DIHM) כדי לשחזר את המיקום והגיאומטריה התלת-ממדיים של תאי חיידקים ששחים. הטכניקה מאפשרת הדמיה נפחית ללא תוויות במהירות מסגרות גבוהה, ומספקת יתרון משמעותי על פני שיטות מסורתיות.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביופיזיקה
- טכניקות הדמיה
רקע
- מיקרוסקופיה הולוגרפית דיגיטלית מקוונת (DIHM) היא טכניקת מיקרוסקופיה שונה.
- היא מאפשרת זיהוי ייחודי של אובייקטים מפזרים חלשים בשלושה ממדים.
- הדמיה הולוגרפית יכולה ללכוד תהליכים דינמיים בזמן אמת.
- שיטות קיימות כמו מיקרוסקופיה קונפוקלית לעיתים קרובות דורשות תיוג, שיכול לשנות את התנהגות הדגימות הביולוגיות.
מטרת המחקר
- לשחזר את המיקום והגיאומטריה התלת-ממדיים של תאי חיידקים ששחים.
- להדגים את האפקטיביות של DIHM בלכידת דינמיקה של תאים חיים.
- להשוות את היתרונות של DIHM לעומת שיטות הדמיה מסורתיות.
שיטות ששימשו
- הכנת תרבויות תאי חיידקים בריכוזים מתאימים.
- יישור מקור אור LED לצורך הדמיה הולוגרפית מיטבית.
- שימוש בתוכנת שחזור כדי להשיג קואורדינטות תלת-ממדיות.
- ניתוח התמונות ההולוגרפיות שהתקבלו כדי להעריך את תצורת התאים.
תוצאות עיקריות
- המיקומים התלת-ממדיים של תאי החיידקים שחזרו בהצלחה.
- הטכניקה הדגימה הדמיה במהירות מסגרות גבוהה ללא צורך בתוויות.
- התוצאות הצביעו על יתרון ברור על פני מיקרוסקופיה קונפוקלית במונחים של מהירות הדמיה ושלמות הדגימה.
- הדמיה הולוגרפית הוכחה כיעילה לתהליכים ביולוגיים דינמיים.
מסקנות
- DIHM היא כלי רב עוצמה לחקר דינמיקה של תאי חיידקים חיים.
- השיטה מאפשרת הדמיה תלת-ממדית מפורטת מבלי לשנות את הדגימה.
- טכניקה זו יכולה לשמש בתחומי מחקר ביולוגיים שונים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Digital inline holographic microscopy (DIHM) enables label-free volumetric imaging of weakly-scattering biological samples at high frame rates, addressing a key limitation in live-cell imaging where traditional methods require labeling or lack 3D spatial resolution. This capability supports early discovery workflows by providing quantitative, model-free measurements of cellular position and geometry in native conditions, reducing mechanistic ambiguity in target validation and phenotypic screening. The technique’s compatibility with standard imaging hardware and scalable sample volumes positions it as a reusable platform for de-risking therapeutic hypotheses in discovery biology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables unambiguous, model-free measurement of object location and shape in microscopic samples, supporting therapeutic hypothesis interrogation without exogenous labels.
- Operational Value: Uses standard CMOS/CCD cameras and LED or laser illumination, allowing integration into existing microscopy workflows without specialized reagents.
- Predictive Value: Provides quantitative 3D coordinates of cellular structures, facilitating functional target validation and biological de-risking through direct observation of native dynamics.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Captures interference patterns that contain depth information for 3D reconstruction, enabling label-free assessment of cellular responses in complex microenvironments.
- Operational Value: Defines accessible sample volume via camera sensor size and illumination coherence, supporting standardization across platforms with volumes up to 5 mm³ using laser illumination.
- Predictive Value: Employs Rayleigh-Sommerfeld back propagation and Gouy phase anomaly heuristics to generate reproducible, quantitative outputs for assay readiness and scalability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling real-time observation of dynamic biological processes in disease-relevant systems.
- Operational Value: Allows high-frame-rate imaging without sample alteration, preserving native behavior for longitudinal tracking in preclinical models.
- Predictive Value: Delivers mechanistic de-risking by reducing ambiguity in cellular geometry and positioning, informing risk-adjusted advancement decisions.
Pipeline & Workflow Integration
DIHM fits within the discovery continuum from hypothesis testing in early biology to lead identification and preclinical validation, particularly where label-free, volumetric, and dynamic imaging are required to compare experimental conditions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by providing model-free 3D localization of weakly-scattering objects like bacterial cells or subcellular structures.
- Screening: Enables assay readiness through quantitative, refocused image stacks that allow comparison of cellular configurations across conditions.
- Analytics: Generates X, Y, Z coordinate outputs via feature extraction, enabling statistical analysis of spatial distributions and motion patterns.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by preserving sample integrity during longitudinal imaging of dynamic processes.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable imaging capability rather than a single-use technique, leveraging free reconstruction software and standard hardware.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through label-free, model-free 3D reconstruction of object geometry and position.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via numerical refocusion and fixed-pattern noise suppression using background subtraction.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by reducing late-stage biological risk through early, high-fidelity observation of native cellular dynamics.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization via quantitative spatial data that informs target confidence and lead selection.
Implementation Considerations
- Requires expertise in holographic image acquisition and numerical reconstruction using Rayleigh-Sommerfeld back propagation.
- Needs instrumentation capable of plane-wave illumination and CMOS/CCD image capture at defined frame rates and resolutions.
- Demands cross-team standardization of illumination coherence, step size, and lateral sampling frequency for reproducible 3D reconstruction.
- Requires adaptation of output stack parameters (start focus, number of steps, step size) to match experimental scale and magnification.
- Practical limitation: optimal reconstruction requires objects to lie 10–30 microns from the focal plane, necessitating precise sample preparation and focusing.
