דיגיטלי Inline הולוגרפי מיקרוסקופית (DIHM) של נושאים בחולשת פיזור
8 בפברואר 2014
המקומות תלת ממדיים של אובייקטים בחולשה-פיזור יכולים להיות מזוהים באופן ייחודי באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי מוטבע הולוגרפית (DIHM), הכולל שינוי קל במיקרוסקופ רגיל. התוכנה שלנו משתמשת היוריסטי הדמיה פשוטה יחד עם ריילי-זומרפלד גב ההתפשטות להניב את המיקום ואת הגיאומטריה של אובייקט שלב מיקרוסקופי תלת ממדים.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לשחזר את המיקום התלת-ממדי בגיאומטריה של שרשרת של תאי חיידקים שוחים. זה מושג על ידי גידול תאי חיידקים תחילה לריכוז הנכון כדי לספק דגימה מתאימה להדמיה. כשלב שני, מקור אור ה-LED מוגדר ומיושר, ומאפשר לקבל תמונות הולוגרפיות.
לאחר מכן, נעשה שימוש בתוכנת השחזור על מנת להשיג את הקואורדינטות התלת-ממדיות של שרשרת תאי חיידקים. התוצאות מראות את היכולת לשחזר את המיקום והתצורה התלת מימדית של תאי החיידקים על סמך הדמיה הולוגרפית. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו מיקרוסקופיה קונפוקלית, הוא שהדמיה נפחית ללא תוויות אפשרית בקצבי פריימים גבוהים.
כדי להתחיל לחסן, 10 מיליליטר של מדיה KTY עם גבישי קרח ממלאי קפוא של סטרפטוקוקוס זן V 4 0 5 1 1 97 דוגרים את תרבית המתנע בשייקר סיבובי למשך הלילה ב-35 מעלות צלזיוס ו-150 סל"ד. לאחר שהוא גדל, חסנו 10 מיליליטר של מדיום KTY טרי עם 500 מיקרוליטר מתרבית המתנע הרוויה. דגירה במשך 3.5 שעות בטמפרטורה של 35 מעלות צלזיוס ו-150 סל"ד עד שהתאים מגיעים לצפיפות אופטית באורך גל של 600 ננומטר של 0.8 עד 1.0.
זה מייצג בערך פי חמישה עד 10 עד שמינית תאים למיליליטר. לאחר מכן יש לדלל את התאים ב-1 עד 400 במדיה טרייה כדי לקבל את הריכוז הסופי של כמיליון תאים למיליליטר. לאחר מכן, מלאו מזרק בג'לי נפט והכינו טבעת שומן בגובה מילימטר אחד על שקופית מיקרוסקופ.
לאחר מכן הניחו טיפה של תמיסת הדגימה במרכז. הנח בעדינות זכוכית כיסוי מעל הדגימה ולחץ קלות על הזכוכית כדי לאטום את הקצוות, וודא שהנוזל נמצא במגע הן עם השקופית והן עם זכוכית הכיסוי. תא הדגימה המתקבל צריך להגיע לעומק של 100 עד 200 מיקרומטר.
סובב עדשת טבילה בשמן פי 60 למקומה והוסף טיפת שמן. לאחר מכן הנח את תא הדגימה על המיקרוסקופ stage כשזכוכית הכיסוי פונה כלפי מטה. ודא שלא נוצרות בועות אוויר בין החלקת כיסוי הזכוכית לעדשה.
התמקד במשטח התחתון של תא הדגימה ולאחר מכן מקד את הקבל. לאחר מכן, כבה את התאורה הסטנדרטית והנח את ראש ה-LED מאחורי צמצם הקבל של המיקרוסקופ. ודא שהמעבה מוגדר למצב שדה בהיר והגדר את ספק הכוח LED לתפוקה מקסימלית.
לאחר מכן סגור את צמצם המעבה במלואו ודחף את ה-LED בתושבת שלו עד שהתאורה תתרכז על צמצם עדשת האובייקטיבי. הפעל את המחשב ולאחר מכן הפנה את נתיב האור ליציאת המצלמה של המיקרוסקופ. התאם את קצב הפריימים ל-30 פריימים לשנייה ואת גודל התמונה לחמש 12 על חמש 12 פיקסלים בתוכנת רכישת התמונות.
בדקו היסטוגרמה של עוצמת התמונה כדי לוודא שאף חלק בתמונה אינו רווי או חשוף פחות. זמן החשיפה למסגרת צריך להיות קצר ככל האפשר תוך שמירה על ניגודיות טובה. אם תאים נאספים קרוב לממשק, מקדו מחדש את המיקרוסקופ כך שתאי החיידקים יהיו מעט לא ממוקדים.
התאים צריכים לשכב בסביבות 10 עד 30 מיקרון ממישור המוקד לשחזור אופטימלי. לאחר המיקוד מחדש, רכוש סדרה של מסגרות וידאו ושמור כקובץ VI לא דחוס. לאחר מכן הפעל את תוכנת DIHM הזמינה להורדה בחינם כדי להמיר מסגרת וידאו לערימת תמונות ממוקדת מחדש מבחינה מספרית.
מסגרות לדוגמה מסופקות עם התוכנה כדי להתחיל בשחזור. הזן את מסגרת העניין ואת הרקע שלה כקבצי תמונה נפרדים לתיבות. תמונת הרקע מייצגת בצורה הוגנת את הרקע של הסרטון בהיעדר הולוגרמה ותשמש לדיכוי כל רעש דפוס קבוע שעלול להפריע ללוקליזציה ולניתוח ההולוגרפי.
לאחר מכן, הזן פרמטרים של מחסנית פלט בתיבות ההגדרות הכלליות. תחילה, הזן את המיקום הצירי של המסגרת הראשונה במיקוד ההתחלה. לאחר מכן הזן את מספר הפרוסות בערימה המשוחזרת במספר צעדים, ולבסוף, הזן את המרחק בפועל בין כל פרוסה בערימה בגודל צעד.
הגדר את גודל הצעד כך שיהיה זהה למרווח הפיקסלים הרוחבי כדי לבנות מחדש אובייקטים עם הפרופורציות הנכונות באמצעות הנתונים לדוגמה. ערך זה צריך להיות 0.233 מיקרומטר. לאחר מכן, הזן את התאורה, אורך הגל ומקדם השבירה הבינוני של המצלמה ואת תדירות הדגימה לרוחב.
בתיבה פיקסל למיקרון, ניתן למצוא את תדירות הדגימה הרוחבית של המצלמה על ידי חלוקת הגדלת עדשת המטרה בגודל הפיקסלים של חיישן המצלמה. באמצעות נתוני הדוגמה, המספר יהיה 60 x חלקי 14 מיקרומטר שווה ל-4.29 פיקסלים למיקרון. לאחר מכן, אם מרכז האובייקט כהה בהולוגרמה, לחץ על לחצן מעבר הצבע Z היפוך.
פעולה זו תחיל מסנן המחלץ עצמים מתחת למישור המוקד בדגימה המקורית. לאחר מכן הפעל את מסנן מעבר הלהקה, האחראי על דיכוי תרומת הפיקסלים הרועשת לתמונה. הוא מוחל על כל פרוסת תמונה מיד לאחר היצירה.
לאחר מכן, בדוק את מתג פלט הביניים במצב כבוי וודא שהם פועלים. כאשר מתגים אלה מופעלים, זה יגרום ליצירת שני סרטונים. הפלט הראשון הוא מחסנית המיקוד מחדש עם שם קובץ המסתיים במחסנית V.המחסנית השנייה היא פעולת השיפוע בפועל עם שם קובץ המסתיים בשיפוע A VI.באופן אידיאלי, מחסנית שנייה זו תכיל את מושא העניין המודגש כאובייקט בהיר על רקע כהה.
לאחר הגדרת כל הפרמטרים, לחץ על הפעלה בחלון הראשי כדי לבצע את הפקודות. המסגרת שנבחרה תופיע בתיבה הראשית של התוכנה. לאחר מכן השתמש בכלי הזכוכית המגדלת שנמצא בסרגל הכלים משמאל לתמונה כדי להגדיל ולהקטין את התצוגה.
השתמש בכלי המלבן כדי לבחור אזור עניין או החזר ROI וללכוד כמה שיותר שולי הולוגרמות בתוך המלבן כדי למטב את השחזור. לבסוף, לחץ על כפתור התהליך כדי ליצור את שתי ערימות התמונות הנפרדות. בדוק את הערימות המתקבלות באמצעות תמונה J הזמינה באתר זה.
אם ניתן לראות בבירור את האובייקט המעניין בערימת תמונות מעבר הצבע, המשך לקטע העיבוד כדי לחלץ את קואורדינטות האובייקט. כדי להתחיל בעיבוד, לחץ על לחצן חילוץ התכונות כדי להפעיל את פונקציית מיקום הקואורדינטות X, Y, Z. לאחר מכן הזן נתיב וסיומת לקובץ קואורדינטות הפלט, בחר סגנון קרן POV בתיבה סגנון קואורדינטות הפלט.
זה גורם לתוכנית לכתוב קובץ אובייקט שניתן להמחיש באמצעות חבילת התוכנה החינמית למעקב אחר קרני POV, אותה ניתן להשיג מאתר זה, לעבד מחדש את התמונות כדי לחלץ את קואורדינטות האובייקטים. התוכנית תספק סדרה של קואורדינטות X, Y, Z בהחזר ה-ROI שנבחר שנכתב לשם הקובץ בתיבת כבלי הפלט. חילוץ קואורדינטות אובייקטים לוקח הרבה יותר זמן מיצירת ערימות.
ודא שקובץ ה-POV ray לדוגמה שסופק עם קוד השחזור קיים באותה תיקיה כמו קובץ קואורדינטות הפלט. ערוך את קובץ הנקודה pov לדוגמה והחלף את שם הקובץ בפסיקים הפוכים בשורה. כלול את הקובץ שלי NC עם שם קובץ הנתונים שנוצר על ידי קוד השחזור.
לאחר מכן התאם אישית את מיקום המצלמה, התאורה, המרקם ואפשרויות העיבוד בקרן POV. בסיום, לחץ על לחצן ההפעלה כדי לעבד תמונת bitmap. זוהי תמונה של שרשרת חיידקי סטרפטוקוקוס שהייתה מכוונת לרגע.
סיים למישור המוקד. אובייקטים בתצורה זו קשים לשחזור ובדרך כלל מניבים כתם קרוב למישור המוקד. מוצגת כאן תמונה מעובדת כהלכה המייצגת את רוב הפריימים בסדרה זו שבהם השרשרת אינה מכוונת ישירות לאורך הציר האופטי.
הצורה והמיקום של האובייקט משוחזרים בנאמנות בעיבוד כפי שניתן לראות בלוח מימין. לאחר שליטה בטכניקה זו, ניתן לעשות זאת תוך דקות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מדגים את השימוש במיקרוסקופיה הולוגרפית דיגיטלית בקו ישר (DIHM) לשחזור המיקומים והגיאומטריות התלת-ממדיים של תאי חיידקים שוחים. הטכניקה מאפשרת דימוי נפחי ללא סימון בקצבי פריימים גבוהים, מה שמהווה יתרון משמעותי לעומת שיטות מסורתיות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביופיזיקה
- טכניקות דימות
רקע
- מיקרוסקופיה הולוגרפית דיגיטלית בקו (DIHM) היא טכניקת מיקרוסקופיה משופרת.
- היא מאפשרת זיהוי ייחודי של עצמים בעלי פיזור אור חלש בתלת-ממד.
- דימות הולוגרפי יכול ללכוד תהליכים דינמיים בזמן אמת.
- שיטות קיימות, כגון מיקרוסקופיה קונפוקלית, דורשות לעיתים סימון, דבר שעלול לשנות את התנהגותם של דגימות ביולוגיות.
מטרת המחקר
- לשחזור המיקום והגאומטריה בתלת-ממד של תאי חיידקים שוחים.
- להדגמת היעילות של DIHM בלכידה של דינמיקה של תאים חיים.
- להשוואת היתרונות של DIHM לעומת שיטות דימוי מסורתיות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת תרביתי תאי חיידקים בריכוזים המתאימים.
- יישור של מקור אור LED להשגה של הדמיה הולוגרפית אופטימלית.
- שימוש בתוכנת שחזור לקבלת קואורדינטות בתלת-ממד.
- ניתוח התמונות ההולוגרפיות שהתקבלו להערכת קונפיגורציית התאים.
תוצאות עיקריות
- מיקומיהן התלת-ממדיים של תאי החיידקים שוחזרו בהצלחה.
- הטכניקה הדגימה דימות בקצב פריימים גבוה ללא צורך בסימון.
- התוצאות הצביעו על יתרון ברור על פני מיקרוסקופיה קונפוקלית במונחים של מהירות דימוי ושלם הדגימה.
- דימוי הולוגרפי הוכח כיעיל עבור תהליכים ביולוגיים דינמיים.
מסקנות
- DIHM הוא כלי רב עוצמה לחקר דינמיקה של תאי חיידקים חיים.
- השיטה מאפשרת דימות תלת-ממדי מפורט ללא שינוי של הדגימה.
- ניתן ליישם טכניקה זו בתחומי מחקר ביולוגיים מגוונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מיקרוסקופיה הולוגרפית דיגיטלית בקו אחד (DIHM) מאפשרת הדמיה נפחית ללא סימון של דגימות ביולוגיות בעלות פיזור חלקי של אור בקצבי רכישת תמונות גבוהים, ובכך נותנת מענה למגבלה מרכזית בהדמיה של תאים חיים, שבה שיטות מסורתיות דורשות סימון או סובלות מחסור ברזולוציה מרחבית בתלת-ממד. יכולת זו תומכת בתהליכי גילוי מוקדמים על ידי אספקת מדידות כמותיות, ללא מודל, של מיקום התא וגאומטריתו בתנאים טבעיים, ובכך מפחיתה עמימות מכניסטית באימות מטרות ובסריקה פנוטיפית. התאימות של הטכניקה לחומרה סטנדרטית להדמיה ונפחי דגימה ניתנים להרחבה ממיצבה כפלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר להפחתת סיכונים בהיפותזות טיפוליות בביולוגיה של גילוי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר מדידה חד-משמעית, ללא מודל, של מיקום וצורת אובייקטים בדגימות מיקרוסקופיות, ובכך תומך בבדיקת היפותזות טיפוליות ללא שימוש בסמנים חיצוניים.
- ערך תפעולי: משתמש במצלמות CMOS/CCD סטנדרטיות ובתאור LED או לייזר, מה שמאפשר שילוב בתהליכי עבודה קיימים של מיקרוסקופיה ללא צורך בריאגנטים מיוחדים.
- ערך ניבוי: מספק קואורדינטות תלת-ממדיות כמותיות של מבנים תאיים, מה שמקל על תיקוף של מטרות פונקציונליות והפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות תצפית ישירה על דינמיקה טבעית.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: לכידת תבניות התאבכות המכילות מידע על עומק לצורך שחזור בתלת-ממד, המאפשרת הערכה ללא סימון (label-free) של תגובות תאיות בסביבות מיקרו מורכבות.
- ערך תפעולי: הגדרת נפח דגימה נגיש באמצעות גודל חיישן המצלמה והקוהרנטיות של התאורה, התומכת בסטנדרטיזציה בין פלטפורמות עם נפחים של עד 5 mm³ תוך שימוש בהארה בלייזר.
- ערך חיזוי: שימוש בהגבלה לאחור (back propagation) לפי ריילי-סומרפלד ובאוריסטיקות של אנומלית מופע גואי (Gouy phase anomaly) כדי להפיק פלטים כמותיים הניתנים לשחזור לצורך מוכנות הבדיקה ויכולת הרחבה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תומך ברציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי מתן אפשרות לצפייה בזמן אמת בתהליכים ביולוגיים דינמיים במערכות הרלוונטיות למחלה.
- ערך תפעולי: מאפשר הדמיה בקצב פריימים גבוה ללא שינוי של הדגימה, ובכך שומר על ההתנהגות הטבעית לצורך מעקב ארוך טווח במודלים פרה-קליניים.
- ערך חיזוי: מספק הפחתת סיכונים מכניסטית על ידי צמצום העמימות בגיאומטריה ובמיקום התאיים, ובכך מסייע בקבלת החלטות על קידום מותאם סיכונים.
שילוב צינור עיבוד וזרימת עבודה
DIHM משתלב ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזות בביולוגיה מוקדמת ועד לזיהוי מובילים ותיקוף פרה-קליני, ובמיוחד במקרים שבהם נדרש דימוי דינמי, נפחי וללא סימון כדי להשוות בין תנאים ניסויים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים על ידי אספקת לוקליזציה תלת-ממדית ללא דגם של עצמים בעלי פיזור חלש, כגון תאי בקטריות או מבנים תת-תאיים.
- סריקה: מאפשרת מוכנות לבדיקה באמצעות ערימות תמונות כמותיות וממוקדות מחדש, המאפשרות השוואה של תצורות תאיות בין תנאים שונים.
- אנליטיקה: מייצרת פלטי קואורדינטות X, Y, Z באמצעות חילוץ מאפיינים, מה שמאפשר ניתוח סטטיסטי של התפלגויות מרחביות ותבניות תנועה.
- מחקר תרגומי: מקשר להמשכיות פרה-קלינית על ידי שמירה על שלמות הדגימה במהלך דימוי אורך של תהליכים דינמיים.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כבכשרת דימוי הניתנת לשימוש חוזר ולא כטכניקה לשימוש חד-פעמי, תוך ניצול תוכנת שחזור חופשית וחומרה סטנדרטית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון במיקוד החזוי באמצעות שחזור תלת-ממדי של גיאומטריית ועמדה של האובייקט, ללא סימון וללא מודל.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה ויכולת שחזור באמצעות מיקוד מחדש נומרי ודיכוי רעש בתבנית קבועה באמצעות חיסור רקע.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות משופרת לגבי המשך התהליך (go/no-go) על ידי הפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים, הודות לתצפית מוקדמת ובנאמנות גבוהה על דינמיקה תאית טבעית.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף מותאם סיכון באמצעות נתונים מרחביים כמותיים המנחים את רמת הביטחון במטרה ואת בחירת המועמדים המובילים (leads).
שיקולי יישום
- דורש מומחיות ברכישת תמונות הולוגרפיות ושחזור מספרי באמצעות הפצה לאחור (back propagation) לפי Rayleigh-Sommerfeld.
- דורש ציוד המסוגל להארה בגל מישורי וללכידת תמונות ב-CMOS/CCD בקצבי פריימים וברזולוציות מוגדרים.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של קוהרנטיות ההארה, גודל הצעד ותדירות דגימה לטרלית לצורך שחזור תלת-ממדי הניתן לשחזור.
- דורש התאמה של פרמטרי ערימת הפלט (מיקוד התחלה, מספר צעדים, גודל צעד) כדי להתאים לקנה המידה וללהגדלה הניסויית.
- מגבלה מעשית: שחזור אופטימלי מחייב שהאובייקטים יהיו במרחק של 10–30 microns ממישור המיקוד, דבר המצריך הכנת דגימה ומיקוד מדויקים.
