שיטת Optogenetic לשלוט ולנתח ג'ין תבניות ביטוי באינטראקציות לתא

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לצפות בהעברת מידע תנודתי מתא לתא על ידי בקרה אופטוגנטית וניטור חי של ביטוי גנים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח של האופן שבו תאים מתקשרים זה עם זה דרך מסלול האיתות Notch, במיוחד כיצד תאים מעבירים את המידע התנודתי זה לזה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנו יכולים לשלוט ולנטר את דינמיקת ביטוי הגנים בדיוק גבוה מאוד.

מי שידגים את ההליך יהיה אקיהירו איסומורה, עמית מחקר מהמעבדה שלי שפיתח את הטכנולוגיה החדשה הזו. כדי להעביר וקטורים של פלסמיד של מודולים אופטוגנטיים מבוססי Tol2 יחד עם וקטור ביטוי הטרנספוזאז לתאי C2C12, ספרו תחילה תאים טריפסינים עם מונה תאים. צלחת 50,000 תאי C2C12 לבאר בצלחת של 12 בארות יום אחד לפני הטרנספקציה.

לאחר מכן, העבר במשותף 0.375 מיקרוגרם של וקטורים אופטוגנטיים מבוססי Tol2, 0.125 מיקרוגרם של וקטור בחירת תרופות ו-0.5 מיקרוגרם של וקטור ביטוי הטרנספוזאז באמצעות מגיב הליפופקציה. נסה את התאים שעברו טרנספטציה, וצלח אותם לצלחות תרבית של 100 מילימטר יום לאחר הטרנספקציה. החלף את מדיום התרבית עבור התאים המועברים למדיום תרבית בתוספת 100 מיליגרם למיליליטר היגרומיצין.

תרבית את התאים במשך שלושה ימים כדי לחסל תאים שלא עברו טרנספטציה. שים לב ששינוי בינוני אינו הכרחי. לאחר מכן, נסה את התאים שעברו טרנספטציה, וטהר אוכלוסייה של תאים המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים לבחירה על ידי מיון התאים המקלטים והתאים הרגישים לאור, כמפורט בפרוטוקול הטקסט.

הקימו שני סוגים של אינקובטורים עם או בלי מקורות אור למצב המושרה על ידי אור או מצב חושך. השתמש במד אור כדי להגדיר את עוצמת האור של משדר LED כחול. מדוד את עוצמת האור לאחר סגירת הדלת.

תזמוני תכנות ומשך תאורת האור על ידי טעינת סקריפט בקרה למיקרו-בקר לוח יחיד המאפשר לוחות זמנים ניתנים-לתכנות עבור תאורה. ספרו את התאים הטריפסינים עם מונה תאים, וצלחו 100,000 תאי שולח רגישים לאור הנושאים pAI218 ו-pAI170 על צלחות תרבית פלסטיק בקוטר 35 מילימטר. הניחו את הכלים בחממות נפרדות לתנאי חושך ובהיר.

לאחר הגדרת הכלים, שמור את דלתות החממות סגורות עד לאיסוף הליזטים של התאים. יום וחצי לאחר הציפוי, התחל בהדלקת אור. אל תחשוף תאים לאור בלתי מבוקר כדי למנוע גירוי פוטו לא רצוי.

לכן, בצע שלב זה מבלי לפתוח את הדלת. שימו לב שפתיחת הדלת כאן היא להדגמה בלבד. כיומיים לאחר הציפוי, העבירו מנות דגימה מאינקובטורים לקרח במרווחים של 30 דקות, והתחילו להכין ליזטים של תאים להמשך ניתוח.

כדי לנטר את התגובות התאיות בעת גירוי אופטי על ידי PMT בזמן אמת, ראשית יש לספור ולספור את מספר תאי השולח והמקבל בשיטות סטנדרטיות. הכן מתלה נפח כולל של מיליליטר אחד של 25,000 מקלט ו -125,000 תאי שולח. צלחת את התאים המעורבים בכל באר של צלחות שחורות בעלות 24 בארות עם מדיום תרבית המכיל לוציפרין של מילי-מולרית אחת.

נתח את התאים בקורא צלחות לבדיקת הלוציפראז כדי לאשר שאותות הפלט אינם גבוהים מדי עבור מערכת ההקלטה. לאחר מכן, הנח את הצלחת על מערכת ההקלטה והתחל תוכנית הקלטה. לדוגמה, התחל תאורת אור 18 שעות לאחר הגדרת ההקלטה.

להדמיה בזמן אמת של תגובות תא בודד תחת שליטת הפרעה אופטוגנטית, לוחית ראשונה 50,000 מקלט ו-250,000 תאי שולח על צלחות בקוטר 27 מילימטר על בסיס זכוכית בקוטר 35 מילימטר. ודא שיחסי הערבוב ומספר התאים הכולל מותאמים כהלכה. יום לאחר הציפוי, החלף מדיום עם שני מיליליטר של מדיום ההקלטה.

הניחו את צלחת בסיס הזכוכית על מיקרוסקופ הפוך המצויד בתא סביבתי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. הגדר מצלמת CCD מקוררת. ודא שהטמפרטורה של חיישן ה-CCD מקוררת לערך היעד.

הגדר פרמטרים עבור חלון זמן-lapse רב-ממדי בתוכנת רכישה אוטומטית כדי לצלם תמונות במרווחים של חמש דקות ויותר מ-288 פעמים. בחלון קיטועי הזמן הרב-ממדיים, בחר ערוץ זוהר. ודא שמצב הקריאה מוגדר למצב קריאה איטי של 50 קילו-הרץ, שהוא קריטי להפחתת רעשי קריאה כדי לזהות אור ביולוגי הפולט חלש.

בחלון קיטועי הזמן הרב-ממדיים, בחר ערוצי פלואורסצנטיות. ודא שמצב הקריאה מוגדר למצב מהיר של מגה-הרץ אחד כדי להפחית את הזמן הנדרש להדמיית פלואורסצנטיות. לבסוף, הגדר binning שניים על שניים עם חשיפה של 400 אלפיות השנייה.

לאחר מכן, בחר כרטיסיית יומן כדי להגדיר לוחות זמנים לגירוי התאים עם תאורת אור כחול תקופתית. לחץ על לחצן הפלוס כדי להוסיף הגדרת יומן חדשה. בחר קובץ יומן מתיבת יומן, בחר נקודות זמן מרובות והגדר ערכים בתיבות נקודת התחלה ומרווח זמן לתזמון לגירוי.

ודא שקובץ היומן שצוין כולל פרוטוקולים רציפים לבחירת תאורה, פתיחת תריס, השהיה, סגירת תריס ועיכוב. לאחר מכן, הגדר לוחות זמנים לגירוי תאים עם תאורת אור כחול תקופתית. לבסוף, התחל הקלטת זמן-lapse על ידי לחיצה על לרכוש לחצן.

לבסוף, חלץ עקבות של תא בודד של ערוצי זוהר מסרטי זמן-lapse, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. תוצאות מייצגות של בדיקות שולח-מקבל אופטוגנטיות מוצגות כאן. תאי השולח הניתנים להשראת אור ייצרו דפוסי תנודה של ביטוי ליגנד דלתא בנוכחות תאורת אור כחול תקופתית, כצפוי.

כאשר תאי מקלט עוברים תרבית משותפת עם תאי השולח הרגישים לאור ונחשפים לתאורת אור חוזרת, מערכת הקלטת ביולומינסנציה בזמן אמת מזהה תגובות מחזוריות של תאי מקלט בתנאים שונים של יחסי ערבוב. יתרה מכך, מיקרוסקופ זמן-lapse עם תאורת אור חוזרת חושף גם את התגובות המסונכרנות של תאי הקליטה ברמת התא הבודד. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של התא לחקור כיצד מידע דינמי של ביטוי גנים מועבר באינטראקציות תא-תא.