אפיון של תאים חיסוניים בתוך רקמת שומן אנושי באמצעות Cytometry זרימה

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשתמש בזרימה ציטומטרית כדי לבודד את מקטע כלי הדם הסטרומלי מרקמת השומן האנושית לצורך פנוטיפ של אוכלוסיות תאי החיסון השונות הנמצאות ברקמת השומן. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במחקר מטבולי, כגון אילו תאי חיסון מצטברים ברקמת השומן של אנשים שמנים ובאיזו מידה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת מדידה בו זמנית של סמנים מרובים על תאי חיסון וזיהוי וכימות של תאי חיסון אלה ברקמת השומן.

למרות שטכניקה זו יכולה לספק תובנה מכרעת לגבי דלקת ברקמת השומן, ניתן ליישם אותה גם על איברים ורקמות אחרות. בדרך כלל, אנשים חדשים בטכניקה זו יתמודדו בעיקר עם זיהום תאי כלי דם סטרומלי ואובדן תאים במהלך הליך הצביעה. שניים מהמועמדים שלי לדוקטורט, סוזן ווצלס ומיטשל ביינן, יבצעו את הפרוטוקול.

התחל בשימוש באזמל כדי לטחון גרם אחד של ביופסיית רקמת שומן לחתיכות בגודל של כשני מילימטרים מרובעים. מעבירים את החלקים לצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר ומוסיפים 10 מיליליטר תמיסת קולגנאז לדגימות. דגרו את שברי הרקמה למשך 60 דקות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס ב-60 מחזורים לדקה.

לאחר מכן סינון דרך מסננת של 200 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי חדש של 50 מיליליטר. שוטפים את המסנן בשבעה מיליליטר PBS לפני הצנטריפוגה. לאחר מכן השתמש בפיפטה כדי להסיר את הסופרנטנט מבלי לטבול את כל קצה הפיפטה בתמיסה.

הגלולה צריכה להיות גלויה בבירור ולהסיר כמעט את כל הסופרנטנט כדי למנוע זיהום של חלק כלי הדם הסטרומלי בתאי שומן. אנו תולים את כדור תאי כלי הדם הסטרומלי עם חמישה מיליליטר PBS טרי ומסננים את חלק כלי הדם הסטרומלי דרך מסננת של 70 מיקרומטר לתוך צינור חדש. לאחר צנטריפוגה, אנו משעים את גלולת שבר כלי הדם הסטרומלית השטופה בשלושה מיליליטר של מאגר ליזה אריתרוציטים למשך חמש דקות על קרח.

לאחר מכן עצרו את הליזיס עם שבעה מיליליטר PBS וגלולו את התאים על ידי צנטריפוגה. כדי לצבוע את שבר כלי הדם הסטרומלי לניתוח ציטומטרי זרימה, השעו מחדש את הגלולה ב-90 מיקרוליטר של מיון תאים מופעל פלואורסצנטי של ארבע מעלות צלזיוס, או מאגר FACS, וחסמו את הצביעה הלא ספציפית עם עשרה מיקרוליטרים של IgG אנושי. פצלו את תרחיף התאים בין שתי בארות של צלחת עם תחתית V של 96 בארות והניחו את התאים על קרח למשך 15 דקות.

בתום הדגירה, שטפו כל דגימה עם 100 מיקרוליטר של מאגר FACS, והפכו את הצלחת בתנועה חלקה אחת מבלי להקיש כדי להשליך את הסופרנטנטים בסוף הצנטריפוגה. ודא שאתה יכול לראות בבירור את הכדור בתחתית הצלחת לפני שאתה הופך אותו כדי למנוע אובדן של התאים שלך במהלך ההליך. השעו מחדש את הגלולה הראשונה ב-29.5 מיקרוליטר של קוקטייל נוגדנים עבור פאנל ה-FACS הראשון ואת הגלולה השנייה ב-23 מיקרוליטר של קוקטייל נוגדנים עבור פאנל ה-FACS השני.

לאחר 30 דקות על קרח בחושך, שטפו את התאים עם 150 מיקרוליטר של מאגר FACS לבאר וקבעו את כדורי התא ב-150 מיקרוליטר של תמיסת פורמלדהיד באחוז אחד. העבירו את תרחיפי התאים מכל באר לצינורות ה-FACS המתאימים והניחו את הדגימות על קרח. לפני ניתוחם, טען בקרה שלילית לא מוכתמת על ציטומטר הזרימה כדי להגדיר את פרמטרי הפיזור קדימה ופיזור הצד.

לאחר מכן כוונן את המתחים של ציטומטר הזרימה בהתאם להוראות היצרן עד שכל האוכלוסיות המעניינות נראות בגרפי הפיזור קדימה ופיזור הצד, וניתן להבחין בין הפסולת לתאים החיים. כאשר כל הפרמטרים נקבעו, מערבל את הדגימה הניסיונית הראשונה ב-800 סל"ד כדי להשעות מחדש את התאים ביסודיות ולטעון את הדגימה על הציטומטר. קרא מינימום של 50,000 אירועים בשער החי, ואז מערבולת וטען את הדגימה השנייה לניתוח כפי שהודגם זה עתה.

כדי לאפשר ניתוח של אוכלוסיות המקרופאגים של רקמת השומן בניסוי מייצג זה, תאים חיסוניים אחרים, כגון תאי T, תאי B, נויטרופילים ותאי הרג טבעיים לא נכללו כדי לחשוף את נוכחותם של CD11b+CD11c+מקרופאגים, CD11B+CD11C-מקרופאגים ו-CD11Blow-CD11C+תאים דנדריטיים. כימות עוצמת הקרינה העיקרית של תאים אלה חשף את הביטוי של תאים דנדריטיים ציטואידים בפלזמה וסמני תאים דנדריטיים גנריים בתאי CD11B+CD11C+ ו-CD11Blow-CD11C+, עם ביטוי גבוה יותר של שני הסמנים שנצפה בתאי CD11Blow-CD11C+, מה שמאשר שתאי CD11Blow-CD11C+ היו למעשה תאים דנדריטיים. שער התאים החיוביים ל-CD45 חשף אוכלוסיות תאי T חיוביים ל-CD19 B ו-CD3, שאת האחרונים ניתן לחלק עוד יותר ל-CD3+CD4+T מסייע, ותת-קבוצות של תאי T ציטוטוקסיים CD3+CD8+, ותאי הרג טבעיים CD3-CD56+.

לאחר מכן חושב אחוז התאים החיסוניים בני הקיימא עבור כל נבדק, וחשף עלייה משמעותית באחוז CD11B+CD11C+מקרופאגים פרו-דלקתיים ברקמת השומן הקרביים של נבדקים זכרים בוגרים שמנים. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך ארבע שעות אם היא מבוצעת כראוי. בזמן הניסיון בהליך זה, חשוב לשמור על המאגרים ושברי התאים על קרח, ובזמן סימון התאים בנוגדנים חשוב מאוד לשמור אותם בחושך.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו אפשרה לחוקרים בתחום המחקר המטבולי לחקור את השינויים בתאי החיסון ברקמת השומן של בני אדם. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד תאי חיסון של רקמת שומן וכיצד לבצע ציטומטריית זרימה על תאים אלה. זכור שאתה עובד עם חומר וחומרים אנושיים שעלולים להיות מדבקים, כגון פורמלדהיד, שעלולים להיות מסוכנים.

נקוט תמיד באמצעי זהירות עם כפפות ומשקפי בטיחות.