אפיון של תאי דנדריטים אדם נגזר מונוציטים ידי cytometry זרימת הדמיה: השוואה בין שני פרוטוקולי בידוד מונוציטים

המטרה הכוללת של מחקר זה היא להשוות בין שתי שיטות שונות של בידוד מונוציטים אנושיים ליצירת תאים דנדריטיים במבחנה ולאפיין את ביטוי פני השטח של תאי CT11c, CT14 של האוכלוסיות הנגזרות ממונוציטים המתקבלות על ידי הדמיית ציטומטריית זרימה. פרוטוקולי בידוד מונוציטים אלה יכולים לתרום לפיתוח שיטות אמינות לטיהור תאים דנדריטיים אנושיים למחקר ויישומים קליניים. היתרון העיקרי של פרוטוקולים אלה הוא בכך שהם מקלים על בידוד מונוציטים אנושיים והתמיינותם לתאים שמקורם במונוציטים ברי קיימא ופונקציונליים.

בנוסף, זהו המחקר הראשון המאפיין את האוכלוסייה הספציפית של תאים דנדריטיים שמקורם במונוציטים על ידי ציטומטריית זרימה של תא בודד. ניתן ליישם שיטה זו גם כחלופה לבידוד של תאים נדירים אחרים בתשואה נאותה ליישומי מחקר במורד הזרם. הדגמה חזותית של שיטות אלו היא קריטית מכיוון שזה יכול להיות מאתגר לטפל בדגימות הדם בבטחה ללא הדרכה וניסיון מתאימים.

התחל בדילול דגימת הדם ליחס של אחד לאחד עם PBS בבקבוק T75. לאחר מכן, הוסף 15 מיליליטר של תמיסת שיפוע צפיפות לתוך צינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר ושכבה בזהירות של 25 עד 30 מיליליטר מהדם המדולל מעל השיפוע. כדי להשיג הפרדה נכונה של התאים החד-גרעיניים של הדם ההיקפי, טען את הדם על תמיסת שיפוע הצפיפות במהירות, אך בזהירות ומבלי לערבב את השכבות.

הפרד את התאים על ידי צנטריפוגה, ואחריה העברת שכבת ממשק תאי הדם הלבנים לצינור חרוטי חדש של 50 מיליליטר. שטפו את התאים פעמיים ב-PBS, והשעו מחדש את הגלולה הסופית ב-10 מיליליטר של מאגר אשלגן אמוניום כלוריד למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן שטפו את התאים פעמיים נוספות ב- PBS.

כדי לבודד מונוציטים בשיטת ההדבקה, תרבית חמש פעמים 10 לשבעת התאים של כדור PBMC המתקבל לכל 10 מיליליטר של מדיום שלם בבקבוק T75 חדש למשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזים פחמן דו חמצני בחממה לחה. בתום הדגירה יש להשליך את התאים הצפים שאינם נדבקים ולשטוף בעדינות את התאים הדבקים פעמיים עם PBS. לאחר מכן, האכילו את התאים הדבקים במדיום תרבית תאים שלם בתוספת GMCSF ו-IL4 אנושיים והחזירו את התרבית לחממה למשך חמישה עד שבעה ימים.

כדי לבודד את המונוציטים על ידי הפרדה מגנטית, לאחר איסוף ה- PBMC על ידי הפרדת שיפוע צפיפות העבירו את שכבת תאי הדם הלבנים לצינור פוליסטירן של חמישה מיליליטר והשעו מחדש את התאים ב- PBS בריכוז של חמישה פעמים 10 עד שבעה תאים למיליליטר. לאחר מכן, הוסף לתאים 50 מיקרוליטר של קוקטייל העשרה מונוציטים אנושי למיליליטר בערבוב ודגר את התאים עם הקוקטייל בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר מכן הוסיפו 50 מיקרוליטר של חלקיקים מגנטיים למיליליטר תאים תוך ערבוב זהיר ודגרו על התאים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

בתום הדגירה השנייה, הוסף PBS לתאים כדי להביא את הנפח הכולל עד שניים או חמישה מיליליטר וערבב על ידי פיפטה פעמיים עד שלוש. לאחר מכן הנח את צינור הפוליסטירן במכשיר מגנטי מתאים בטמפרטורת החדר. לאחר שתיים וחצי דקות, כשהצינור עדיין במגנט, שפכו את שבר המונוציטים המטוהר לתוך צינור חרוטי חדש של 15 מיליליטר.

לאחר מכן תרבית את המונוציטים המטוהרים ואת מדיום תרבית התאים השלם בתוספת GMCSF ו-IL4 למשך חמישה עד שבעה ימים כפי שהודגם זה עתה. לאחר שבעה ימים של התמיינות, יש להוציא אחת פי 10 עד ששת האליקווטים של התאים הדנדריטים שמקורם במונוציטים למספר המתאים של צינורות של נקודה וחמישה מיליליטר, ולהוסיף 50 מיקרוליטר של סרום אנושי מומת בחום לכל דגימה כדי לחסום כל ממצא לא ספציפי. לאחר 10 דקות, צנטריפוגה של התאים והשעיה מחדש של הכדורים בנוגדנים ראשוניים מצומדים פלואורסצנטיים מתאימים למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס מוגנים מפני אור.

לאחר מכן שטפו את התאים פעמיים במיליליטר אחד של PBS, והשעו את הכדורים ב-100 מיקרוליטר PBS לכל אחד כפול עשרה עד ששת התאים. רגע לפני הניתוח, הוסף מיקרוליטר אחד של DAPI לכל צינור. לאחר מכן, קרא את הדגימות על ציטומטר זרימת הדמיה של תא בודד בהתאם להוראות היצרן.

בממוצע, מונוציטים שבודדו בשיטת ההיצמדות מהווים כשישה אחוזים מכלל אוכלוסיית תאי המונוציטים בדם ההיקפי, או PBMC, בעוד שהמונוציטים המבודדים על ידי הפרדה מגנטית מהווים עד 25 אחוז מכלל ה-PBMC. מונוציטים המבודדים בכל אחת מהשיטות הם ברי קיימא באותה מידה. MDDCs שהובחנו ממונוציטים שטוהרו בשתי השיטות היו מגודרים תחילה על סמך תאים שליליים או ברי קיימא DAPI מסך התאים הבודדים, ולאחר מכן שער של כל אוכלוסיית תאים.

שתי שיטות הבידוד הניבו אוכלוסייה חיובית נמוכה ל-CD14 ושתי השיטות הניבו אוכלוסייה חיובית ל-CD11c גבוהה. ניתוח פנוטיפי נוסף בוצע על כל התאים החיוביים ל-CD11c ולמרות שבידוד מגנטי נותן אחוז גבוה יותר של תאים חיוביים ל-CD11c חיוביים כפולים, השפעה זו לא הייתה משמעותית בהשוואה לשיטת ההדבקה. תאים חיוביים כפולים אלה ל-CD11c חיוביים ל-CD14 עשויים להיות MDDCs מובחנים בשלב מוקדם שעדיין לא הורידו את הסמן המונוציטי CD14.

בעת ניתוח התאים החיוביים הבודדים CD11c, שיטת ההיצמדות נותנת את התשואה הגבוהה ביותר של תאים חיוביים CD11c, CD14 שליליים. תאים חיוביים בודדים אלה עשויים להיות MDDCs מובחנים בשלב מאוחר. לאחר השליטה, ניתן להשלים את טכניקות ההיצמדות והבידוד המגנטי תוך שלוש עד ארבע ושעה עד שעתיים בהתאמה אם הן מבוצעות כראוי.

בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שיהיו ציטוקינים טריים להתמיינות תאים דנדריטיים כל 48 שעות כאשר המדיום מתחדש. עבודה עם נוזלים מסוכנים ביולוגיים כמו דם, עלולה להזיק ביותר, ותמיד יש לנקוט בשימוש בציוד מגן אישי מתאים ובשיטות סילוק בעת ביצוע הליכים אלה. מחקר זה סולל את הדרך לחוקרים בתחום האימונולוגיה לחקור את השימוש במונוציטים אנושיים ובתאים דנדריטיים לטיפול טיפולי.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לייעל את בידוד המונוציטים האנושיים ליצירת אוכלוסיות שונות של תאים שמקורם במונוציטים במבחנה.