מיקרוסקופ אור גיליונות זריחה כדי ללכוד תמונות 4-מימדי של השפעות להתכוונן גזירה על הלב דג זברה המתפתח

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המכנוביולוגיה הלבבית ההתפתחותית, כגון אפנון מתח גזירה על טרבקולציה של הלב באמצעות איתות חריץ באמצעות מיקרוסקופ יריעת אור 4D. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאירה קטע דק של דגימה במישור של חמישה מיקרון, מה שמוביל לפחות הלבנת תמונות ונזק לצילום. בנוסף, האלגוריתם החישובי שלנו מאפשר לנו לשחזר לב של דג זברה פועם 4D.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות לקראת אבחון מחלות לב מולדות מכיוון שהיא מאפשרת הדמיה רציפה invivo של טרבקולציה לבבית בשלב התפתחותי מוקדם ועד לפנוטיפ המאוחר יותר. בדרך כלל, אנשים חדשים בטכניקה זו יגלו שקשה לדמיין חשיבה בתלת מימד לאורך זמן. בנוסף, לוקח זמן ליצור את המערכת וליישר אותה במדויק.

כדי להתחיל, הפרד את דג הזברה הזכר והנקבה במיכלי הרבייה באמצעות מחיצה. לאחר מכן, הרם את המפריד ואפשר לדג הזברה הזכר והנקבה להתרבות. אסוף את עוברי דג הזברה והזריק מורפולינו אוליגו לעובר כדי לעכב טרבקולציה.

לאחר מכן, הכינו ג'ל אגרוז של אחוז אחד על ידי הוספת גרם אחד של אגרוז ל-100 מיליליטר מים מזוקקים וחממו אותו עד שכל האגרוז נמס. הניחו לאגרוז להתקרר ולאחר מכן השתמשו בצינור של 20 מיקרוליטר כדי להעמיס צינור פלסטיק קטן עם אחד העוברים המוכנים והאגרוז. אבטח את הצינור על שלב המיקרוסקופ והשתמש במטרה עשר x.

כוונן את המטרה באמצעות הכפתור כך שהחלק העליון של העובר יהיה בפוקוס. צלם תמונות של עובר הדג כולו על פני מחזורי פעימות לב מרובים באמצעות יריעה קלה בעובי של חמישה מיקרון. אסוף 500 פריימים xy עם זמן חשיפה של עשר אלפיות השנייה.

לאחר מכן, העבר את השלב מיקרון אחד בגישה z לשכבה חדשה וחזור על הליך ההדמיה. המשך דמיין 500 פריימים למישור z עד שכל הלב יצולם במלואו. לאחר מכן, פתח את תוכנת עיבוד התמונה והתחל לערום את התמונות לתלת מימד.

כדי להשיג זאת, לחץ תחילה על נתונים פתוחים. כאן, בחר את כל התמונות שיש לערום בתלת-ממד ולאחר מכן בחר טען. לאחר מכן הוסף את גודל הווקסל של 0.65 על 0.65 על מיקרון אחד ולחץ על אישור.

הזנת גודל הווקסל הנכון היא קריטית לניתוח מדויק של תמונות התלת מימד. כעת, לחץ על תיבת התצוגה הרב-מימדית ודמיין את התמונה התלת מימדית. לחץ לחיצה ימנית על התיבה הכחולה של הפרוסה הכחולה נקודה אחת, בחר תצוגה ולאחר מכן לחץ על volran.

בתפריט העריכה, בחר אפשרויות ולאחר מכן ערוך את מפת הצבעים. התאם את הצבע באמצעות התיבות ולאחר מכן לחץ על אישור. בעודך בתוכנת עיבוד התמונה, לחץ על קובץ ופתח את נתוני סדרות הזמן.

בחר את ה-tiffs התלת-ממדיים שנוצרו זה עתה על ידי לחיצה על טען, והזן את אותו גודל ווקסל כמו קודם. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על התיבה הכחולה של נקודה אחת של tiff ולאחר מכן בחר תצוגה ואחריה volran. כעת, לחץ על ערוך.

בחר אפשרויות. ולאחר מכן בחר ערוך מפת צבעים. התאם את הצבע באמצעות התיבות ולאחר מכן לחץ על אישור.

לאחר מכן, לחץ לחיצה ימנית על פקד סדרת הזמן, לחץ על יוצר הסרטים ולחץ על כפתור ההפעלה כדי לצפות בסרט. לסיום, הוסף שם קובץ, גודל מסגרת, קצב פריימים, איכות שווה לאחד והזן מונוסקופי. לאחר מכן לחץ על החל.

לבסוף, ייצא את הסרטון. כוחות ביומכניים, כגון מתח גזירה המודינמי, מעורבים באופן אינטימי במורפוגנזה של הלב. כאן, נעשה שימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי של יריעות אור כדי לדמיין את הרכסים הטרבקולריים הבולטים לתוך לומן החדר 75 שעות לאחר ההפריה.

ב-100 שעות לאחר ההפריה ניתן לראות בבירור רשת טרבקולרית. בעובר שטופל במיקרו-הזרקת gata1aMO, ההמטופואיזיס והצמיגות מופחתים ב-90 אחוזים. ירידה זו בצמיגות החלישה את מתח הגזירה ההמודינמי, וכתוצאה מכך התחלה מאוחרת ורשת טרבקולרית פחות צפופה.

ניתן היה לשחזר את העיכוב והצפיפות של הרשת הטרבקולרית על ידי ויסות ביטוי גנים הקשור לדרגה גבוהה, הצלת היווצרות טרבקולרית ב-75 שעות לאחר ההפריה וב-100 שעות לאחר ההפריה. לפיכך, gata1a morpholino oligonucleotides הפחיתו את הכוחות ההמודינמיים המובילים לוויסות נמוך של איתות החריץ, בעוד ש-Nrg1-mRNA הציל גנים הקשורים לחריץ מוסדר והתחל מחדש את הטרבקולוגיה. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקת הדמיה זו תוך כשעתיים אם מבוצעת כראוי.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום התפתחות הלב לחקור את הגורמים בגן החריץ, האחראים להיווצרות תקינה של טרבקולציה בדג הזברה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ תאורת מישור סלקטיבי וליצור קבצי תמונה 4D. אל תשכח שעבודה עם לייזרים יכולה להיות מסוכנת ביותר.

ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות, כגון הרכבת משקפיים מתאימים, במהלך הליך זה.