מיקרוסקופ אור גיליונות זריחה כדי ללכוד תמונות 4-מימדי של השפעות להתכוונן גזירה על הלב דג זברה המתפתח
10 באוגוסט 2018
כאן, אנו מציגים פרוטוקול להמחיש פיתוח לבבות דג זברה 4-ממדים (4-D). הדמיה 4-D, באמצעות מיקרוסקופ אור גיליונות קרינה פלואורסצנטית (LSFM), לוקח תמונות תלת-ממדי (3-D) לאורך זמן, לשחזר לבבות המתפתח. אנו מראים איכותית, באופן כמותי שזה גזירה מפעילה חריץ endocardial איתות במהלך הפיתוח קאמרית, המקדם trabeculation הלב.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המכנוביולוגיה הלבבית ההתפתחותית, כגון אפנון מתח גזירה על טרבקולציה של הלב באמצעות איתות חריץ באמצעות מיקרוסקופ יריעת אור 4D. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאירה קטע דק של דגימה במישור של חמישה מיקרון, מה שמוביל לפחות הלבנת תמונות ונזק לצילום. בנוסף, האלגוריתם החישובי שלנו מאפשר לנו לשחזר לב של דג זברה פועם 4D.
ההשלכות של טכניקה זו משתרעות לקראת אבחון מחלות לב מולדות מכיוון שהיא מאפשרת הדמיה רציפה invivo של טרבקולציה לבבית בשלב התפתחותי מוקדם ועד לפנוטיפ המאוחר יותר. בדרך כלל, אנשים חדשים בטכניקה זו יגלו שקשה לדמיין חשיבה בתלת מימד לאורך זמן. בנוסף, לוקח זמן ליצור את המערכת וליישר אותה במדויק.
כדי להתחיל, הפרד את דג הזברה הזכר והנקבה במיכלי הרבייה באמצעות מחיצה. לאחר מכן, הרם את המפריד ואפשר לדג הזברה הזכר והנקבה להתרבות. אסוף את עוברי דג הזברה והזריק מורפולינו אוליגו לעובר כדי לעכב טרבקולציה.
לאחר מכן, הכינו ג'ל אגרוז של אחוז אחד על ידי הוספת גרם אחד של אגרוז ל-100 מיליליטר מים מזוקקים וחממו אותו עד שכל האגרוז נמס. הניחו לאגרוז להתקרר ולאחר מכן השתמשו בצינור של 20 מיקרוליטר כדי להעמיס צינור פלסטיק קטן עם אחד העוברים המוכנים והאגרוז. אבטח את הצינור על שלב המיקרוסקופ והשתמש במטרה עשר x.
כוונן את המטרה באמצעות הכפתור כך שהחלק העליון של העובר יהיה בפוקוס. צלם תמונות של עובר הדג כולו על פני מחזורי פעימות לב מרובים באמצעות יריעה קלה בעובי של חמישה מיקרון. אסוף 500 פריימים xy עם זמן חשיפה של עשר אלפיות השנייה.
לאחר מכן, העבר את השלב מיקרון אחד בגישה z לשכבה חדשה וחזור על הליך ההדמיה. המשך דמיין 500 פריימים למישור z עד שכל הלב יצולם במלואו. לאחר מכן, פתח את תוכנת עיבוד התמונה והתחל לערום את התמונות לתלת מימד.
כדי להשיג זאת, לחץ תחילה על נתונים פתוחים. כאן, בחר את כל התמונות שיש לערום בתלת-ממד ולאחר מכן בחר טען. לאחר מכן הוסף את גודל הווקסל של 0.65 על 0.65 על מיקרון אחד ולחץ על אישור.
הזנת גודל הווקסל הנכון היא קריטית לניתוח מדויק של תמונות התלת מימד. כעת, לחץ על תיבת התצוגה הרב-מימדית ודמיין את התמונה התלת מימדית. לחץ לחיצה ימנית על התיבה הכחולה של הפרוסה הכחולה נקודה אחת, בחר תצוגה ולאחר מכן לחץ על volran.
בתפריט העריכה, בחר אפשרויות ולאחר מכן ערוך את מפת הצבעים. התאם את הצבע באמצעות התיבות ולאחר מכן לחץ על אישור. בעודך בתוכנת עיבוד התמונה, לחץ על קובץ ופתח את נתוני סדרות הזמן.
בחר את ה-tiffs התלת-ממדיים שנוצרו זה עתה על ידי לחיצה על טען, והזן את אותו גודל ווקסל כמו קודם. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על התיבה הכחולה של נקודה אחת של tiff ולאחר מכן בחר תצוגה ואחריה volran. כעת, לחץ על ערוך.
בחר אפשרויות. ולאחר מכן בחר ערוך מפת צבעים. התאם את הצבע באמצעות התיבות ולאחר מכן לחץ על אישור.
לאחר מכן, לחץ לחיצה ימנית על פקד סדרת הזמן, לחץ על יוצר הסרטים ולחץ על כפתור ההפעלה כדי לצפות בסרט. לסיום, הוסף שם קובץ, גודל מסגרת, קצב פריימים, איכות שווה לאחד והזן מונוסקופי. לאחר מכן לחץ על החל.
לבסוף, ייצא את הסרטון. כוחות ביומכניים, כגון מתח גזירה המודינמי, מעורבים באופן אינטימי במורפוגנזה של הלב. כאן, נעשה שימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי של יריעות אור כדי לדמיין את הרכסים הטרבקולריים הבולטים לתוך לומן החדר 75 שעות לאחר ההפריה.
ב-100 שעות לאחר ההפריה ניתן לראות בבירור רשת טרבקולרית. בעובר שטופל במיקרו-הזרקת gata1aMO, ההמטופואיזיס והצמיגות מופחתים ב-90 אחוזים. ירידה זו בצמיגות החלישה את מתח הגזירה ההמודינמי, וכתוצאה מכך התחלה מאוחרת ורשת טרבקולרית פחות צפופה.
ניתן היה לשחזר את העיכוב והצפיפות של הרשת הטרבקולרית על ידי ויסות ביטוי גנים הקשור לדרגה גבוהה, הצלת היווצרות טרבקולרית ב-75 שעות לאחר ההפריה וב-100 שעות לאחר ההפריה. לפיכך, gata1a morpholino oligonucleotides הפחיתו את הכוחות ההמודינמיים המובילים לוויסות נמוך של איתות החריץ, בעוד ש-Nrg1-mRNA הציל גנים הקשורים לחריץ מוסדר והתחל מחדש את הטרבקולוגיה. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקת הדמיה זו תוך כשעתיים אם מבוצעת כראוי.
לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום התפתחות הלב לחקור את הגורמים בגן החריץ, האחראים להיווצרות תקינה של טרבקולציה בדג הזברה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ תאורת מישור סלקטיבי וליצור קבצי תמונה 4D. אל תשכח שעבודה עם לייזרים יכולה להיות מסוכנת ביותר.
ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות, כגון הרכבת משקפיים מתאימים, במהלך הליך זה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
מאמר זה מציג פרוטוקול לויזואליזציה של לב מתפתח בדגי זברה באמצעות מיקרוסקופיה בהירת-גיליון פלואורסצנטית 4-D (LSFM). השיטה מאפשרת שחזור של התפתחות הלב לאורך זמן, וחושפת את תפקיד המתח הגזירה בהפעלת איתות Notch האנדוקרדיאלי במהלך התפתחות החדרים.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- ביולוגיה התפתחותית
- מכניקה ביולוגית של הלב
- טכניקות הדמיה
רקע
- הבנת התפתחות הלב חיונית לאבחון מחלות לב מולדות.
- מתח גזירה משפיע על טרבקולציה לבבית דרך איתות Notch.
- הדמיה 4-D מספקת תובנות לתהליכים ביולוגיים דינמיים.
- מיקרוסקופיית גיליון בהיר ממזערת דיעור פוטו ונזק.
מטרת המחקר
- לויזואליזציה של התפתחות הלב בדגי זברה בזמן אמת.
- לחקור את ההשפעות של מתח גזירה על טרבקולציה לבבית.
- לפתח אלגוריתם חישובי לשחזור לב 4-D.
שיטות ששימשו
- מיקרוסקופיה בהירת-גיליון פלואורסצנטית 4-D (LSFM).
- שחזור של לבבות דגי זברה מכותים באמצעות אלגוריתמים חישוביים.
- ויזואליזציה רציפה של שלבי התפתחות לבבית.
- ניתוח של השפעות מתח גזירה על איתות Notch.
תוצאות עיקריות
- מתח גזירה מפעיל איתות Notch אנדוקרדיאלי במהלך התפתחות חדרי הלב.
- שיטת ההדמיה 4-D מאפשרת תצפית מפורטת של טרבקולציה לבבית.
- דיעור פוטו מופחת ונזק משופרים את איכות ההדמיה.
- השיטה מסייעת בהבנת מנגנוני מחלות לב מולדות.
מסקנות
- שיטת ה-LSFM 4-D היא כלי רב עוצמה לחקר התפתחות הלב.
- התובנות שהושגו עשויות להוביל לשיטות אבחון טובות יותר עבור מחלות לב מולדות.
- יישומים עתידיים עשויים להתרחב לתחומים אחרים של ביולוגיה התפתחותית.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Understanding hemodynamic forces in cardiac development provides mechanistic insights into congenital heart disease pathways, supporting target validation in preclinical models. Light-sheet fluorescence microscopy enables quantitative, dynamic visualization of shear stress effects on Notch signaling, a pathway implicated in ventricular non-compaction. This approach enhances predictive confidence in early discovery by linking biomechanical inputs to molecular outputs in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates the causal relationship between hemodynamic shear stress and Notch signaling in trabeculation formation.
- Operational Value: Enables phenotypic screening of genetic and pharmacological modulators of cardiac morphogenesis.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by visualizing how reduced shear stress down-regulates Notch target genes and attenuates trabeculation.
- Operational Value: Facilitates rescue experiments, such as Nrg1 mRNA co-injection, to confirm target pathway specificity and reversibility.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative 4-D readouts of trabecular density and initiation timing for dose-response analysis.
- Operational Value: Standardizes imaging protocols across experimental conditions using synchronized light-sheet acquisition and voxel-based reconstruction.
- Scientific Value: Enables shear stress modulation via gata1a-MO to create controlled hypodynamic conditions for assay validation.
- Operational Value: Produces scalable, reproducible 3D+time datasets suitable for high-content analysis pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects endothelial Notch gene expression under pulsatile flow to in vivo trabeculation phenotypes, strengthening translational continuity.
- Operational Value: Provides a preclinical zebrafish model for studying Left Ventricular Non-Compaction Cardiomyopathy mechanisms.
- Scientific Value: Enables risk-adjusted advancement decisions by correlating molecular rescue (e.g., Nrg1) with phenotypic recovery of trabeculation.
- Operational Value: Supports cross-functional collaboration through shared 4-D visualization platforms for cardiology, genetics, and bioengineering teams.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis testing of mechanotransduction pathways in cardiac development, bridging phenotypic screening to target validation.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by visualizing how shear stress modulates Notch signaling during ventricular chamber formation.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs on trabecular network dynamics for compound or genetic modifier evaluation.
- Analytics: Generates synchronized 4-D image stacks with voxel-scale precision, enabling statistical comparison of hemodynamic conditions.
- Translational Research: Links in vivo trabeculation phenotypes to in vitro endothelial flow responses, supporting biomarker alignment studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for studying hemodynamic influences across developmental and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in mechanobiological pathway interpretation.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through synchronized 4-D acquisition and computational reconstruction.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early phenotypic assessment of cardiac morphogenesis modifiers.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets involved in shear stress-Notch-trabeculation axes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryology, microinjection techniques, and light-sheet microscopy alignment.
- Dependent on specialized instrumentation including selective plane illumination microscopy and high-speed sCMOS cameras.
- Necessitates cross-team standardization of image acquisition parameters, voxel sizing, and time-series synchronization.
- Involves adaptation considerations when translating protocols across different genetic backgrounds or disease models.
- Limited by the physical accessibility of the embryonic heart and the need for precise temporal sampling across cardiac cycles.
