המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי במישורים נתמך bilayers
31 באוקטובר 2015
הכנת שכבות דו-שכבתיות של שומנים מישוריים הנתמכים בזכוכית מתפקדת בחלבון, קביעת ניידות החלבון בפנים ומדידת צפיפות החלבון מוצגת כאן. מתוארת מפת דרכים לבניית מיקרוסקופ השתקפות פנימית כוללת מופחת רעש, המאפשרת הדמיה של פלואורוכרומים דו-שכבתיים בודדים ברזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה.
בסרטון זה נראה כיצד להכין ולאפיין דו-צדדי ליפידים נתמכים במישור ביו-פונקציונלי. כמו כן, נתאר בפירוט את הארכיטקטורה של מיקרוסקופ השתקפות פנימי כולל עם יכולות זיהוי מולקולה בודדת. נמדוד את צפיפות כוח העירור, הנזילות וצפיפות החלבון של בלי השומנים.
נתחיל בהקדמה הקצרה לזכוכית מישורית נתמכת שומנים בליי. כאשר שלפוחיות חד-לנאריות-קטנות נתקלות במשטח זכוכית נקי, הן מתפוצצות ומתפשטות ליצירת שכבת שומנים רציפה. על כרית מים, אנו בוחרים בדרך כלל בחומר דקל.
ל-Ole phosphocholine או POPC יש את השומן השולט מכיוון שהוא מוליד שכבות דו-שכבתיות של שומנים נוזליים בטמפרטורת החדר וב-37 מעלות צלזיוס. לצורך פונקציונליזציה, אנו מוסיפים ניקל אנטיאוקסיד, ליפיד סינתטי עם קבוצת ראש ניקל כלאט, הקושר חלבוני תג פולי היסטמין. לדוגמה, מולקולת הגירוי המשותף B שבע אחת, מולקולת ההדבקה, ICAM אחת, ומולקולת MHC טעונה פפטיד פלואורסצנטית לזיהוי תאי T כפי שמוצג כאן, עם זאת, ניתן להשתמש במערכת דו-שכבתית זו באופן עקרוני כדי לטפל בתהליכים שונים לחלוטין במגוון מערכות ביולוגיות.
בשל אופי המערכת המישורית, ניתן לנטר אירועי פלואורסצנטיות במצב השתקפות פנימית כוללת, מה שמפחית את הרקע התאי באופן משמעותי ומתאים מאוד למיקרוסקופיה פלואורסצנטית של מולקולה בודדת להכנת שומנים, אחד צריך את השומנים, POPC וניקל אנטי-אוקסידנט כלורופורם, ובקבוק תחתון עגול נקי ממיס את השומנים ביחס הרצוי וכלורופורם ומייבש אותם בוואקום כפי שמוצג כאן. לאחר טיפול בוואקום גבוה למשך הלילה, השומנים יוצרים סרט בחלק הפנימי של הבקבוק. להתייבשות שומנים, השתמש ב-Degas PBS ב-10 מיליליטר של Degas PBS לתערובת השומנים המיובשת.
אין לערבב. כעת, כדי למנוע חמצון שומנים, מלאו את הבקבוק בגז אינרטי כמו חנקן או ארגון סובבו את הבקבוק. השומנים יוצרים תרחיף חלבי.
קח דגימה קטנה כריק עבור הספקטרופוטומטר כדי למנוע חילופי גזים בשלב הבא. חשוב מאוד לאטום כראוי את הבקבוק המכיל את תרחיף השומנים. השתמש בסרט דביק יציב בחום, למשל, סרט חיטוי שבו הגנת אוויר במהלך היווצרות פיזית באמצעות אמבטיה אולטרסאונד סגורה.
לאחר הרכבת הבקבוק, התחל את הליך הסוניקציה בהספק מרבי של 170 וואט. סוניק קייד במשך 60 דקות. עקב היווצרות פיזית, העכירות ירדה משמעותית.
ניתן לאמת זאת על ידי פוטומטריית ספקטרו ב-550 ננומטר. השתמש ב-aliquot שנלקח לפני הסוניקציה כריק. הצפיפות האופטית ב-230 ננומטר, המעידה על כמות השומנים צריכה להישאר קבועה.
כאן אנו ממלאים צינורות אולטרה צנטריפוגה קטנים במתלה מיליליטר אחד ומניחים אותם ברוטור זווית קבועה של אולטרה צנטריפוגה שולחנית. חשוב מאוד להשתמש רק בשלפוחיות חד-שכבתיות קטנות להכנה דו-שכבתית. שלפוחיות רב-שכבתיות גדולות וצפופות יותר, הנוצרות גם במהלך סוניקציה, מפריעות לנזילות דו-שכבתית ולכן יש להחוויר אותן ולהסיר אותן על ידי צנטריפוגה.
ראשית, אנו מסתובבים במשך שעה בחום של 150, 000 גרם בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הצנטריפוגה המתקבלת עוברת צנטריפוגה למשך שמונה שעות נוספות בטמפרטורה של 288,000 גרם בארבע מעלות צלזיוס. נורות זכוכית חייבות להיות נקיות מאוד לפני ששלפוחיות שומנים יכולות להתפשט עליהן ליצירת שכבה דו-שכבתית רציפה ונוזלית.
לשם כך, אנו מניחים החלקות כיסוי לתוך תלולית טפלון, אותה אנו מכניסים לאחר מכן לתרגיל כלי זכוכית. זהירות רבה היכן שהגנה על העיניים, כפפות הגנה ומעיל מעבדה ועבודה בארון כימי. אנו מוסיפים חלק אחד של מי חמצן 30%, ולאחר מכן שלושה חלקים של חומצה גופרתית מרוכזת כדי להוליד חומצה פריו מונו-גופרתית תגובתית וחמצונית מאוד.
תערובת זו מגיבה באלימות עם חומרים אורגניים, כולל אלה של העור, העיניים והבגדים שלך. זה מתחמם מיד. דגרו על המגלשות למשך 30 דקות.
תפוס את פתק הכיסוי בעזרת כוח שטפו היטב את החומצה משני צידי החלקת הכיסוי הנקייה באמצעות מים מזוקקים W או מאוחדים באיכות גבוהה. לאחר מכן הנח את השקופית על מעמד טפלון ותן לה להתייבש לא יותר מ-10 דקות כדי שתוכל לייצר מספר שכבות דו-שכבתיות בודדות של שומנים בבת אחת. אנו מדביקים החלקות כיסוי מיובשות עם התקשות מהירה.
דבק אפוקסי דו-רכיבי לתא טכני של שמונה בארות או מעבדה של 16 בארות. ראשית, הסר את מגלשת הזכוכית המקורית בזהירות מהמסגרת שלה. מערבבים את שני מרכיבי הדבק ביחס של אחד לאחד.
מורחים אותו באופן שווה לחריצים התחתונים של מסגרת החדר. הנח את החלקת הכיסוי הנקייה על החלק התחתון המכוסה בדבק של מסגרת החדר. ודא שהדבק מפוזר באופן שווה בין מגלשת הזכוכית למסגרת הפלסטיק.
תן לדבק להתקשות במשך 30 דקות. לדלל את המתלה הפיזי השומני ב-PBS 1 עד 10 ולסנן אותו דרך מסנן 0.2 מיקרון ב-120 מיקרוליטר של דילול זה לכל באר של תא שמונה בארות או 60 מיקרוליטר לכל באר של תא של 16 בארות. ודא שכל משטח הזכוכית מכוסה והמתן 20 דקות.
כעת נוצרה השכבה הדו-שכבתית כדי להיפטר משאריות לס יש לשטוף כל באר עם 30 מיליליטר PBS. הימנע מחשיפה לאוויר של משטח הזכוכית בכל מחיר. זה יהרוס באופן מיידי את השכבה הדו-שכבתית כדי להבטיח שכל באר מכילה את אותו נפח חיץ לשלב קישוט החלבון הבא, מלאו כל באר לחלוטין והסירו את כיפת הנוזל.
הוצא 330 מיקרוליטר. זה ישאיר כ -350 מיקרוליטר בתוך כל אחד. ובכן כדי לקשט את השכבה הדו-שכבתית בחלבונים, הכינו תערובת מאסטר המכילה חלבוני פולי היסטמין טק לבחירה והוסיפו 50 מיקרוליטר ממנה לכל באר.
חלבונים נקשרים לקבוצת הניקל נגד ראש של השומן הכהה כדי להבטיח תוצאות ניתנות לשחזור מעורבבות ביסודיות אך בזהירות ותמיד דוגרות למשך 60 דקות כדי להסיר חלבונים לא קשורים. שוטפים שוב עם 30 מיליליטר PBS. הבה נתמקד כעת בחומרת המיקרוסקופיה.
ראשית, נדגים את הדרישות של מיקרוסקופ השתקפות פנימי כולל למיקרוסקופ דשא מבוסס אובייקטיבי. צריך יעד טבילה בשמן עם צמצם מספרי גבוה. קרן עירור הלייזר הנכנסת משתקפת על ידי המראה הדיכרואית וממוקדת באמצעות סט של שתיים או שלוש עדשות על מישור המוקד האחורי של האובייקט בלבד.
ואז אור הלייזר מוביל את המטרה כקרן מצופה לאורך הציר האופטי. בדרך זו, הדגימה הפלואורסצנטית מוארת במלוא עומקה. כאשר אתה מעביר את הקרן בניצב לציר האופטי, הקרן נשארת נאספת, אך עוזבת את המטרה בצורה מוטה.
אם תמשיך להמיר, תגיע בשלב מסוים לזווית הקריטית שבה הקרן משתקפת לחלוטין בממשק שבין החלקת כיסוי הזכוכית לדגימה. עוצמת הגל החולף שנוצר דועכת באופן אקספוננציאלי ורק קומה ארבע, הנמצאת בקרבת הממשק עד כמה מאות ננומטרים, מתרגשת. כעת, אנו מדגימים כיצד למקד את קרן הלייזר באופן ידני למישור המוקד האחורי של המטרה.
באמצעות שלוש או שתיים עדשות עם שתי העדשות הראשונות, קוטר קרן הלייזר גדל. היחס בין אורך המוקד שלהם קובע את גודל נקודת ההארה במישור הדגימה. כדי להבטיח שהקרן תישאר אסופה כוונן את המרחק בין עדשות אלו כך שהוא יהיה שווה לסכום של שני אורך המוקד.
העדשה השלישית משמשת למיקוד הקרן המורחבת למישור המוקד האחורי של המטרה. מכיוון שאורך המוקד של עדשה זו צריך להתאים לממדי גוף המיקרוסקופ וזה של פריסקופ קשור, הוא חייב להיות ארוך בהרבה במקרה שלנו, 75 סנטימטרים משתנים. למרחק בין עדשה שתיים לשלוש אין השפעה על תכונות האלומה.
לכן, ניתן להשתמש במרחב האינסוף שביניהם כדי לשנות את האלומה בצורה מוגדרת ללא עיוותים. לדוגמה, אתה יכול להכניס צמצם ולהקרין במדויק על מישור הדגימה. בעיקרו של דבר, אתה יכול להשיג את אותו הדבר באמצעות שתי עדשות במקום שלוש.
מערכת שתי העדשות פחות מוגדרת אך מציגה פחות סטיות עדשה. תכונות פשוטות כגון צמצם עדיין יכולות להיות מיושמות היטב עבור אפנון זמני. יש למקם לייזר גז, ברזל או מצב מוצק מול תריס טווח אלפיות השנייה, למשלample, תריס מכני או מאפנן אופטי.
אלטרנטיבה טובה היא לייזר דיודה, הניתן לאפנון אלקטרוני ואינו זקוק לסגירה חיצונית. מספיקות שתי מראות כדי לכוון את הקרן לכל מקום ולכל כיוון. כפי שצוין קודם, שתי העדשות משמשות להרחבת האלומה ולמיקוד שלה במישור המוקד האחורי של המיקרוסקופ. המטרה.
אנו יכולים להעביר את האלומה לתצורת דשא על ידי הזזת המראה התחתונה של הפריסקופ על מסילה אופטית. לזיהוי תמונה, אנו משתמשים במצלמה רגישה במיוחד. לדוגמה, ניתן ליישר מכשיר מצמד מטען מכפיל אלקטרונים או קרן לייזר שנייה של EM CCDA באורך גל שונה לנתיב האלומה.
עם שימוש במראות וכיסוי דיכרואי. לזיהוי שני צבעים בו זמנית, אנו מציבים מכשיר פיצול אלומה זמין מסחרית לנתיב הפליטה. לניסויים, זה מאוד שימושי שיהיו שני נתיבי אלומת עירור עצמאיים במקום.
לדוגמה, אחד להדמיית דשא והשני להלבנה או הפעלה ממוקדת של פוטו. ניתן להשיג זאת בקלות על ידי יישום סט של 2 50 50 מפצלי אלומה. כפי שמוצג באיור שלנו, שתי מערכות התאמת עדשות ומראה שונות יובילו לשני פרופילי אלומה בודדים וזוויות אלומה.
לדוגמה, אחד מורחב להדמיה בדשא ואחד ממוקד יותר להלבנה או הפעלה ללא דשא. ניתן למקם צמצם בקורה שאינה דשא כדי לעצב במדויק את נקודת ההלבנה או ההפעלה. שני תריסים נוספים, אחד לכל נתיב אלומה מאפשרים מתג בקרה עצמאי על קרן הלייזר, ומשאירים את המטרה בנתיב ישר ללא הטיה.
הפעל את מד הכוח והתאם אותו לאורך גל הלייזר המתאים. מדוד את עוצמת אור הלייזר במטרה ורשום אותו. כעת, העבירו את המראה מאחורי המיקרוסקופ כדי להטות את קרן הלייזר במטרה למצב הדשא.
לעולם אל תסתכל ישירות לתוך אור הלייזר. בפינה הימנית התחתונה, אתה רואה את פרופיל העוצמה של לייזר העירור כפי שמוצג באמצעות פליטה של שכבה דו-שכבתית מעוטרת בחלבונים פלואורסצנטיים. כאן אנו משתמשים בייצוג צבע כוזב כדי להדגיש אזורים בעוצמות שונות.
מדוד את העוצמה הממוצעת של הרקע באזור עניין גדול מספיק. ערך זה תלוי בהגדרות מצלמה ספציפיות כגון רווח EM ומהירות קריאה ויהיה צורך להפחית אותו מכל העוצמות הנמדדות. קבע את העוצמה הממוצעת בכל האזור המואר.
בחר את הקוטר גדול מספיק כדי שערכי העוצמה בפריפריה יהיו דומים לאלה של רקע המצלמה, מדדו את העוצמה הממוצעת של האזור המרכזי. אזור זה מגדיר את אזור העניין בו יבוצעו ניסויי מיקרוסקופיה מאוחר יותר. כעת, הפחיתו את ערך עוצמת הרקע הממוצע מהעוצמות של האזור שהוסר והאזור המרכזי.
לאחר מכן, הכפל את העוצמות המתוקנות ברקע במספר הפיקסלים המתאים של גודל האזור כדי להגיע לעוצמות משולבות. הגדר את העוצמה המשולבת של האזור המואר כאחד וחשב את השבר עבור האזור המרכזי. ההספק נמדד באמצעות מד הכוח.
במקרה שלנו חמישה מילי-וואט עומדים ביחס ישר לעוצמה המשולבת של כל האזור המואר. הכפל ערך זה בשבריר ההספק של האזור המרכזי כדי לקבוע את ההספק בתוך האזור המרכזי. בדוגמה שלנו, 1.15 מילי-וואט, הגורם להמרת מספר הפיקסלים למיקרונים מרובעים תלוי בגודל הפיקסלים בפועל של שבב המצלמה ובהגדלה של מסלול הפליטה.
ניתן לקבוע זאת בקלות באמצעות שקופית מיקרומטר. בדוגמה שלנו, השטח המרכזי מתאים ל-170.8 מיקרון רבוע. צפיפות ההספק מתייחסת להספק הנמדד חלקי השטח ובכך שווה ל -1.15 מיליוואט חלקי 170.8 מיקרון רבוע או 0.007 מיליוואט למיקרון מרובע.
כלומר 0.7 קילוואט לסנטימטר מרובע. כדי לקבוע את הנזילות של השכבה הדו-שכבתית, אנו מבצעים התאוששות פלואורסצנטית לאחר ניסוי פוטו-הלבנה של עטיפה. כפי שמוצג בסרט השמאלי התחתון, אנו מדמים את הדו-שכבת הפלואורסצנטית בצפיפות הספק נמוכה.
בסרט הימני התחתון, אתה יכול לראות את התא הטכני המתאים של המעבדה במיקרוסקופ. לאחר מכן אנו מלבינים אזור מעגלי עם הפולסים הקצרים בצפיפות הספק גבוהה ועוקבים אחר ההתאוששות בצפיפות הספק נמוכה. שוב, המונטאז' מספק סקירה כללית של הניסוי לנקודות זמן שונות כאשר זמן אפס הוא פעימות האקונומיקה.
אנו מכמתים את עוצמת הקרינה הממוצעת המתוקנת ברקע בתוך מעגל הסימנים ומנרמלים את כל העוצמות הנמדדות לעוצמה בתחילת הניסוי. לפני פעימות האקונומיקה, אנו משרטטים את ערכי העוצמה המנורמלים מול הזמן. ערך הרוויה מייצג את השבר הנייד במקרה שלנו מעל 90%ראשית, צלם תמונה של השכבה הדו-שכבתית בצפיפות כוח עירור נמוכה.
לדוגמה, על ידי הצבת מסנן צפיפות אופטית עם ערך הנחתה לוגריתמי של שתיים, זה מפחית את ההספק בפקטור של 100. זמן החשיפה צריך להיות קבוע לאורך כל ההליך ומספיק כדי לדמות כוח נוזל בודד בצפיפות ההספק הלא מוחלשת במקרה שלנו, 10 אלפיות השנייה ב-0.7 קילוואט לסנטימטר מרובע. השתמש בייצוג צבע כוזב כדי להדגיש אזורים בעוצמות שונות.
בחר אזור עניין אחד שבו יבוצעו מאוחר יותר מדידות של מולקולה בודדת ואזור אחד באותו גודל. עבור חיסור רקע, חשב את העוצמה המשולבת המופחתת ברקע. כעת הסר את מסנן הצפיפות האופטית מנתיב אלומת העירור, הלבין את האזור וצלם תמונה.
אתה תראה כוח שפעת בודד מתפזר באזור המולבן. כוח שפעת בודד מוגבל בעקיפה בקוטר טיפוסי של שניים עד שלושה פיקסלים, קח אזור אחד של שבעה על שבעה פיקסלים סביב כל אות מולקולה בודדת והאזור השני קרוב. לחיסור רקע, חשוב לכמת את האות של כוח פלואור בודד בלבד.
לכן, עדיף לדמות חלבונים בשכבת ה-BI עם יחס לחלבון של פחות מאחד או עבור חלבונים המסומנים במיוחד ב-SAT. אפילו יותר יחס תזונה לחלבון של אחד כפי שמוצג בדוגמה שלנו, למדוד את העוצמות המשולבות עבור שני האזורים ולהחסיר את הרקע מהאות כדי לא לקחת את האירוע האחרון שנצפה בדוגמה שלנו מכיוון שהלבנה כנראה התרחשה במהלך ממוצע החשיפה. האותות המתוקנים כאן, אנו עושים זאת עבור שפעת אחת של ארבע, אותה אנו צופים על פני תשע פריימים.
עם זאת, יש לבצע הליך זה עבור לפחות כמה מאות אירועי מולקולה בודדת. בואו נחזור לתמונה הדו-שכבתית המקורית שלנו שנצפתה בצפיפות כוח עירור מוחלשת. הצפיפות המולקולרית נקבעת על ידי תיקון העוצמה המשולבת של אזור העניין לצפיפות כוח עירור נמוכה באמצעות כפל במאה וחלוקתו בעוצמת המולקולה הבודדת הממוצעת והשטח.
אנו עוסקים בצפיפות של 421.4 כוח פלואור למיקרון מרובע. בדוגמה שלנו, עם יחס תזונה לחלבון של אחד, זה שווה לאותו מספר מולקולות למיקרון רבוע. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות מסוגל להכין ולאפיין שכבת שומנים פונקציונלית של חלבון באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של מולקולה אחת.
יתר על כן, כדאי להכיר את העקרונות הבסיסיים לשינוי ושדרוג מיקרוסקופ סטנדרטי למטרה זו. מאוחר יותר נשתמש במתודולוגיה זו כדי לקבוע את קינטיקה הקישור של אנטיגן קשור דו-שכבתי לקולטני תאי T הקשורים לתאים, אך יישומים רבים אחרים המבוססים על כך בהחלט אפשריים.
סקירה
מאמר זה מדגים את ההכנה והאפיון של דו-שכבות שומן מתוכננות על גבי תומך שטוח. הוא גם מתאר את הארכיטקטורה של מיקרוסקופ השתקפות פנימית מוחלטת המיועד לזיהוי מולקולות בודדות.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביאופיזיקה
- טכניקות מיקרוסקופיות
רקע
- דו-שכבות שומן מתוכננות על גבי תומך הן חיוניות לחקר חלבוני קרום.
- התפקוד מאפשר אינטראקציות מסוימות עם חלבונים.
- מיקרוסקופיה של השתקפות פנימית מוחלטת ממזערת רעש רקע לצורך שיפור ההדמיה.
- חלבונים מסומנים בפלואורסצנטיות ניתנים לצפייה ברזולוציה גבוהה.
מטרת המחקר
- להכין דו-שכבת שומן יציבה לחקר חלבונים.
- לאפיין את תנועת החלבונים והצפיפות בתוך הדו-שכבה.
- לפתח מערך מיקרוסקופיה עם רעש מופחת לזיהוי מולקולות בודדות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת דו-שכבות שומן באמצעות שלפוחיות חד-שכבתיות קטנות.
- התפקוד עם ליפידים קושרת ניקל לקישור חלבונים.
- אפיון דו-שכבות השומן באמצעות סוניקציה וצנטריפוגה.
- יישום מיקרוסקופיה של השתקפות פנימית מוחלטת להדמיה.
תוצאות עיקריות
- היווצרות מוצלחת של דו-שכבות שומן נוזליות על משטחי זכוכית.
- אפיון של קישור חלבונים ותנועה בתוך הדו-שכבה.
- הוכחת יכולות אפקטיביות לזיהוי מולקולות בודדות.
- ביסוס פרוטוקול להכנת דו-שכבות שומן חוזרות ונשנות.
מסקנות
- השיטה מספקת פלטפורמה אמינה לחקר חלבוני קרום.
- טכניקות הדמיה ברזולוציה גבוהה משפרות את ההבנה שלנו על הדינמיקה של החלבונים.
- גישה זו יכולה להתאים למגוון יישומים ביולוגיים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Single molecule fluorescence microscopy on planar supported lipid bilayers enables direct visualization of membrane protein dynamics at near-native conditions, providing critical mechanistic insights for target validation in immunology and cell signaling. This approach reduces biological ambiguity by quantifying protein mobility, density, and interactions in a reproducible, noise-reduced format, supporting early-stage go/no-go decisions in discovery pipelines. The method’s compatibility with total internal reflection fluorescence (TIRF) allows scalable, label-efficient screening of protein-ligand or protein-protein interactions relevant to therapeutic target de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct observation of protein binding and mobility in lipid bilayers functionalized with nickel-chelating lipids, supporting mechanistic interrogation of targets like ICAM-1 and MHC-peptide complexes.
- Operational Value: Uses recombinant polyhistidine-tagged proteins for specific, oriented immobilization via nickel-antiox lipids, ensuring reproducible presentation of therapeutic targets.
- Predictive Value: Quantifies protein density (e.g., 421 molecules/µm²) and mobile fraction (>90% in FRAP), providing biophysical benchmarks for target engagement and complex stability.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates highly mobile, protein-functionalized bilayers in a standardized format via sonication, centrifugation, and controlled vesicle fusion, enabling batch-to-batch consistency.
- Quantitative Output: Measures single-molecule fluorescence intensities and diffusion characteristics, allowing detection of binding events and conformational changes at physiological relevance.
- Scalability: Compatible with multi-well chamber formats (8- or 16-well) using epoxy-anchored coverslips, supporting parallelization for ligand screening or mutant analysis.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly applicable to immune synapse formation studies involving co-stimulatory molecules (B7-1) and adhesion molecules (ICAM-1), informing biologics or small molecule modulation strategies.
- Mechanistic De-risking: Enables real-time tracking of protein diffusion and binding kinetics, reducing uncertainty in target mechanism prior to cellular or animal model validation.
- Translational Continuity: Bridges purified protein biochemistry and cellular assays by maintaining native-like lipid environment and physiological protein densities.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, particularly for membrane-associated proteins where native conformation and lateral mobility are critical to function.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by visualizing protein clustering, diffusion, and ligand-induced changes in model membranes that mimic the plasma membrane.
- Screening: Enables assay development for binding affinity and kinetics using single-molecule sensitivity, with background suppression via TIRF illumination.
- Analytics: Provides integrated intensity measurements, diffusion coefficients, and mobile fractions that quantify target behavior under defined lipid compositions.
- Translational Research: Maintains relevance to physiological contexts by preserving protein orientation and mobility, facilitating extrapolation to cell-based systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying diverse membrane proteins (e.g., receptors, adhesion molecules) across projects through standardized lipid formulation and functionalization chemistry.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in membrane protein studies by providing direct, quantitative single-molecule data in a biomimetic environment.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized lipid hydration, sonication, centrifugation, and surface passivation steps, minimizing variability in bilayer formation.
- Strategic Value: Improves target selection confidence by enabling early biophysical characterization that informs downstream assay design and lead optimization.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets by delivering empirical data on protein stability, mobility, and ligand accessibility.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lipid handling, sonication protocols, and surface chemistry to achieve uniform, fluid bilayers without multilamellar vesicle contamination.
- Depends on access to TIRF-capable microscopy with sensitive detection (e.g., EMCCD), laser alignment systems, and environmental controls for long-term imaging.
- Necessitates standardization of protein labeling density (e.g., His-tag:NIILS ratio ≤1) to avoid artifacts from overcrowding or aggregation during functionalization.
- Must account for lipid oxidation risks during preparation, mitigated by inert gas flushing and prompt use of sonicated suspensions.
- Limited to extracellular or peripherally associated membrane proteins; not suitable for transmembrane domain structural studies requiring native bilayer thickness or asymmetric lipid composition.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
0:23
Introduction
1:36
Vesicle Preparation
4:22
Bilayer Preparation
8:12
Principles of Total Internal Reflection Microscopy
10:44
Architectural of the Microscopy System
12:41
Power Measurement
15:38
Measurement Bilayer Fluidity
16:39
Measurement Protein Density on the Bilayer
19:25
Conclusion
