המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי במישורים נתמך bilayers

בסרטון זה נראה כיצד להכין ולאפיין דו-צדדי ליפידים נתמכים במישור ביו-פונקציונלי. כמו כן, נתאר בפירוט את הארכיטקטורה של מיקרוסקופ השתקפות פנימי כולל עם יכולות זיהוי מולקולה בודדת. נמדוד את צפיפות כוח העירור, הנזילות וצפיפות החלבון של בלי השומנים.

נתחיל בהקדמה הקצרה לזכוכית מישורית נתמכת שומנים בליי. כאשר שלפוחיות חד-לנאריות-קטנות נתקלות במשטח זכוכית נקי, הן מתפוצצות ומתפשטות ליצירת שכבת שומנים רציפה. על כרית מים, אנו בוחרים בדרך כלל בחומר דקל.

ל-Ole phosphocholine או POPC יש את השומן השולט מכיוון שהוא מוליד שכבות דו-שכבתיות של שומנים נוזליים בטמפרטורת החדר וב-37 מעלות צלזיוס. לצורך פונקציונליזציה, אנו מוסיפים ניקל אנטיאוקסיד, ליפיד סינתטי עם קבוצת ראש ניקל כלאט, הקושר חלבוני תג פולי היסטמין. לדוגמה, מולקולת הגירוי המשותף B שבע אחת, מולקולת ההדבקה, ICAM אחת, ומולקולת MHC טעונה פפטיד פלואורסצנטית לזיהוי תאי T כפי שמוצג כאן, עם זאת, ניתן להשתמש במערכת דו-שכבתית זו באופן עקרוני כדי לטפל בתהליכים שונים לחלוטין במגוון מערכות ביולוגיות.

בשל אופי המערכת המישורית, ניתן לנטר אירועי פלואורסצנטיות במצב השתקפות פנימית כוללת, מה שמפחית את הרקע התאי באופן משמעותי ומתאים מאוד למיקרוסקופיה פלואורסצנטית של מולקולה בודדת להכנת שומנים, אחד צריך את השומנים, POPC וניקל אנטי-אוקסידנט כלורופורם, ובקבוק תחתון עגול נקי ממיס את השומנים ביחס הרצוי וכלורופורם ומייבש אותם בוואקום כפי שמוצג כאן. לאחר טיפול בוואקום גבוה למשך הלילה, השומנים יוצרים סרט בחלק הפנימי של הבקבוק. להתייבשות שומנים, השתמש ב-Degas PBS ב-10 מיליליטר של Degas PBS לתערובת השומנים המיובשת.

אין לערבב. כעת, כדי למנוע חמצון שומנים, מלאו את הבקבוק בגז אינרטי כמו חנקן או ארגון סובבו את הבקבוק. השומנים יוצרים תרחיף חלבי.

קח דגימה קטנה כריק עבור הספקטרופוטומטר כדי למנוע חילופי גזים בשלב הבא. חשוב מאוד לאטום כראוי את הבקבוק המכיל את תרחיף השומנים. השתמש בסרט דביק יציב בחום, למשל, סרט חיטוי שבו הגנת אוויר במהלך היווצרות פיזית באמצעות אמבטיה אולטרסאונד סגורה.

לאחר הרכבת הבקבוק, התחל את הליך הסוניקציה בהספק מרבי של 170 וואט. סוניק קייד במשך 60 דקות. עקב היווצרות פיזית, העכירות ירדה משמעותית.

ניתן לאמת זאת על ידי פוטומטריית ספקטרו ב-550 ננומטר. השתמש ב-aliquot שנלקח לפני הסוניקציה כריק. הצפיפות האופטית ב-230 ננומטר, המעידה על כמות השומנים צריכה להישאר קבועה.

כאן אנו ממלאים צינורות אולטרה צנטריפוגה קטנים במתלה מיליליטר אחד ומניחים אותם ברוטור זווית קבועה של אולטרה צנטריפוגה שולחנית. חשוב מאוד להשתמש רק בשלפוחיות חד-שכבתיות קטנות להכנה דו-שכבתית. שלפוחיות רב-שכבתיות גדולות וצפופות יותר, הנוצרות גם במהלך סוניקציה, מפריעות לנזילות דו-שכבתית ולכן יש להחוויר אותן ולהסיר אותן על ידי צנטריפוגה.

ראשית, אנו מסתובבים במשך שעה בחום של 150, 000 גרם בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הצנטריפוגה המתקבלת עוברת צנטריפוגה למשך שמונה שעות נוספות בטמפרטורה של 288,000 גרם בארבע מעלות צלזיוס. נורות זכוכית חייבות להיות נקיות מאוד לפני ששלפוחיות שומנים יכולות להתפשט עליהן ליצירת שכבה דו-שכבתית רציפה ונוזלית.

לשם כך, אנו מניחים החלקות כיסוי לתוך תלולית טפלון, אותה אנו מכניסים לאחר מכן לתרגיל כלי זכוכית. זהירות רבה היכן שהגנה על העיניים, כפפות הגנה ומעיל מעבדה ועבודה בארון כימי. אנו מוסיפים חלק אחד של מי חמצן 30%, ולאחר מכן שלושה חלקים של חומצה גופרתית מרוכזת כדי להוליד חומצה פריו מונו-גופרתית תגובתית וחמצונית מאוד.

תערובת זו מגיבה באלימות עם חומרים אורגניים, כולל אלה של העור, העיניים והבגדים שלך. זה מתחמם מיד. דגרו על המגלשות למשך 30 דקות.

תפוס את פתק הכיסוי בעזרת כוח שטפו היטב את החומצה משני צידי החלקת הכיסוי הנקייה באמצעות מים מזוקקים W או מאוחדים באיכות גבוהה. לאחר מכן הנח את השקופית על מעמד טפלון ותן לה להתייבש לא יותר מ-10 דקות כדי שתוכל לייצר מספר שכבות דו-שכבתיות בודדות של שומנים בבת אחת. אנו מדביקים החלקות כיסוי מיובשות עם התקשות מהירה.

דבק אפוקסי דו-רכיבי לתא טכני של שמונה בארות או מעבדה של 16 בארות. ראשית, הסר את מגלשת הזכוכית המקורית בזהירות מהמסגרת שלה. מערבבים את שני מרכיבי הדבק ביחס של אחד לאחד.

מורחים אותו באופן שווה לחריצים התחתונים של מסגרת החדר. הנח את החלקת הכיסוי הנקייה על החלק התחתון המכוסה בדבק של מסגרת החדר. ודא שהדבק מפוזר באופן שווה בין מגלשת הזכוכית למסגרת הפלסטיק.

תן לדבק להתקשות במשך 30 דקות. לדלל את המתלה הפיזי השומני ב-PBS 1 עד 10 ולסנן אותו דרך מסנן 0.2 מיקרון ב-120 מיקרוליטר של דילול זה לכל באר של תא שמונה בארות או 60 מיקרוליטר לכל באר של תא של 16 בארות. ודא שכל משטח הזכוכית מכוסה והמתן 20 דקות.

כעת נוצרה השכבה הדו-שכבתית כדי להיפטר משאריות לס יש לשטוף כל באר עם 30 מיליליטר PBS. הימנע מחשיפה לאוויר של משטח הזכוכית בכל מחיר. זה יהרוס באופן מיידי את השכבה הדו-שכבתית כדי להבטיח שכל באר מכילה את אותו נפח חיץ לשלב קישוט החלבון הבא, מלאו כל באר לחלוטין והסירו את כיפת הנוזל.

הוצא 330 מיקרוליטר. זה ישאיר כ -350 מיקרוליטר בתוך כל אחד. ובכן כדי לקשט את השכבה הדו-שכבתית בחלבונים, הכינו תערובת מאסטר המכילה חלבוני פולי היסטמין טק לבחירה והוסיפו 50 מיקרוליטר ממנה לכל באר.

חלבונים נקשרים לקבוצת הניקל נגד ראש של השומן הכהה כדי להבטיח תוצאות ניתנות לשחזור מעורבבות ביסודיות אך בזהירות ותמיד דוגרות למשך 60 דקות כדי להסיר חלבונים לא קשורים. שוטפים שוב עם 30 מיליליטר PBS. הבה נתמקד כעת בחומרת המיקרוסקופיה.

ראשית, נדגים את הדרישות של מיקרוסקופ השתקפות פנימי כולל למיקרוסקופ דשא מבוסס אובייקטיבי. צריך יעד טבילה בשמן עם צמצם מספרי גבוה. קרן עירור הלייזר הנכנסת משתקפת על ידי המראה הדיכרואית וממוקדת באמצעות סט של שתיים או שלוש עדשות על מישור המוקד האחורי של האובייקט בלבד.

ואז אור הלייזר מוביל את המטרה כקרן מצופה לאורך הציר האופטי. בדרך זו, הדגימה הפלואורסצנטית מוארת במלוא עומקה. כאשר אתה מעביר את הקרן בניצב לציר האופטי, הקרן נשארת נאספת, אך עוזבת את המטרה בצורה מוטה.

אם תמשיך להמיר, תגיע בשלב מסוים לזווית הקריטית שבה הקרן משתקפת לחלוטין בממשק שבין החלקת כיסוי הזכוכית לדגימה. עוצמת הגל החולף שנוצר דועכת באופן אקספוננציאלי ורק קומה ארבע, הנמצאת בקרבת הממשק עד כמה מאות ננומטרים, מתרגשת. כעת, אנו מדגימים כיצד למקד את קרן הלייזר באופן ידני למישור המוקד האחורי של המטרה.

באמצעות שלוש או שתיים עדשות עם שתי העדשות הראשונות, קוטר קרן הלייזר גדל. היחס בין אורך המוקד שלהם קובע את גודל נקודת ההארה במישור הדגימה. כדי להבטיח שהקרן תישאר אסופה כוונן את המרחק בין עדשות אלו כך שהוא יהיה שווה לסכום של שני אורך המוקד.

העדשה השלישית משמשת למיקוד הקרן המורחבת למישור המוקד האחורי של המטרה. מכיוון שאורך המוקד של עדשה זו צריך להתאים לממדי גוף המיקרוסקופ וזה של פריסקופ קשור, הוא חייב להיות ארוך בהרבה במקרה שלנו, 75 סנטימטרים משתנים. למרחק בין עדשה שתיים לשלוש אין השפעה על תכונות האלומה.

לכן, ניתן להשתמש במרחב האינסוף שביניהם כדי לשנות את האלומה בצורה מוגדרת ללא עיוותים. לדוגמה, אתה יכול להכניס צמצם ולהקרין במדויק על מישור הדגימה. בעיקרו של דבר, אתה יכול להשיג את אותו הדבר באמצעות שתי עדשות במקום שלוש.

מערכת שתי העדשות פחות מוגדרת אך מציגה פחות סטיות עדשה. תכונות פשוטות כגון צמצם עדיין יכולות להיות מיושמות היטב עבור אפנון זמני. יש למקם לייזר גז, ברזל או מצב מוצק מול תריס טווח אלפיות השנייה, למשלample, תריס מכני או מאפנן אופטי.

אלטרנטיבה טובה היא לייזר דיודה, הניתן לאפנון אלקטרוני ואינו זקוק לסגירה חיצונית. מספיקות שתי מראות כדי לכוון את הקרן לכל מקום ולכל כיוון. כפי שצוין קודם, שתי העדשות משמשות להרחבת האלומה ולמיקוד שלה במישור המוקד האחורי של המיקרוסקופ. המטרה.

אנו יכולים להעביר את האלומה לתצורת דשא על ידי הזזת המראה התחתונה של הפריסקופ על מסילה אופטית. לזיהוי תמונה, אנו משתמשים במצלמה רגישה במיוחד. לדוגמה, ניתן ליישר מכשיר מצמד מטען מכפיל אלקטרונים או קרן לייזר שנייה של EM CCDA באורך גל שונה לנתיב האלומה.

עם שימוש במראות וכיסוי דיכרואי. לזיהוי שני צבעים בו זמנית, אנו מציבים מכשיר פיצול אלומה זמין מסחרית לנתיב הפליטה. לניסויים, זה מאוד שימושי שיהיו שני נתיבי אלומת עירור עצמאיים במקום.

לדוגמה, אחד להדמיית דשא והשני להלבנה או הפעלה ממוקדת של פוטו. ניתן להשיג זאת בקלות על ידי יישום סט של 2 50 50 מפצלי אלומה. כפי שמוצג באיור שלנו, שתי מערכות התאמת עדשות ומראה שונות יובילו לשני פרופילי אלומה בודדים וזוויות אלומה.

לדוגמה, אחד מורחב להדמיה בדשא ואחד ממוקד יותר להלבנה או הפעלה ללא דשא. ניתן למקם צמצם בקורה שאינה דשא כדי לעצב במדויק את נקודת ההלבנה או ההפעלה. שני תריסים נוספים, אחד לכל נתיב אלומה מאפשרים מתג בקרה עצמאי על קרן הלייזר, ומשאירים את המטרה בנתיב ישר ללא הטיה.

הפעל את מד הכוח והתאם אותו לאורך גל הלייזר המתאים. מדוד את עוצמת אור הלייזר במטרה ורשום אותו. כעת, העבירו את המראה מאחורי המיקרוסקופ כדי להטות את קרן הלייזר במטרה למצב הדשא.

לעולם אל תסתכל ישירות לתוך אור הלייזר. בפינה הימנית התחתונה, אתה רואה את פרופיל העוצמה של לייזר העירור כפי שמוצג באמצעות פליטה של שכבה דו-שכבתית מעוטרת בחלבונים פלואורסצנטיים. כאן אנו משתמשים בייצוג צבע כוזב כדי להדגיש אזורים בעוצמות שונות.

מדוד את העוצמה הממוצעת של הרקע באזור עניין גדול מספיק. ערך זה תלוי בהגדרות מצלמה ספציפיות כגון רווח EM ומהירות קריאה ויהיה צורך להפחית אותו מכל העוצמות הנמדדות. קבע את העוצמה הממוצעת בכל האזור המואר.

בחר את הקוטר גדול מספיק כדי שערכי העוצמה בפריפריה יהיו דומים לאלה של רקע המצלמה, מדדו את העוצמה הממוצעת של האזור המרכזי. אזור זה מגדיר את אזור העניין בו יבוצעו ניסויי מיקרוסקופיה מאוחר יותר. כעת, הפחיתו את ערך עוצמת הרקע הממוצע מהעוצמות של האזור שהוסר והאזור המרכזי.

לאחר מכן, הכפל את העוצמות המתוקנות ברקע במספר הפיקסלים המתאים של גודל האזור כדי להגיע לעוצמות משולבות. הגדר את העוצמה המשולבת של האזור המואר כאחד וחשב את השבר עבור האזור המרכזי. ההספק נמדד באמצעות מד הכוח.

במקרה שלנו חמישה מילי-וואט עומדים ביחס ישר לעוצמה המשולבת של כל האזור המואר. הכפל ערך זה בשבריר ההספק של האזור המרכזי כדי לקבוע את ההספק בתוך האזור המרכזי. בדוגמה שלנו, 1.15 מילי-וואט, הגורם להמרת מספר הפיקסלים למיקרונים מרובעים תלוי בגודל הפיקסלים בפועל של שבב המצלמה ובהגדלה של מסלול הפליטה.

ניתן לקבוע זאת בקלות באמצעות שקופית מיקרומטר. בדוגמה שלנו, השטח המרכזי מתאים ל-170.8 מיקרון רבוע. צפיפות ההספק מתייחסת להספק הנמדד חלקי השטח ובכך שווה ל -1.15 מיליוואט חלקי 170.8 מיקרון רבוע או 0.007 מיליוואט למיקרון מרובע.

כלומר 0.7 קילוואט לסנטימטר מרובע. כדי לקבוע את הנזילות של השכבה הדו-שכבתית, אנו מבצעים התאוששות פלואורסצנטית לאחר ניסוי פוטו-הלבנה של עטיפה. כפי שמוצג בסרט השמאלי התחתון, אנו מדמים את הדו-שכבת הפלואורסצנטית בצפיפות הספק נמוכה.

בסרט הימני התחתון, אתה יכול לראות את התא הטכני המתאים של המעבדה במיקרוסקופ. לאחר מכן אנו מלבינים אזור מעגלי עם הפולסים הקצרים בצפיפות הספק גבוהה ועוקבים אחר ההתאוששות בצפיפות הספק נמוכה. שוב, המונטאז' מספק סקירה כללית של הניסוי לנקודות זמן שונות כאשר זמן אפס הוא פעימות האקונומיקה.

אנו מכמתים את עוצמת הקרינה הממוצעת המתוקנת ברקע בתוך מעגל הסימנים ומנרמלים את כל העוצמות הנמדדות לעוצמה בתחילת הניסוי. לפני פעימות האקונומיקה, אנו משרטטים את ערכי העוצמה המנורמלים מול הזמן. ערך הרוויה מייצג את השבר הנייד במקרה שלנו מעל 90%ראשית, צלם תמונה של השכבה הדו-שכבתית בצפיפות כוח עירור נמוכה.

לדוגמה, על ידי הצבת מסנן צפיפות אופטית עם ערך הנחתה לוגריתמי של שתיים, זה מפחית את ההספק בפקטור של 100. זמן החשיפה צריך להיות קבוע לאורך כל ההליך ומספיק כדי לדמות כוח נוזל בודד בצפיפות ההספק הלא מוחלשת במקרה שלנו, 10 אלפיות השנייה ב-0.7 קילוואט לסנטימטר מרובע. השתמש בייצוג צבע כוזב כדי להדגיש אזורים בעוצמות שונות.

בחר אזור עניין אחד שבו יבוצעו מאוחר יותר מדידות של מולקולה בודדת ואזור אחד באותו גודל. עבור חיסור רקע, חשב את העוצמה המשולבת המופחתת ברקע. כעת הסר את מסנן הצפיפות האופטית מנתיב אלומת העירור, הלבין את האזור וצלם תמונה.

אתה תראה כוח שפעת בודד מתפזר באזור המולבן. כוח שפעת בודד מוגבל בעקיפה בקוטר טיפוסי של שניים עד שלושה פיקסלים, קח אזור אחד של שבעה על שבעה פיקסלים סביב כל אות מולקולה בודדת והאזור השני קרוב. לחיסור רקע, חשוב לכמת את האות של כוח פלואור בודד בלבד.

לכן, עדיף לדמות חלבונים בשכבת ה-BI עם יחס לחלבון של פחות מאחד או עבור חלבונים המסומנים במיוחד ב-SAT. אפילו יותר יחס תזונה לחלבון של אחד כפי שמוצג בדוגמה שלנו, למדוד את העוצמות המשולבות עבור שני האזורים ולהחסיר את הרקע מהאות כדי לא לקחת את האירוע האחרון שנצפה בדוגמה שלנו מכיוון שהלבנה כנראה התרחשה במהלך ממוצע החשיפה. האותות המתוקנים כאן, אנו עושים זאת עבור שפעת אחת של ארבע, אותה אנו צופים על פני תשע פריימים.

עם זאת, יש לבצע הליך זה עבור לפחות כמה מאות אירועי מולקולה בודדת. בואו נחזור לתמונה הדו-שכבתית המקורית שלנו שנצפתה בצפיפות כוח עירור מוחלשת. הצפיפות המולקולרית נקבעת על ידי תיקון העוצמה המשולבת של אזור העניין לצפיפות כוח עירור נמוכה באמצעות כפל במאה וחלוקתו בעוצמת המולקולה הבודדת הממוצעת והשטח.

אנו עוסקים בצפיפות של 421.4 כוח פלואור למיקרון מרובע. בדוגמה שלנו, עם יחס תזונה לחלבון של אחד, זה שווה לאותו מספר מולקולות למיקרון רבוע. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות מסוגל להכין ולאפיין שכבת שומנים פונקציונלית של חלבון באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של מולקולה אחת.

יתר על כן, כדאי להכיר את העקרונות הבסיסיים לשינוי ושדרוג מיקרוסקופ סטנדרטי למטרה זו. מאוחר יותר נשתמש במתודולוגיה זו כדי לקבוע את קינטיקה הקישור של אנטיגן קשור דו-שכבתי לקולטני תאי T הקשורים לתאים, אך יישומים רבים אחרים המבוססים על כך בהחלט אפשריים.