המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי במישורים נתמך bilayers

בסרטון זה, נראה כיצד להכין ולאפיין שכבה דו-שכבתית של ליפידים (lipid bilayer) פלנרית נתמכת ומפונקציונלית ביולוגית. כמו כן, נתאר במפורט את המבנה של מיקרוסקופ השחלה פנימית כולית (TIR microscope) בעל יכולות גילוי של מולקולה בודדת. נמדוד את צפיפות הספק העירור, את הנזילות ואת צפיפות החלבון של השכבה הליפידית.

נתחיל במבוא קצר לשכבות ליפידים המגובות בזכוכית מישורית. כאשר שלפוחיות חד-שכבתיות קטנות פוגשות משטח זכוכית נקי, הן מתבקעות ומתפשטות ליצירת שכבה ליפידית רציפה. על כרית מים, אנו בוחרים בדרך כלל בחומר פאלם.

ל-Ole phosphocholine או POPC יש את הדומיננטיות השומנית מכיוון שהוא יוצר שכבות ליפידיות כפולות נוזליות בטמפרטורת החדר וב-37 מעלות צלזיוס. לצורך פונקציונליזציה, אנו מוסיפים nickel antiox, ליפיד סינתטי בעל קבוצת ראש מכלטית לניקל, הקושר חלבונים עם תג poly histamine. לדוגמה, המולקולה המעוררת B7-1, מולקולת ההדבקה ICAM-1, ומולקולת MHC טעונה פפטיד המסומן פלואורסצנטית לזיהוי תאי T כפי שמוצג כאן; עם זאת, ניתן באופן עקרוני להשתמש במערכת השכבה הכפולה זו כדי לטפל בתהליכים שונים לחלוטין במגוון מערכות ביולוגיות.

בשל אופי המערכת המישורית, ניתן לנטר אירועי פלואורסצנציה במצב של החזרה פנימית מלאה, אשר מפחית באופן משמעותי את הרקע התאי ומתאים מאוד למיקרוסקופיית פלואורסצנציה של מולקולה בודדת. להכנת הליפידים, דרושים הליפידים POPC וניקל אנטי-חמצון בכלורופורם, ובקראון עם תחתית עגולה ונקייה. המיסו את הליפידים ביחס הרצוי ובכלורופורם וייבשו אותם בוואקום כפי שמוצג כאן. לאחר טיפול בוואקום גבוה למשך לילה, הליפידים יוצרים שכבה דקה על פנים הבקראון. להידרציה מחדש של הליפידים, השתמשו ב-PBS מנוון (Degas PBS), על ידי הוספת 10 מיליליטר של Degas PBS לתערובת הליפידים המיובשת.

אין לערבב. כעת, כדי למנוע חמצון של הליפידים, מלאו את הבקבוק בגז אינרטי כגון חנקן או ארגון וסובבו את הבקבוק. הליפידים יוצרים תמיסב חלבית.

קח דגימה קטנה כבנקים (blank) עבור הספקטרופוטומטר כדי למנוע חילופי גזים במהלך השלב הבא. חשוב מאוד לאטום כראוי את הבקרא המכילה את ת сусפנזיית הליפידים. השתמש בסרט הדבקה עמיד לחום, לדוגמה, סרט אוטוקלאב, להגנה מפני אוויר במהלך היצירה הפיזיקלית באמצעות אמבט אולטרסוני סגור.

לאחר קיבוע הבקבוק, התחילו את הליך הסוניקציה בהספק מרבי של 170 watts. בצעו סוניקציה למשך 60 דקות. בשל התהוות פיזית, העכירות ירדה באופן משמעותי.

ניתן לוודא זאת באמצעות ספקטרופוטומטריה באורך גל של 550 nanometers. השתמש באליקוט שנלקח לפני הסוניקציה כבנקים (blank). הצפיפות האופטית ב-230 nanometers, המעידה על כמות הליפידים, צריכה להישאר קבועה.

כאן אנו ממלאים מבחנות אולטרה-צנטריפוגה קטנות ב-1 mL של תרחף וסיקולות ומניחים אותן ברוטור בעל זווית קבועה של אולטרה-צנטריפוגה שולחנית. חשוב מאוד להשתמש רק בויזקולות חד-שכבתיות (unilamellar vesicles) קטנות להכנת השכבה הדו-שכבתית. ויזקולות רב-שכבתיות (multilamellar vesicles) גדולות ודחוסות יותר, הנוצרות גם הן במהלך הסוניקציה, פוגעות בניירות השכבה הדו-שכבתית ולכן יש לסנן ולהסיר אותן באמצעות צנטריפוגציה.

ראשית, נסובב למשך שעה אחת ב-150,000 G בטמפרטורת החדר. ה-snat המתקבל יועבר לאחר מכן לצנטריפוגה למשך שמונה שעות נוספות ב-288,000 G בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. על השקופיות להיות נקיות מאוד לפני שוסיקולות ליפידיות יוכלו להתפשט עליהן כדי ליצור שכבה כפולה רציפה ונוזלית.

לשם כך, אנו מניחים כיסויות זכוכית בתוך תלייה של טפלון, אותה אנו מכניסים לאחר מכן אל תוך כלי זכוכית. יש לנהוג בזהירות רבה, להשתמש במגני עיניים, כפפות מגן ובחלוק מעבדה, ולעבוד בתוך מ㠃 פומפה.

תערובת זו מגיבה באלימות עם חומרים אורגניים, כולל אלו של העור, העיניים והביגוד. היא מתחממת באופן מיידי. דגרו את השקופיות למשך 30 דקות.

אחזו בלוחית הכיסוי בעזרת פינצטה. שטפו היטב את החומצה משני צדדיו של לוחית הכיסוי הנקייה באמצעות W distilled או מים דה-יוניים באיכות גבוהה. לאחר מכן, הניחו את השקופית על מעמד טפלון והניחו לה להתייבש למשך זמן שלא יעלה על 10 דקות, כדי שניתן יהיה להפיק מספר שכבות ביליפידיות בודדות בבת אחת. אנו מדביקים לוחות כיסוי יבשים בעזרת דבק בעל הקשחה מהירה.

דבק אפוקסי דו-מרכיבי עבור תא Lab Tech בעל שמונה בארות או 16 בארות. ראשית, הסר בזהירות את השקף הזכוכית המקורי ממסגרתו. ערבב את שני מרכיבי הדבק ביחס של אחד לאחד.

מרחו את הדבק באופן אחיד בחריצי התחתית של מסגרת התא. הניחו את כיסוי הזכוכית הנקי על תחתית מסגרת התא המכוסה בדבק. ודאו שהדבק פרוש באופן אחיד בין זכוכית העשייה למסגרת הפלסטיק.

הניחו לדבק להתקשות למשך 30 דקות. דללו את הת сусפנזיה הליפידית ב-PBS ביחס של 1 ל-10 וסננו אותה דרך מסנן של 0.2 מיקרון. העבירו 120 מיקרוליטר מהדילול הזה לכל באער בתא בעל שמונה באערים, או 60 מיקרוליטר לכל באער בתא בעל 16 באערים. ודאו שכל פני השטח של הזכוכית מכוסים והמתינו 20 דקות.

השכבה הכפולה נוצרה כעת. כדי להיפטר משאריות, שטפו כל באר עם 30 milliliters של PBS. הימנעו מחשיפה של פני הזכוכית לאוויר בכל מחיר, שכן הדבר יהרוס באופן מיידי את השכבה הכפולה. כדי להבטיח שבכל באר יהיה אותו נפח של חוצץ עבור שלב קישוט החלבון הבא, מלאו כל באר לחלוטין והסירו את בולטרת הנוזל.

הוצאו 330 µL. פעולה זו תשאיר כ-350 µL בכל באער. כדי לצפות את השכבה הכפולה בחלבונים, הכינו תערובת מאסטר (master mix) המכילה חלבונים עם תג polyhistidine לפי הבחירה, והוסיפו 50 µL ממנה לכל באער.

חלבונים נקשרים לקבוצת הראש של הניקל אנטי של השומן הכהה כדי להבטיח תוצאות הדירות; ערבבו ביסודיות אך בזהירות, ותמיד דגרו למשך 60 דקות כדי להסיר חלבונים שאינם קשורים. שטפו שוב עם 30 milliliters של PBS. נתמקד כעת בחומרת המיקרוסקופיה.

ראשית, נדגים את הדרישות של מיקרוסקופיית החזר פנימי מלא עבור מיקרוסקופיית שטח המבוססת על עדשה. נדרשת עדשת שיקוע בשמן בעלת מפתח נומרי גבוה. קרן עירור הלייזר הנכנסת מוחזרת על ידי המראה הדיכרואית וממוקדת, באמצעות סט של שתי או שלוש עדשות, אל מישור המוקד האחורי של העדשה בלבד.

לאחר מכן, אור הלייזר מנחה את העדשה כקרן מקבילה לאורך הציר האופטי. באופן זה, הדגימה הפלורסצנטית מוארת בכל עומקה. כאשר מזיזים את הקרן בניצב לציר האופטי, הקרן נותרת מקבילה, אך היא עוזבת את העדשה בזווית נטייה.

אם תמשיכו להזיז את הדגימה, תגיעו בנקודה מסוימת לזווית הקריטית שבה הקרן מוחזרת לחלוטין בממשק שבין כיסוי הזכוכית לדגימה. עוצמת הגל ההכלה (evanescent wave) שנוצר כתוצאה מכך דועכת באופן מעריכי, ורק שכבות המצמודות לממשק, עד למאות ננומטרים, מעוררות. כעת, נדגים כיצד למקד ידנית את קרן הלייזר במישור המוקד האחורי של העדשה.

באמצעות שימוש בשלוש או שתי עדשות, כאשר שתי העדשות הראשונות מגדילות את קוטרו של קרן הלייזר. היחס בין מוקדי המיקוד שלהן קובע את גודל נקודת ההארה במישור הדגימה. כדי להבטיח שהקרן תישאר מקבילה, יש לכוון את המרחק בין עדשות אלו כך שיהיה שווה לסכום אורכי המוקד של שתיהן.

העדשה השלישית משמשת למיקוד של האלומה הרחבה אל מישור המוקד האחורי של העדשה של העדשה המגדילה (objective). מכיוון שאורך המוקד של עדשה זו צריך להתאים לממדי גוף המיקרוסקופ ולממדי הפריסקופ הנלווה, במקרה שלנו הוא חייב להיות ארוך הרבה יותר, כ-75 סנטימטרים באופן משתנה. למרחק שבין העדשה השנייה לשלישית אין השפעה על תכונות האלומה.

לכן, ניתן להשתמש במרחב האינסוף שביניהם כדי לשנות את קרן האור באופן מוגדר ללא עיוותים. לדוגמה, ניתן להכניס צמצם ולהקרין בדיוק על מישור הדגימה. למעשה, ניתן להשיג תוצאה דומה באמצעות שתי עדשות במקום שלוש.

מערכת שתי העדשות פחות מוגדרת אך גורמת לפחות עיוותי עדשה. תכונות פשוטות כגון צמצם עדיין יכולות להיות מיושמות היטב לצורך אפנון זמני. יש למקם לייזר גז, ברזל או מצב מוצק לפני סוגר בטווח של מילי-שניות, לדוגמה, סוגר מכני או מודולטור אופטי.

חלופה טובה היא לייזר דיודה, שניתן להשפיע עליו באופן אלקטרוני והוא אינו זקוק לסגירה חיצונית. שתי מראות מספיקות כדי לכוון את הקרן לכל מקום ובכל כיוון. כפי שנדון בעבר, שתי העדשות משמשות להרחבת הקרן ולמיקודה במישור המוקד האחורי של העדשה העיקרית של המיקרוסקופ.

ניתן להזיז את קרן האור עבור תצורת ה-turf על ידי הזזת המראה התחתונה של הפריסקופ על גבי מסילה אופטית. לצורך זיהוי תמונה, אנו משתמשים במצלמה בעלת רגישות גבוהה. לדוגמה, התקן CCD עם הכפלה אלקטרונית (em CCD). ניתן ליישר קרן לייזר שנייה באורך גל שונה אל תוך נתיב הקרן.

באמצעות שימוש במראות ובשכבה דיכרואית. לצורך גילוי סימולטני בשני צבעים, אנו מציבים התקן לפיצול קרן זמין מסחרית במסלול הפליטה. עבור ניסויים, יעיל מאוד שיהיו שני מסלולי קרן עירור עצמאיים.

לדוגמה, אחד עבור דימוי של שטחים רחבים (turf imaging) ושני עבור פוטובליצ'ינג (photobleaching) או הפעלה ממוקדת. ניתן להשיג זאת בקלות באמצעות הטמעת סט של שני מפליקי קרן (beam splitters) מסוג 50:50. כפי שמוצג באיור שלנו, שתי מערכות שונות של התאמות עדשות ומראות יניבו שני פרופילי קרן וזוויות קרן נפרדים.

לדוגמה, צמצם רחב יותר עבור דימות ב-turf וצמצם ממוקד יותר עבור הלבנה (bleaching) או הפעלה ב-non turf. ניתן להניח מפתח (aperture) בתוך קרן ה-non turf כדי לעצב במדויק את נקודת ההלבנה או ההפעלה. שני תריסים נוספים, אחד לכל נתיב קרן, מאפשרים שליטה עצמאית על מתג קרן הלייזר, תוך השארת העדשה בנתיב ישר שאינו מוטה.

הפעילו את מד ההספק וכוונו אותו לאורך הגל המתאים של הלייזר. מדדו את הספק קרן הלייזר בעדשה והרשמימו. כעת, הזריזו את המראה שמאחורי המיקרוסקופ כדי להטות את קרן הלייזר בעדשה לעמדת הדשא.

לעולם אל תסתכלו ישירות אל אור הלייזר. בפינה הימנית התחתונה, ניתן לראות את פרופיל העוצמה של לייזר העירור כפי שזוהה דרך הפליטה של דו-שכבה מעוטרת בחלבונים פלואורסצנטיים. כאן אנו משתמשים בייצוג בצבעים מלאכותיים כדי להדגיש אזורים בעוצמות שונות.

מדדו את העוצמה הממוצעת של הרקע בתוך אזור עניין (ROI) גדול מספיק. ערך זה תלוי בהגדרות ספציפיות של המצלמה, כגון EM gain ומהירות קריאה (readout speed), ויש להחסירה מכל העוצמות הנמדדות. קבעו את העוצמה הממוצעת בתוך כל השטח המואר.

בחר בקוטר גדול מספיק כך שערכי העוצמה בפריפריה יהיו דומים לאלו של רקע המצלמה, ומדוד את העוצמה הממוצעת של האזור המרכזי. אזור זה מגדיר את אזור העניין (region of interest) שבו יבוצעו ניסויי המיקרוסקופיה בהמשך. כעת, החסר את ערך עוצמת הרקע הממוצעת מהעוצמות של האזור שהוסר ומהאזור המרכזי.

בשלב הבא, הכפילו את העוצמות המתוקנות לרקע במספר הפיקסלים המתאים של גודל האזור כדי להגיע לעוצמות משולבות. הגדירו את העוצמה המשולבת של האזור המואר כ-1 וחשבו את השבר עבור האזור המרכזי. ההספק נמדד באמצעות מד הספק.

במקרה שלנו, חמישה מיליוואט פרופורציונליים ישירות לעוצמה המשולבת של כל השטח המואר. הכפל ערך זה בחלק ההספק של האזור המרכזי כדי לקבוע את ההספק בתוך האזור המרכזי. בדוגמה שלנו, 1.15 מיליוואט, הגורם להמרת מספר הפיקסלים למיקרונים רבועים תלוי בגודל הפיקסל בפועל של שבב המצלמה ובבדילת נתיב הפליטה.

ניתן לקבוע זאת בקלות באמצעות שקף מיקרומטר. בדוגמה שלנו, השטח המרכזי תואם ל-170.8 מיקרון רבוע. צפיפות ההספק מתייחסת להספק הנמדד חלקי השטח, ולכן היא שווה ל-1.15 מיליוואט חלקי 170.8 מיקרון רבוע, או 0.007 מיליוואט למיקרון רבוע.

מדובר ב-0.7 Kilowatt לסנטימטר רבוע. כדי לקבוע את הנזילות של השכבה הכפולה, אנו מבצעים ניסוי של התאוששות פלואורסצנטית לאחר הלבנה פוטוכימית (FRAP). כפי שמוצג בסרטון השמאלי למטה, אנו מדמיינים את השכבה הכפולה הפלואורסצנטית בצפיפות הספק נמוכה.

בסרטון הימני למטה, ניתן לראות את תא המעבדה התואם במיקרוסקופ. לאחר מכן, אנו מלבינים אזור מעגלי באמצעות פולסים קצרים בעלי צפיפות הספק גבוהה, ומנטרים את ההתאוששות בצפיפות הספק נמוכה. שוב, המונטאז' מספק סקירה כללית של הניסוי עבור נקודות זמן שונות, כאשר זמן אפס הוא פולסי ההלבנה.

אנו מכמתים את עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת המתוקנת לרקע בתוך המעגל המסומן, ומנרמלים את כל העוצמות שנמדדו לעוצמה בתחילת הניסוי. לפני פולסי ההלבנה, אנו משרטטים את ערכי העוצמה המנורמלים כפונקציה של הזמן. ערך הרוויה מייצג במקרה שלנו את הפראקציה הניידת, שהיא מעל 90%. ראשית, דגמו תמונה של השכבה הדו-שכבתית בצפיפות הספק עירור נמוכה.

לדוגמה, על ידי הצבת מסנן צפיפות אופטית עם ערך ניחות לוגריתמי של שתיים, ההספק מופחת פי 100. זמן החשיפה צריך להיות קבוע לאורך כל הפרוצדורה ומספיק כדי לצלם כוח נוזל בודד בצפיפות ההספק ללא הניחות, במקרה שלנו, 10 milliseconds ב-0.7 kilowatt לסנטימטר רבוע. השתמשו בייצוג של צבעים מדומים (false color) כדי להבליט אזורים בעוצמות שונות.

בחרו אזור עניין אחד שבו יבוצעו מאוחר יותר מדידות של מולקולה בודדת ואזור אחד נוסף באותו גודל. לצורך חיסור הרקע, חשבו את העוצמה האינטגרלית לאחר חיסור הרקע. כעת הסירו את פילטר הצפיפות האופטית מנתיב קרן העירור, בצעו הבהרה (bleach) של האזור וצלמו תמונה.

ניתן לראות מולקולות פלואורופור בודדות המפעירות דיפוזיה באזור המולבנן. המולקולות הבודדות מוגבלות על ידי דיפרקציה עם קוטר טיפוסי של שני עד שלושה פיקסלים; יש לבחור אזור של שבעה על שבעה פיקסלים סביב כל אות של מולקולה בודדת ואזור שני הסמוך אליו. לצורך חיסור רקע, חשוב לכמת את האות של פלואורופור בודד בלבד.

לכן, עדיף לדגם תמונות של חלבונים על שכבת ה-BI עם יחס של פחות מאחד, או עבור חלבונים המסומנים ספציפית ב-SAT. אפילו עם יחס של אחד, כפי שמוצג בדוגמה שלנו, יש למדוד את העוצמות המשולבות עבור שני האזורים ולהפחית את הרקע מהאות כדי לא להסתמך על האירוע האחרון שנצפה בדוגמה שלנו, שכן ככל הנראה התרחשה הבהרה במהלך ממוצע החשיפה. יש לבצע תיקון לאותות כאן; אנו עושים זאת עבורFlu אחד מתוך ארבעה, אותו אנו צופים על פני תשעה פריימים.

עם זאת, יש לבצע הליך זה עבור לפחות מספר מאות אירועים של מולקולה בודדת. נחזור לתמונת השכבה הכפולה המקורית שנצפתה בצפיפות הספק עירור מוחלשת. הצפיפות המולקולרית נקבעת על ידי תיקון העוצמה המשולבת של אזור העניין עבור צפיפות הספק עירור נמוכה, באמצעות הכפלה במאה וחילוק בעוצמה הממוצעת של מולקולה בודדת ובשטח.

אנו עוסקים בצפיפות של 421.4 Fluor force למיקרון רבוע. בדוגמה שלנו, עם יחס של אחד בין הדיאט לפרוטאין, הדבר שווה לאותו מספר של מולקולות למיקרון רבוע. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להיות מסוגלים להכין ולאפיין שכבה ליפידית כפולה פונקציונלית עם חלבונים באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה של מולקולה בודדת.

יתרה מכך, עליכם להכיר את העקרונות הבסיסיים לשינוי ושדרוג של מיקרוסקופ סטנדרטי למטרה זו. בהמשך נשתמש במתודולוגיה זו כדי לקבוע את קינטיקת ההיקשרות של אנטיגן קשור לשכבה כפולה לקולטנים של תאי T הקשורים לתא, אך יישומים רבים אחרים המבוססים על כך הם בוודאי אפשריים.