יצירת Gradients הדבק והמסיס לנדידת תאי דימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא ליצור מדרגי דביקות ומסיסות כדי לחקור נדידת תאים. דבר זה מושג תחילה על ידי פסיבציה של משטח כדי למנוע היצמדות לא ספציפית של תאים. השלב השני הוא ייצור חותמות באמצעות הדפסה במיקרו-מגע (micro contact printing).

בשלב הבא, יוצרים על פני השטח המטופלים תבנית של קווים של streptavidin באמצעות הדפסת מגע מיקרוסקופית (micro contact printing). ניתן להדפיס streptavidin גם כנקודות באמצעות ליתוגרפיית עט טבילה (dip pen lithography) המחוברת לתחתית של התקן מיקרופלואידי. פני השטח המעובדים ישמשו כבסיס למדרג דבקות של biotin RGD.

השלב האחרון הוא טעינת תאים על פני השטח עם הרמז הדביק (adhesive cue) בנוכחות מפל של מושך כימי (chemo attractant) מסיס. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיה של תאים חיים כדי להראות נדידת תאים בתגובה לרמזים דביקים ומסיסים כאחד. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון בדיקת transwell או void chamber ומערך מיקרופלואידי קונבנציונלי, הוא שמערכת משולבת של התקן מיקרופלואידי בעל תבנית שטח מאפשרת את תצפית התגובות של תאים לרמזים דביקים מבוקרים מרחבית, למפל דביק ולמפל מסיס בו-זמנית.

שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הגירה של תאים, כגון חשיבותה של היצמדות תאית והקשר בין קולטנים כימיים, כגון קינזות קולטניות, קולטנים המצומדים לחלבון G וקולטני היצמדות, לכיסויי זכוכית. ראשית, נקה את כיסויי הזכוכית על ידי טבילתם במעמד ב-100% ethanol והנחת המעמד במכשיר sonicating water bath למשך 30 דקות. ייבש את כיסויי הזכוכית באוויר.

בשלב הבא, בצעו סוניקציה לכיסויי הזכוכית למשך 30 דקות בנתרן הידרוקסיד בריכוז one molar. לאחר מכן, שטפו את משטחי הזכוכית על ידי הטיה זהירה של הראק לתוך כלי כימיה מלא ב-1.5 liters של milli cube water. חזרו על תהליך השטיפה שלוש פעמים, תוך שימוש ב-milli cube water רענן בכל פעם.

לאחר השטיפה השלישית, ייבשו את כיסויי הזכוכית בתנור בטמפרטורה של 60 °C למשך כחצי שעה. מקמו מחצית מכיסויי הזכוכית הנקיים באופן פרטני בתא לחות העשוי מלוח של 24 בארות, המולא חלקית במים. הבארות ממולאות במים וכיסויי הזכוכית מונחים מעליהן עבור הפעולה, נעשה שימוש בקו-פולימר של polylysine ו-polyethylene glycol שבו 20% ממולקולות ה-peg מושרשות ל-biotin.

בקיצור PLL Peg biotin; טפטפו 15 µL של PLL Peg biotin ב-PBS על כל כיסוי זכוכית. קחו את מחציתם של יתרת כיסויי הזכוכית הנקיים והצמידו אותם בזהירות כדי ליצור "סנדוויץ'" של תמיסת ה-PEG. השאירו את כיסויי הזכוכית למשך שעה אחת בתא לחות.

לאחר המתנה של שעה, יש להחליק בעדינות את כיסויי הזריקה (cover slips) זה מזה, מבלי לגרד את השטח המצופה ב-PEG, ולשטוף אותם במים ממכשיר לניקוי מים (UE water). המים צריכים להיסחף בקלות מהצד המטופל ב-PEG. במידת הצורך.

ייבשו באוויר את זכוכית כיסוי המיקרוסקופ על נייר סופג, כאשר הפני השטח המטופל פונה כלפי מעלה. אחסנו את זכוכיות הכיסוי במייבש ואקום עד לשימוש הבא. התבנית הסיליקונית הנדרשת להליך זה מיוצרת באמצעות פוטוליתוגרפיה ליצירת חותם A-P-D-M-S; עבור את אלסטומר ה-PDMS על גבי התבנית הסיליקונית בתוך צלחת פטרי עד לגובה של כסנטימטר אחד, והבקיעו את התבנית ותערובת ה-PDMS בתנור בטמפרטורה של 70 °C למשך שעה אחת.

בהמשך, מסירים את חותמת ה-PDMS מהתבנית המקורית (Silicon master) וחותכים אותה לגודל המתאים להדפסת תבניות חלבון באמצעות טכניקת הדפסה במגע מיקרוסקופי (micro contact printing). תחילה, כדי להפוך את חותמות ה-PDMS להידרופיליות יותר, מנקים את צד התבנית במכשיר ניקוי UV ואוזון למשך שעה וחצי. מיד לאחר טיפול האוזון, שופכים ומפזרים 10 µL של streptavidin על חותמות ה-PDMS. כדי שהעקבות יהיו גלויים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה, יש להשתמש ב-streptavidin המצומד לפלואורופור, כגון streptavidin-R350.

השאירו למשך שעה אחת בתא לחות. הסירו עודפי strep din מהבּולט באמצעות נייר סופג ואוויר. ייבשו את הבּולט למשך כדקה אחת.

לחץ קלות את החותמת על פני זכוכית כיסוי מצופה biotin ו-PLL peg. אם נעשה שימוש ב-strep din פלואורסצנטי, בחן את התבנית תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציית epi. ניתן להדפיס תבניות חלבון גם באמצעות ליטוגרפיית עט טבילה (dip pen lithography).

ראשית, ערבבו חלק אחד של תמיסת strippin או stripped avidan elif Fluor three 50 בריכוז 1 mg/mL עם 10 חלקים של גליצרול, וטענו 5 µL מהתערובת אל הקנטיליבר. התאימו את מהירות ההדפסה. קבעו את זמן המגע של הקנטיליבר עם הפני השטח או את המרחק האנכי של הקנטיליבר מהפני השטח כדי להקטין את גודל הנקודה.

כחמישה מיקרומטרים בתחילת תהליך ההדפסה כפי שמתואר במדריך ההפעלה של מכשיר ה-dip pen lithography של החברה. כל המשטחים המודפסים נשמרים במייבש (desiccator). מכשיר מיקרופלואידי זמין מסחרית משמש ליצירת מדרגי ריכוז על פני השטח.

הדביקו את כיסויי הזכוכית המצופים ב-tritin או בעלי התבנית לצד הדביק של המכשיר כדי להבטיח שלא תהיה דליפה למשך מספר שעות. אטמו את קצוות המכשיר בשכבה דקה של וסלין מחומם ובשכבה שנייה של תערובת המורכבת מחלק אחד של וסלין וחלק אחד של שעוות פראפין. מלאו את התעלה של המכשיר ב-6 µL של PBS כדי ליצור שני מדרגי ריכוז (gradients) מנוגדים.

מלאו את שני המאגרים, אחד ב-70 µL של biotin-fluorescein והשני ב-70 µL של biotin המצומד לפפטיד biotinylated arginine glycine aspartic acid או RGD. דגרו את הדגימות בטמפרטורת החדר, בחשכה, למשך שעה אחת. שטיפת ה-biotin, ה-RGD וה-biotin-fluorescein מההתקן המיקרופלואידי היא החלק המורכב ביותר בפרוצדורה זו, בשל הסיכון לכליאת בועות אוויר ולהפרעה למסלולי ההדפסה במיקרו-מגע (micro contact printed tracks). כדי להבטיח הצלחה, יש להסיר את ה-biotin וה-PBS בזהירות ובאיטיות.

הסִירו את תמיסות הביוטין ושטפו בזהירות את הפני השטח פעמיים עם PBS בעודם מחוברים למכשיר המיקרופלואידי. סמנו את כיוון מדרג ההדבקה (adhesive gradient) לפני טעינת תאים מסומנים פלואורסצנטית אל המכשיר המיקרופלואידי. ספרו את התאים וחלקו אותם לשתי מבחנות עם מספר תאים שווה בכל אחת.

שטפו והשעיה. השעיה שפופרת אחת של תאים במצע המכיל את הגורם המושך הכימיוטקטי, כגון DMEM עם ריכוז גלוקוז נמוך ו-10%FBS, ואת שפופרת התאים השנייה במצע ללא הגורם המושך הכימיוטקטי, כגון DMEM עם 0%FBS. הריכוז הסופי של התאים בכל שפופרת צריך להיות 5 × 10⁵ תאים למילליטר.

הסיר את כל התמיסות מההתקן המיקרופלואידי והנח אותו על המיקרוסקופ שחומם מראש. טען לשלב 70 µL של תאים שסספנדו מחדש ב-0%F-B-S-D-M-E-M אל תוך מאגר אחד. טען 70 µL של תאים שסספנדו מחדש ב-10%F-B-S-D-M-E-M אל תוך מאגר אחר.

הדביקו סרט דביק באופן רפוי מעל המאגרים כדי למנוע אידוי. ודאו שתעל ההתקן המיקרופלואידי נמצא בשדה הראייה והתאים נמצאים במיקוד. בחרו את פרמטרי רכישת התמונה, כגון זמני חשיפה ומסננים פלואורסצנטיים.

רצף תמונות בשדה בהיר (brightfield) ובפלואורסצנציה, המגדירים את התאים והמסלולים, כמו כן את נקודות הזמן ואת אורך ההקלטה, בעת הפעלת תוכנת רכישת התמונות. סרטון זה מדגים שיטה לדימוי תאים חיים הנודדים בסביבה עם מדרגי ריכוזים (gradients) תחרותיים של חומרים דביקים ומסיסים. מסלולים דביקים המכילים strippin פלואורסצנטי ו-RGD ביוטינילציה נוצרו באמצעות הדפסת מיקרו-מגע (micro contact printing) או ליתוגרפיית עט טבילה (dip pen lithography).

הדפסת מיקרו-מגע (micro contact printing) מוצלחת מקבלת ביטוי בפרופיל הקו של עוצמת הפלואורסצנציה לאורך המסלולים, שבהם ניתן להבחין בבירור בין המסלולים הדביקים לבין האזורים בעלי תכונות אנטי-פאולינג (antifouling). נקודות שהודפסו באמצעות ליתוגרפיית עט טבילה (dip pen lithography) נראות מעוגלות ולא בצורת דמעה, מה שמעיד על תהליך הדפסה מוצלח. בדוגמה זו, נקודות הודפסו בשורה כאשר המרווח בין השורות והעמודות נקבע ל-10 עד 15 micrometers.

מרחק זה מספיק כדי למנוע מהנקודות להתמזג זו בזו, אך מאפשר צפייה במספר נקודות בשדה ראייה אחד. ברוב הגדרות המיקרוסקופ, נוצר מדרג (Grady) של רמזי הידבקות על המסלול המודפס באמצעות מכשיר המיקרופלואידיקה הפשוט, על ידי טעינה של biotin four fluorescein ו-biotin RGD לצדדים מנוגדים של פאנל תא המיקרופלואידיקה.

תמונה A מציגה 60 תמונות פסיפס שצולמו באורך תמונה כולל של 3072 מיקרומטרים. בלוח B, נמדדה עוצמת הפלואורסצנציה לאורך כל הפסיפס. קווי מגמה ליניאריים הותאמו לעוצמת הפלואורסצנציה כדי להצביע על מדרג ה-RGD בתעלה.

לאחר הסרת תמיסת הביוטין RGD, ניתן להשתמש באותה תא כדי להחדיר מדרג מסיס. פאנל A מציג את עוצמת הפלואורסצנציה של צבע פלואורסצאין סמוך למאגרים הממולאים ב-PBS ובפלואורסצאין, ולרוחב התעלה ב-T שווה ל-0. פאנל B מציג את עוצמת הפלואורסצנציה של הרמזים המסיסים.

לאחר דגירה של 16 שעות, תוצאות דומות מעידות כי המדרג היה יציב למשך 16 שעות לפחות. באמצעות שיטה זו נצפתה נדידת תאים בתא מיקרופלואידי עם מדרגים מנוגדים, וסרטון מייצג מוצג כאן. המדרג האדזיבי היה RGD המקובע על מסלולי strep avidan, והמדרג המסיס היה בין 0% ל-10% FBS.

התמונות צולמו מדי 15 דקות למשך 20 שעות בסך הכל. מעבר התמונות המוצג הוא שמונה פריימים לשנייה. סרטון שני זה מציג תא heli בודד הנודד לעבר מקור ה-FBS.

מעבר התמונות המוצג הוא שמונה פריימים לשנייה. הקו הכחול המייצג את מסלול התא התקבל באמצעות תוכנה למעקב אחר תאים. גרפיקה זו מציגה את מסלולי התאים מהתמונות בסרטון הראשון.

מסלולי תאים שהיגרו לעבר ריכוז גבוה יותר של FPS מסיס מוצגים באדום, ומסלולי תאים שהיגרו לעבר ריכוזים גבוהים יותר של RGD צמוד הם מוצגים בשחור. מסלולים אלו הראו כי תאי HeLa רבים יותר היגרו לעבר מקור המשיכה הכימית מאשר לעבר ריכוזים גבוהים יותר של RGD צמוד. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור למנוע התאיידות של PBS או של מצע הגדילה במכשיר המיקרופלואידי במהלך הכנת מדרג ההדבקה והדימוג בזמן אמת; השתמשו בסרט דביק במידת הצורך כדי לכסות את כל פתחי הכניסה של המכשיר המיקרופלואידי לאחר ביצוע הליך זה.

ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון טרנספקציה ומיקרוסקופיית תמיסות היברידיות, כדי לענות על שאלות נוספות, כגון הביומכניקה של השלד התאי הפועל באמצעות חלבונים, חלבוני הדבקה מוקדית וקולטנים במהלך נדידת תאים.