יצירת Gradients הדבק והמסיס לנדידת תאי דימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור שיפועים דביקים ומסיסים לחקר נדידת התאים. זה מושג על ידי פסיבציה תחילה, משטח למניעת הידבקות תאים לא ספציפית. השלב השני הוא לייצר חותמות מהדפסת מיקרו מגע.

לאחר מכן, המשטח מעוצב בקווי סטרפטוקוקוס נלהבים על ידי הדפסת מיקרו מגע. ניתן להדפיס דין קשור גם כנקודות באמצעות ליתוגרפיה של עט טבילה המחוברת לתחתית מכשיר מיקרופלואידי. המשטח השונה ישמש כבסיס לשיפוע דבק של ביוטין RGD.

השלב האחרון הוא להעמיס תאים על פני השטח עם רמז הדבק בנוכחות שיפוע מושך כימותרפיה מסיס. בסופו של דבר, מיקרוסקופ תאים חיים משמש להצגת נדידת תאים בתגובה לרמזים דביקים ומסיסים כאחד. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון בדיקת תא טרנסוול או תא ריק ומערך מיקרופלואידית קונבנציונאלי הוא שמערכת מפורקת של דפוס פני השטח מכשיר מיקרופלואידי, מאפשר התבוננות בתגובות התאים לרמזי דבק מבוקרים מרחבית ושיפוע דבק ושיפוע מסיס בו זמנית.

ובכן, שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום נדידת התאים, כגון החשיבות של הידבקות תאים ולגרום לשבץ מוחי בין קולטני כימותרפיה טקסס כגון קולטנים מצומדים לחלבון G קינאז וקולטני הידבקות כמו RIN לאכול פתקי כיסוי זכוכית. ראשית, נקו את החלקות הכיסוי על ידי טבילתם במתלה ב-100% אתנול והנחת המתלה באמבט מים להחלקה על הבן למשך 30 דקות. יבש את מכסה הזכוכית מחליק באוויר.

לאחר מכן, סוניקציה של כיסוי הזכוכית מחליקה למשך 30 דקות בנתרן הידרוקסיד טוחנת אחת. לאחר מכן, שטפו את משטחי הזכוכית על ידי הטיית המתלה בזהירות בכוס מלאה בליטר וחצי של מים מילי-קוביות. חזור על תהליך השטיפה שלוש פעמים תוך שימוש במי מילי קובייה טריים בכל פעם.

לאחר השטיפה השלישית, ייבוש, מכסה הזכוכית מחליק לתנור בחום של 60 מעלות צלזיוס למשך כחצי שעה. הנח מחצית מכיסוי הזכוכית הנקי מחליק בנפרד בתא לח העשוי מצלחת 24 בארות, מלאה חלקית במים. בארות מלאות במים והחלקות כיסוי הזכוכית מונחות על גבי הבארות לצורך הביצוע, נעשה שימוש בקופולימר של פוליליזין ופוליאתילן גליקול בו מושתלות 20% ממולקולות היתד לביוטין.

בקיצור PLL Peg ביוטין טיפה 15 מיקרוליטר של PLL Peg ביוטין ב-PBS על כל תלוש כיסוי זכוכית. קח את החצי השני של החלקות כיסוי הזכוכית הנקיות שנותרו וסנדוויץ' בזהירות את תמיסת ה-PEG. השאירו את הכיסוי מחליק למשך שעה בתא הלח.

לאחר שקופית של שעה, הכיסוי הסנדוויץ' מחליק בעדינות זה מזה מבלי לגרד את המשטח המצופה PEG ולשטוף אותם במי UE. המים צריכים להחליק בקלות על הצד המטופל יתד. במידת הצורך.

יבש באוויר את מכסה הזכוכית מחליק על מגבת נייר כשהמשטח המטופל פונה כלפי מעלה. מכסה הזכוכית מחליק בייבוש ואקום עד לשימוש נוסף. מאסטר הסיליקון הנדרש להליך זה מיוצר על ידי פוטוליתוגרפיה כדי להטיל חותמת A-P-D-M-S לאלסטומר ה-PDMS על מאסטר הסיליקון בתוך צלחת פטרי לגובה של כסנטימטר אחד ולרפא את תערובת המאסטר וה-PDMS בתנור בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס למשך שעה.

לאחר מכן, חותמת ה-PDMS מוסרת ממאסטר הסיליקון ונחתכת לגודל כדי להדפיס דפוסי חלבון בטכניקת הדפסת מיקרו-מגע תחילה ולהפוך את חותמות ה-PDMS להידרופיליות יותר על ידי טיפול בצד התבנית במנקה UV ואוזון למשך שעה וחצי מיד לאחר מקום הטיפול באוזון. ומורחים 10 מיקרוליטר של אדין מופשט על חותמות ה-PDMS. אם המסלולים אמורים להיות גלויים תחת המיקרוסקופ הפלואורסצנטי, השתמש בעדן מופשט המצומד לפלואורו ארבע, כגון Stripped avid ו-LOR three 50.

השאירו למשך שעה בתא לח. הסר עודפי סטרפטוקוקוס מהבול בעזרת טישו, נייר ואוויר. יבש את החותמת למשך כדקה.

לחץ קלות על ה-stamp על פתק כיסוי הזכוכית המצופה ביוטין יתד PLL. אם נעשה שימוש בסטרפטוקוקוס פלואורסצנטי, בדוק את התבנית תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי אפי. ניתן להדפיס דפוסי חלבון גם באמצעות ליתוגרפיה של עט טבילה.

ראשית מערבבים חלק אחד של מיליגרם אחד למיליליטר, חשפנית או אליף אבידן מופשט פלואור שלוש 50 עם 10 חלקי גליצרול ומעמיסים חמישה מיקרוליטר מהתערובת על השלוחה. התאם את מהירות ההדפסה. זמן המגע של השלוחה על פני השטח או מרחק אנכי של השלוחה לפני השטח כדי להקטין את גודל הנקודה.

כחמישה מיקרומטרים מתחילים את תהליך ההדפסה כמתואר במדריך ההפעלה של חנות מכשירי הליתוגרפיה של עט הטבילה. כל המשטחים המודפסים בחומר ייבוש. מכשיר מיקרופלואידית זמין מסחרית משמש ליצירת שיפועי פני השטח.

הדבק את כיסוי הזכוכית המצופה או המעוצב הזה מחליק על הצד הדביק של המכשיר כדי להבטיח שלא תהיה דליפה למשך מספר שעות. אוטמים את שולי המכשיר בשכבה הדקה של וזלין מחומם ובשכבה שנייה של תערובת של חלק אחד וזלין לחלק אחד שעוות פרפין. מלא את ערוץ המכשיר בשישה מיקרוליטר PBS כדי ליצור שני שיפועים מנוגדים.

מלאו את שני המאגרים, האחד ב-70 מיקרוליטר ביוטין, ארבעה פלואורסצאין והשני ב-70 מיקרוליטר ביוטין מצומד לפפטיד ביוטיניל ארגינין גליצין חומצה ספרטית או RGD דגרו את הדגימות בטמפרטורת החדר בחושך למשך שעה. שטיפת ביוטין, RGD וביוטין של המכשיר המיקרופלואידי היא ההיבט הקשה ביותר בהליך זה מכיוון שיש סיכון ללכוד בועות אוויר ולהפריע למסלולים המודפסים במיקרו מגע. כדי להבטיח הצלחה, יש להסיר את הביוטין וה-PBS בזהירות ובאטיות.

הסר את תמיסות הביוטין ושטוף בזהירות את המשטח פעמיים עם PBS כשהוא עדיין מחובר למכשיר המיקרופלואידי. סמן את כיוון שיפוע הדבק לפני טעינת תאים עם תווית פלואורסצנטית למכשיר המיקרופלואידיקה. ספרו את התאים וחלקו אותם לשני צינורות בעלי מספר תאים שווה.

שטיפה והחייאה. השעו צינור אחד של תאים עם מדיה המכילה את המושך הכימותרפי, כגון DMEM עם גלוקוז נמוך עם שטיפת FBS של 10% וצינור התאים השני במדיה. ללא חומר המשיכה הכימותרפי כגון DMEM עם 0% FBS, הריכוז הסופי של התאים בכל צינור צריך להיות חמש פעמים 10 מהתאים החמישיים למיליליטר.

הסר את כל התמיסות מהמכשיר המיקרופלואידי והנח אותו על המיקרוסקופ החם מראש. עומס שלב 70 מיקרוליטר של תאים מושעים ב-0% F-B-S-D-M-E-M למאגר אחד. טען 70 מיקרוליטר של תאים תלויים ב-10% F-B-S-D-M-E-M למאגר אחר.

סרט מונח באופן רופף מעל המאגרים כדי למנוע אידוי. ודא שהתעלה של המכשיר המיקרופלואידי נמצאת בשדה הראייה והתאים נמצאים בפוקוס. בחר פרמטרים לרכישת תמונה כגון זמני חשיפה ומסנני פלורסנט.

רצף תמונות של שדה בהיר ופלואורסצנטי שתאים ועוקבים אחריהם, כמו גם נקודות זמן ואורך הקלטה מתחילים את תוכנית רכישת התמונה. סרטון זה מדגים שיטה להדמיית תאים חיים של תאים הנודדים בסביבה עם דבק מתחרה ושיפועים מסיסים. מסלולים דביקים המכילים חשפניה פלואורסצנטית ו-RGD ביוטיניל נוצרו עם הדפסת מיקרו-מגע או ליתוגרפיה של עט טבילה.

הדפסת מיקרו מגע מוצלחת מסומנת על ידי פרופיל הקו של עוצמת הקרינה על פני המסילות, שם ניתן להבחין בבירור בין מסילות דבק ואזורים נוגדי עכירות. נקודות המודפסות בליתוגרפיה של עט טבילה נראות מעוגלות, לא בצורת קרע, מה שמעיד על תהליך הדפסה מוצלח. בדוגמה זו, נקודות הודפסו בשורה עם הפרדת שורות ועמודות מוגדרות ל-10 עד 15 מיקרומטר.

מרחק זה מספיק כדי למנוע מנקודות להתמזג זו בזו, אך מאפשר צפייה בנקודות מרובות בשדה ראייה אחד. עם רוב הגדרות המיקרוסקופ, גריידי של רמזים דביקים על הרצועה המודפסת נוצר עם מכשיר המיקרופלואידיקה הפשוט. על ידי העמסת ביוטין ארבעה פלואורסצאין וביוטין RGD לצדדים המנוגדים של לוח תא מיקרופלואידי.

מופע 60 תמונות פסיפס שצולמו באורך תמונה כולל של 3072 מיקרומטר. בפאנל B, עוצמת הקרינה נמדדה לאורך כל הפסיפס. קווי מגמה ליניאריים הותאמו לעוצמת הקרינה כדי לציין את שיפוע ה-RGD בערוץ.

לאחר הסרת תמיסת הביוטין, ביוטין RGD, ניתן להשתמש באותו תא כדי להכניס שיפוע מסיס. פאנל A מראה את עוצמת הפלואורסצנט של צבע פלואורסצאין ליד PBS ומאגרים מלאים פלואורסצאין ומעבר לתעלה ב-T שווה לאפס. פאנל B מראה את עוצמת הפלואורסצנט של הרמזים המסיסים.

לאחר דגירה של 16 שעות, התוצאות הניתנות להשוואה מצביעות על כך שהשיפוע היה יציב לפחות 16 שעות. הוא, נדידת תאים בתא מיקרופלואידיאני עם שיפועים מנוגדים נצפתה בשיטה זו ומוצג כאן סרט מייצג. שיפוע הדבק היה RGD משותק על מסלולי סטרפטוקוקוס אבידן והשיפוע המסיס היה אפס עד 10% FBS.

התמונות צולמו כל 15 דקות במשך 20 שעות בסך הכל. מעבר התמונה המוצג הוא שמונה פריימים לשנייה. הסרט השני הוא של תא מסוק בודד הנודד לעבר מקור ה-FBS.

מעבר התמונה המוצג הוא שמונה פריימים לשנייה. הקו הכחול המייצג את מסלול התא התקבל באמצעות תוכנת מעקב אחר תאים. הגרפיקה האחרונה מציגה את מסלולי התאים מהתמונות בסרט הראשון.

מסלולי תאים שהיגרו לעבר הריכוז הגבוה יותר של FPS מסיס מוצגים במסלולי תאים אדומים שנדדו לעבר ריכוזים גבוהים יותר של RGD דבק מוצגים בשחור. מסלולים אלה הראו שיותר תאי הלה נדדו לעבר מקור המושך הכימותרפי מאשר לעבר ריכוזים גבוהים יותר של RGD דבק. בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור להימנע מאידוי של PBS או מדיה במכשיר המיקרופלואידי במהלך הכנת שיפוע הדבק והדמיית אורח חיים, השתמש בנייר דבק במידת הצורך כדי לכסות את כל הכניסות של המכשיר המיקרופלואידי.

ניתן לבצע שיטות אחרות כמו טרנספקציה ומיקרוסקופ תמיסה היברידית על מנת לענות על שאלות נוספות כמו הביומכניקה של השלד הציטולוגי הפועל על ידי חלבון, חלבוני הידבקות מוקדיים וקולטנים במהלך נדידת התאים.