. מלחציים צולבים כוח Rheometry על אפיון Hydrogels מבוססי חלבונים

היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא משתמשת ב-PID, שהיא מערכת נגזרת אינטגרלית פרופורציונלית להחלת פרוטוקולי כוח מבוקרים על דגימות הידרוג'ל חלבון, והיא משתמשת בנפח דגימה קטן. הפרוטוקולים של מהדק הכוחות מאפשרים פרשנות ישירה של הנתונים בעוד שנפחים נמוכים הם קריטיים כאשר עובדים עם חלבונים קשים לייצור הזמינים רק בכמויות קטנות. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על פיתוח ואפיון חומרים ביומטריים חדשים בעלי גמישות עמידה, תוך שימוש במעבר מתקפל כלפי מטה ומתקפל מחדש האופייני לחלבונים.

שיטה זו יכולה לענות על שאלות במכניקה של רקמות וביו-חומרים באמצעות מדידה של מיליארדי מולקולות חלבון במשיכה אחת והדמיית סביבות צפופות ספציפיות לרקמות ביולוגיות. התחל הליך זה בהכנת פתרונות ריאגנטים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי לסנתז את ההידרוג'ל מבוסס החלבון, יש לתקן תחילה מחט בגודל 23 על מזרק מיליליטר אחד בעזרת בוכנה לחוצה.

לאחר מכן, חותכים צינור פוליטטרפלואורואתילן בגודל 10 סנטימטר, או PTFE, באמצעות סכין גילוח. חבר את המחט והמזרק לקצה אחד של צינור ה-PTFE. הכנס את הקצה השני של הצינור לתמיסת סילאן ומלא את הצינור על ידי החזרת בוכנת המזרק.

השאירו את הצינור למשך כ-30 דקות. לאחר מכן, הסר את תמיסת הסילאן וייבש את הצינור באוויר דחוס. כעת, ערבבו את תמיסת החלבון עם APS ו-Tris(bipyridine)ruthenium(II)כלוריד בשפופרת של 1.5 מיליליטר באמצעות יחס נפח קבוע.

מערבולת את התמיסה הפוטו-אקטיבית עד לערבוב מלא. לאחר מכן, צנטריפוגה את התערובת במהירות מקסימלית כדי להסיר בועות מהתמיסה. בועות יכולות להיווצר בזמן העמסת תערובת ההידרוג'ל הפוטו-אקטיבית לתוך צינור הטפלון, מה שמוביל לנזק לדגימה.

כדי למנוע היווצרות בועות, שמור את קצה צינור הטפלון בתערובת התמיסה במהלך תהליך הטעינה והחזר את בוכנת המזרק לאט. הכנס את הקצה הפתוח של צינור ה-PTFE המטופל לתערובת הפוטו-אקטיבית ושאב את התמיסה לתוך הצינור על ידי החזרת בוכנת המזרק. כעת, הנח את הצינור הטעון במרחק של כ-10 סנטימטרים ממנורת כספית של 100 וואט כדי למנוע חימום ושמור אותו שם עד 30 דקות בטמפרטורת החדר.

הסר את הצינור מהמחט וחתוך את שולי הצינור ליד קצוות ההידרוג'ל בעזרת סכין גילוח. לאחר מכן, השתמש במחט קהה בגודל 24 כדי להוציא את ההידרוג'ל לתמיסת Tris. בדוק ויזואלית את הג'לים לאיתור פגמים שעלולים להיווצר במהלך האקסטרוזיה או עקב בועות והשליך ג'לים פגומים.

הפעל את תוכנית בקרת המכשיר והפעל את מנוע סליל הקול. לאחר מכן, הגדר את מיקום הסליל לערך לקראת סוף הטווח. הזיזו את הווים בכיוון Z ויישרו אותם בעיקול בכיוון X.

לאחר מכן, רשום את הערכים של ברגי המיקרומטר לכיוון X. כעת, קשרו קשר כפול רופף בקצה גדיל התפר, כך שקוטר הלולאה הוא כארבעה מילימטרים. לאחר מכן, חתכו את הלולאה מהגדיל.

חזור על הפעולה כדי ליצור לולאה שנייה. לאחר מכן, הנח את שתי הלולאות על הוו המחובר לחיישן הכוח. מלאו את תא הניסוי במאגר טריס והעבירו את דגימת ההידרוג'ל לתא המלא באמצעות פינצטה רפואית.

הנח את ווי סליל הקול וחיישן הכוח קרוב למשטח התמיסה ויישר את הווים לכל הכיוונים עם מניפולטורי המיקום XYZ. בעזרת פינצטה רפואית, תלו את שני הצדדים של דגימת החלבון הידרוג'ל על הווים המחוברים לסליל הקול ולחיישן הכוח. שגיאה אופיינית היא הידוק יתר של לולאות התפרים סביב דגימות ההידרוג'ל במהלך תהליך ההצמדה.

זה עלול להוביל להיווצרות חריץ וחיתוך של דגימת ההידרוג'ל. הדק בזהירות לולאת תפר אחת סביב דגימת ההידרוג'ל על וו סליל הקול על ידי החזקת שני קצוות לולאת התפר בפינצטה רפואית ומשיכתם בו זמנית. חזור על שלב זה עבור הלולאה המחוברת לחיישן הכוח.

הדק את לולאות התפרים בעיקולים של כל וו כדי למנוע החלקה. השתמש בכיפופים אלה כנקודות ייחוס כדי למצוא את ההפרדה האפסית בין הווים. חותכים את האורכים העודפים של התפרים בעזרת מספריים רפואיים.

הזז את ההידרוג'ל המצורף באמצעות מניפולטורים Z לאורך ציר Z לכיוון תא הניסוי כדי לטבול את ההידרוג'ל בתמיסת הניסוי. יישר את דגימת ההידרוג'ל ב-YZ באמצעות המניפולטורים כך שהג'ל לא יהיה בלחץ. אפס את חיישן הכוח והפרד את שני הווים באמצעות שלבי המיקרומטר X עד שהג'ל מתחיל לחוות כוח.

ברגע שזה קורה, סובב מעט לאחור את בורג המיקרומטר בכיוון X. הקלט את המיקום של שני המניפולטורים עבור מנוע סליל הקול והחיישן. לאחר מכן, השתמש בהפרש בין ערכים אלה לאלה שנמדדו בעבר כדי לחשב את ההפרדה המדויקת בין ווי הקשירה בתחילת הניסוי.

כדי לבצע מחזור רמפת כוח על ידי הגדלת הכוח בקצב הטעינה הרצוי, הזן את ערכי הכוח ההתחלתי והסופי, כמו גם את משך הפרוטוקול, המופיע כ-V הפוך, ואחריו כוח נמוך קבוע למשך כ-200 שניות כדי לאפשר לתחומי החלבון להתחדש לפני המחזור הבא. בצע פרוטוקול כוח קבוע על ידי הפעלת כוח נמוך למשך 30 שניות. לאחר מכן, הגדל את הכוח לכוח קבוע למשך פרק זמן מוגדר, ולאחר מכן הרוות את הכוח בחזרה לאותו ערך נמוך למשך יותר מ-300 שניות כדי לאפשר לתחומי החלבון להתחדש ולגמישות הג'ל להתאושש.

לבסוף, בצע ניתוח נתונים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כל מדידה מתחילה בעקומת רפיון. על ידי התאמת שני קווים נקבע כוח האפס על החיישן ואורך הג'ל האמיתי.

אורך הג'ל האמיתי מחושב מצומת ההתאמות ומיקום ברגי המיקרומטר. מערכת הראומטריה של מהדק כוח יכולה ליישם שני סוגים שונים של פרוטוקולים. במצב רמפת הכוח, דגימת ההידרוג'ל חווה פרוטוקול שינוי כוח עם הזמן הדומה למצב כוח הפוך V.In קבוע, המתח המופעל משתנה בדפוס דמוי צעד.

במהלך המדידות, מערכת ה-PID מתאימה את הארכת ההידרוג'ל על ידי שינוי מיקום הסליל כך שיעקוב אחר נקודת ההגדרה המוגדרת מראש מפרוטוקול הכוח. לאחר מכן מחושב המתח על ידי חלוקת הארכה הנמדדת לאורך הג'ל האמיתי. הלחץ נקבע על ידי חלוקת הכוח המופעל לשטח החתך של דגימת ההידרוג'ל.

עקבות רמפת כוח מיוצגות בצורה הטובה ביותר כמתח לעומת מתח. ניתן לחשב את המודול של יאנג ממדידת השיפוע בשלב ההעמסה. ההיסטרזיס נותן את פיזור האנרגיה המגיע מפתיחה וקיפול מחדש של החלבון.

עקבות כוח קבועים מיוצגים בצורה הטובה ביותר כפונקציה של זמן. ניתן להשתמש בשינוי המתח כדי למדוד את קצב הפתיחה והקיפול מחדש על ידי התאמת מעריכי כפול. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לייבש כל סילאן מהצינור לפני הוספת החלבון, לצנטריפוגה של תערובת החלבון להסרת בועות, לבדוק את הבועות לאחר הזרקת תערובת החלבון בתוך הצינור ולהשליך כל הידרוג'ל שניזוק מכנית לאחר שחול מהצינור.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו בהתחלה בהצמדת הג'לים לווים באמצעות התפרים הכירורגיים מבלי לגרום נזק לדגימת ההידרוג'ל. הוצאת הג'ל מהצינור עלולה לפגוע גם בהידרוג'ל. שיטה זו מאפשרת יישום של פרוטוקולי כוח קבוע על דגימות הידרוג'ל בנפח נמוך.

ניסויים אלה מאפשרים ניתוק של ההתנהגות האלסטית והויסקו-אלסטית ולחקור את מכניקת הפתיחה והקיפול של חלבונים בגישה בתפזורת. לאחר פיתוחה, טכניקה זו מאפשרת לחוקרים בתחום מדעי החומרים לחקור ביו-חומרים רכים חדשים כגון הידרוג'לים מבוססי פוליפרוטאינים מהונדסים בעלי פוטנציאל מצוין לשמש כפיגומים להנדסת רקמות, מערכות העברת תרופות ודיו ביולוגי להדפסת תלת מימד. לא רק ששיטה זו מספקת תובנה לגבי המכניקה של הידרוג'לים מבוססי חלבון, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות כגון מדידת התגובה האיזומטרית של סיבי שריר או גמישות של רקמות כמו עור.