Assay מבוססי לזיהוי עיצוב רב טוב ללמוד את ההשפעה של מטריצה חוץ-תאית נוקשות על זיהום חיידקי של תאים חסיד

המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא לאפשר לאפיין את השפעת נוקשות המטריצה החוץ-תאית על זיהום חיידקי של תאים דבקים בצורה כמותית ביותר. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המתפתח של ביומכניקה של פתוגן מארח, כגון מה תפקידם של כוחות מכניים בוויסות הרגישות לזיהום חיידקי של תאים מארחים. טכניקה זו מסייעת ביצירת רצפי וידאו ברזולוציה גבוהה תוך הקרנת מצבים מרובים ואוטומציה של הליכים מסוימים.

לביצוע הפעלת זכוכית של כלים עם 24 בארות, הוסיפו 500 מיקרוליטר נתרן הידרוקסיד טומלו לבאר בקוטר 13 מילימטר ודגרו את הצלחות בטמפרטורת החדר למשך שעה. השליכו את הנתרן הידרוקסיד והשתמשו במים טהורים במיוחד כדי לשטוף את הבארות פעם אחת. לאחר מכן הוסיפו 500 מיקרוליטר של שני אחוז טריאתוקסילאן ב-95% אתנול לכל באר ודגרו אותם למשך חמש דקות.

במים יש לשטוף את הבארות פעם אחת. לאחר מכן הוסיפו 500 מיקרוליטר של 0.5% גלוטרלדהיד לכל באר ודגרו על הצלחות למשך 30 דקות. לאחר שטיפה פעם אחת במים, יש לייבש את הצלחות בחום של 60 מעלות צלזיוס כשהמכסה סגור.

לייצור הידרוג'לים בעלי קשיחות מתכווננת, הכינו תמיסות מימיות המכילות שלושה עד 10 אחוזים מתמיסת אקרילאמיד של 40% מלאי ו-06 עד 6 אחוזים מתמיסת ביס-אקרילאמיד של שני אחוזים, בהתאם לקשיחות הרצויה של ההידרוג'ל. לאחר מכן, מוסיפים את המים. עבור כל נוקשות, פתרון 1 נטול חרוזים, ואילו פתרון 2 מכיל 03%0.1 מיקרומטר מיקרו-חרוזים פלואורסצנטיים.

Degas Solutions One ו-Two בוואקום למשך 15 דקות כדי לסלק חמצן שיעכב פילמור. לאחר מכן, תוך כדי פעולה מהירה, הוסף 0.43% TEMED ו-0.6% מפתרון ה-APS של 10 גרם למיליליטר לפתרון One. הוסף 3.6 מיקרוליטר מהתמיסה למרכז כל באר של המנה בת 24 הבארות.

השתמש מיד בהחלקות כיסוי עגולות בגודל 12 מילימטר כדי לכסות את הבארות ולתת לתמיסה לשבת במשך 20 דקות כך שהיא תתפלמר במלואה. הקש בעדינות על מחט מזרק על משטח קשה כדי ליצור וו קטן בקצהו כדי להקל על הסרת החלקות הכיסוי, ולאחר מכן השתמש במחט כדי להרים את החלקות הכיסוי. לאחר מכן, הוסף 0.43% TEMED ו-0.6% מפתרון ה-APS של 10 גרם למיליליטר לפתרון השני.

לאחר מכן הפקידו 2.4 מיקרוליטר מהתערובת על גבי החלקות הכיסוי העגולות בגודל 12 מילימטר. הנח את החלקות הכיסוי העגולות עם טיפה של תמיסה שתיים על גבי שכבת הפוליאקרילאמיד הראשונה והשתמש במלקחיים כדי ללחוץ בעדינות כלפי מטה כדי להבטיח שעובי השכבה השנייה יהיה מינימלי. לאחר מכן הניחו לפתרון שתיים להתפלמר למשך 20 דקות.

הוסף 500 מיקרוליטר של 50 מילי-מולרי HEPES pH 7.5 לכל אחת מהבארות והשתמש במחט המזרק ובמלקחיים כדי להסיר את החלקות כיסוי הזכוכית. כדי לעקר את ההידרוג'לים, הניחו אותם במכסה המנוע של תרבית רקמות וחשפו אותם ל-UV למשך שעה. כעת, הכינו תערובת של 0.5% משקל לנפח של Sulfo-SANPAH ואחוז אחד DMSO ו-50 מילי-מולרי HEPES pH 7.5.

הוסף 200 מיקרוליטר מהתמיסה למשטח העליון של ההידרוג'לים. לאחר מכן עובדים במהירות, חושפים אותם 302 ננומטר UV למשך 10 דקות כדי להפעיל אותם. השתמש במיליליטר אחד של 50 מילי-מולרי HEPES pH 7.5 כדי לשטוף את ההידרוג'לים פעמיים, וחזור על הפעולה במידת הצורך כדי להסיר עודפי קישור צולב.

ציפוי חלבון את ההידרוג'לים ב-200 מיקרוליטר של 0.25 מיליגרם למיליליטר קולגן זנב עכברוש I ו-50 מילי-מולרי HEPES. דגרו את ההידרוג'לים עם הקולגן בטמפרטורת החדר למשך הלילה. לפני שזורעים את התאים המעניינים על ההידרוג'לים, הוסיפו מיליליטר אחד של מדיום ואזנו אותם בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה.

כדי לזרוע תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים אנושיים, לאחר תרבית והכנת תרחיף תאים על פי פרוטוקול הטקסט, הסר את המדיום מההידרוג'לים, ולאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של תרחיף תאים לכל באר. לאחר הכנת תרבית לילה של L.monocytogenes על פי פרוטוקול הטקסט, העבירו מיליליטר אחד של התרבית לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה וסובבו אותו בטמפרטורה של 2,000 פעמים גרם בטמפרטורת החדר למשך ארבע דקות. לאחר שימוש ב-PBS בדרגת תרבית רקמות כדי לשטוף את הגלולה פעמיים, השתמש במיליליטר אחד של PBS כדי להשעות מחדש את הגלולה.

הכן את תערובת הזיהום על ידי שילוב של 10 או 50 מיקרוליטר של תרחיף החיידקים עם מיליליטר אחד של מדיום מלא MCDB 131 לריבוי זיהום, או MOI, של כ-50 חיידקים לכל תא מארח או 10 חיידקים לכל תא מארח. הסר את המדיום מבארות צלחות 24 הבארות, הקפד לא לשבש את ההידרוג'לים או את התאים. השתמש במיליליטר אחד של MCDB 131 בינוני מלא כדי לשטוף את התאים פעם אחת, ולאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של החיידקים לכל באר.

הניחו את המכסה על הצלחות ועטפו אותן בניילון מזון מפוליאתילן כדי למנוע דליפה. צנטריפוגה של הצלחות ב-2,000 פעמים גרם למשך 10 דקות כדי לסנכרן את הפלישה, ואז לדגור על התרביות ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. עם מדיום מלא MCDB 131, שטפו את הדגימות ארבע פעמים והחזירו אותן לחממת תרבית הרקמות.

לאחר 30 דקות נוספות, החלף את המדיום במדיום מלא MCDB 131 בתוספת 20 מיקרוגרם למיליליטר גנטמיצין. כדי לבצע ציטומטריית זרימה, שמונה שעות לאחר ההדבקה, הסר את המדיום מהבארות של צלחת 24 הבארות והשתמש בתרבית רקמות PBS כדי לשטוף את הבארות פעם אחת. לאחר הסרת ה-PBS, הוסף 200 מיקרוליטר של תערובת קולגנאז טריפסין EDTA לכל באר.

מניחים את המנה בחממת תרבית הרקמה למשך 10 דקות כדי לאפשר ניתוק מלא של התאים. לאחר פיפטינג עדין של כל באר שמונה פעמים, הוסיפו 200 מיקרוליטר של מדיום מלא כדי לנטרל את הטריפסין. העבירו את 400 מיקרוליטר תמיסת התאים מכל באר לצינור פוליסטירן של חמישה מיליליטר עם מכסה מסננת תאים של 35 מיקרומטר.

נתח את הדגימות על ידי ציטומטריית זרימה. לאחר זריעת תאי HMEC-1 על הידרוג'לים של Pa וטיפול בגנטמיצין על פי פרוטוקול הטקסט, דגרו את הצלחת למשך חמש שעות כדי לאפשר למקדם ActA להידלק ולהניע את הביטוי של מסגרת הקריאה הפתוחה mTagRFP. ארבע שעות לאחר ההדבקה, ערבבו מיקרוליטר אחד של מיליגרם אחד למיליליטר צבע Hoechst עם מיליליטר אחד של L-15 מדיום מלא והוסיפו אותו לכל באר כדי להכתים את הגרעינים.

לאחר דגירה של התאים למשך 10 דקות, החלף את המדיום במיליליטר אחד של מדיום מלא L-15 בתוספת 20 מיקרוגרם למיליליטר גנטמיצין. צלם מיקומים מרובים כל חמש דקות באמצעות תכונת מיקוד אוטומטי כדי לנטר כיצד חיידקי LM מתפשטים דרך חד-שכבות HMEC-1 שנזרעו על הידרוג'לים קשיחים משתנים. כפי שדווח בגרף זה, מדידות AFM בוצעו כדי לאשר את הנוקשות המדויקת של הידרוג'לים Pa שהוכנו באמצעות הפרוטוקול בסרטון זה.

כאן, תאי HMEC-1 על מטריות בעלות קשיחות שונה נדבקו בזן LM המבטא סמן פלואורסצנטי לאחר הפנמה המאפשר רק זיהוי של חיידקים תוך-תאיים. התאים גודרו באמצעות תרשים הפיזור קדימה מול צד וצעד שער שני לא כלל תאים שהפגינו אוטופלואורסצנטיות. ניתוח ציטומטריית זרימה גילה כי זיהום LM היה גדול בערך פי שניים בהידרוג'לים נוקשים של 70 קילופסקל לעומת 0.6 קילופסקל הידרוג'לים.

כדי לבדוק אם הידבקות מוגברת של LM ל-HMEC-1 הגבירה את פלישת ה-LM ל-HMEC-1, או שניהם, היו אחראים לרגישות המוגברת לזיהום זמן קצר לאחר הדבקה ב-LM המבטא GFP באופן מבנה, תאי HMEC-1 תוקנו וחיידקים שנדבקו הוכתמו בנוגדנים. כפי שמוצג כאן, היו הרבה יותר חיידקים שנדבקו ל-HMEC-1 כאשר התאים המארחים שוכנים על ג'ל נוקשה בהשוואה לכמוסות רכות. בהתאם לנתוני ציטומטריית הזרימה, ישנם הרבה יותר חיידקים המופנמים על ידי HMEC-1 כאשר תאי המארח שוכנים על נוקשים בהשוואה לג'לים רכים.

לאחר השליטה, ניתן לבצע בדיקה זו תוך כשלושה ימים, מכיוון שנדרשים שלבי דגירה ארוכים בין לבין. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להיות סטרילי ככל האפשר כדי להבטיח שההידרוג'לים ותאי המארח נקיים מזיהום. בעקבות הליך זה, ניתן לשלב שיטות אחרות כגון מיקרוסקופ כוח אטומי כדי לענות על שאלות כגון כיצד הנוקשות של תאי המארח משתנה עם הדבקה והאם השפעה זו תלויה בנוקשות המטריצה.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום המכנוביולוגיה לחקור את תפקידם של אינטראקציות ביומכניות של פתוגנים של תאים מארחים על ידי שימוש בתאים מארחים שונים, כגון תאי האפיתל, ופתוגנים חיידקיים שונים, כגון Rickettsia parkeri. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לייצר הידרוג'לים בעלי קשיחות מתכווננת על צלחות מרובות בארות וכיצד לבצע את בדיקת הזיהום. אל תשכח שעבודה עם חיידקים פתוגניים עלולה להיות מסוכנת.

לכן, יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון הכנסת מחסומים בין מקום הכניסה לפתוגן, כמו גם מניעת יצירת אירוסולים בעת ביצוע הליך זה.