Name: דור של Cationic Nanoliposomes למסירה יעיל של במבחנה עיבד RNA שליח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: למד לייצר ננוליפוזומים קטיוניים בשיטת הסרט היבש למסירת mRNA תרפויטי. השיטה מגבירה את קליטת ה-mRNA בתאים ואת ביטוי החלבון ללא פגיעה בחייות התאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. דור של Cationic Nanoliposomes (איור 1)
<ol><li>להמיס ליפידים DC-כולסטרול (3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl] כולסטרול הידרוכלוריד) וסמים (dioleoyl phosphatidylethanolamine), נמסר כאבקה, ב כלורופורם להשגת ריכוז סופי של 25 מ"ג/מ"ל. הערה: אחסן את שומנים מומסים ב-20 ° C.</li>
	<li>לעבוד עם תמיסת ליפידים שתי מניות 25 מ"ג/מ"ל. µL מיקס 40 של מומס DC-הכולסטרול, µL 80 של הסם מומס בבקבוקון זכוכית. הערה: כמות השומנים הכולל הוא 3 מ"ג. כדי למנוע אידוי מהיר של ההרדמה, במקום ליפידים על קרח במהלך pipetting.</li>
	<li>לאדות את הכלורופורם למשך 15 דקות תחת תזרים גז ארגון. לאחר מכן, למלא את desiccator של סיליקה ג'ל, למקם את הבקבוק פתוח זכוכית בתוך ולהחיל ואקום למשך הלילה כדי לוודא כי הכלורופורם הנותרים הוא התאדה, סרט השומנים נוצר בתוך הבקבוק זכוכית. הערה: עובד מהר, יש להימנע ממגע מיותר של2 O.</li>
	<li>נתרענן הסרט השומנים בנוי עם 1 מ"ל של מים נטולי נוקלאז מערבולת המתלה למשך 15 דקות (איור 2 א). לאחר מכן, מניחים את המתלים לתוך אמבט sonication לשעה (איור 2B). הערה: ההשעיה תהיה מעט עכורים.</li>
	<li>להרכיב את מכבש מיני לפי הוראות היצרן, ממלאים מזרק עם השומנים ההשעיה, ולמקם את המזרק מלא ולא עם מזרק ריק משני צידי המתקן. הקש את השומנים ההשעיה דרך הקרום של מזרק אחד לשני, 20 x – x 25, כדי הבלטת ההשעיה (איור 2C). הערה: גודל NLps נקבעת לפי גודל הנקבוביות הקרום משמש.</li>
	<li>אחסן את NLps בקבוקון זכוכית ב 4 ° C עד שימוש נוסף. הערה: לאחר זמן אחסון ממושך, NLps יוצבו באמבטיה sonication שוב למשך 15 דקות על ידי 35 קילו-הרץ כדי לעקוף את היווצרות מורכבות.</li>
</ol>2. במבחנה שעתוק של ה-mRNA סינתטי
<ol><li>להכין את eGFP-הקידוד mRNA בעקבות הפרוטוקול שפורסם מוקדם יותר34.</li>
	<li>להגביר את רצף eGFP מ פלסמיד עם 0.7 מיקרומטר פארווערטס (5'-TTG GAC CCT מס רווחי הון ACA גה GCT AAT ACG-3') ולא הפוך (5'-T120 CTT CTT מעשה חטיבתי GCT TTA TTC AAA GAC CA-3') תחל ופולימראז את קיט עם ה-PCR.<ol>
<li>מערבבים µL 20 של פתרון מאגר מסחרי אשר משנה את אופן הפעולה ההיתוך של DNA (טבלה של חומרים), כמו גם µL 20 של המיקס 5 x הערכה פולימראז. להוסיף 7 µL של כל פריימר (ואחורה).</li>
		<li>להוסיף 25 ng של פלסמיד eGFP התערובת, 2 µL של פולימראז הערכה פולימראז. הערה: לשמור את פולימראז על הקרח לפני pipetting זה הפיתרון.</li>
		<li>להוסיף נטולת נוקלאז H2O לתערובת, עד נפח של 100 µL.</li>
		<li>להפעיל את מחזורי PCR thermocycler בעקבות פרוטוקול טבלה 1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לטהר את רצף ה-DNA קידוד eGFP עם ערכת טיהור PCR.<ol>
<li>לכן, לערבב את פתרון ה-PCR עם 500 µL מאגר איגוד הערכה ולהשתמש בה כדי למלא עמודות טיהור.</li>
		<li>Centrifuge את העמודות במהירות המרבית עבור 1 דקות וזורקים את פילטרט.</li>
		<li>הוסף µL 750 מאגר לשטוף את העמודה, צנטריפוגה שוב בקצב המרבי מהירות של 1 דקות, ולמחוק את פילטרט.</li>
		<li>חזור על השלב צנטריפוגה 1 x כדי להסיר את המאגר המסנן עמודה.</li>
		<li>להעביר את העמודה צינור 1.5-mL טריים.</li>
		<li>להוסיף 20 µL של נוקלאז ללא H2O העמודה, תקופת דגירה של 1 דקות, צנטריפוגה עבור 1 דקות במהירות המרבית. חזור על שלב זה.</li>
		<li>למדוד את הריכוז של ה-DNA עם photometer ואחסן אותו ב-20 ° C.</li>
		<li>ביצוע הניתוחים איכות הדנ א באמצעות אלקטרופורזה בג'ל. להוסיף 0.5 גר' agarose במאגר טריס-בוראט-EDTA (TBE), לחמם אותו במיקרוגל בחום גבוה עד agarose זה התפרקה לחלוטין.</li>
		<li>להוסיף 5 µL של פתרון ג'ל מכתים agarose נוזלי, למלא את הפתרון אל החדר ג'ל והמתן עד הג'ל הוא polymerized.</li>
		<li>מיקס 200 ng של ה-DNA עם 2 µL של 6 x בטעינת צבע ומילוי היא אמצעי הקצה של µL 12-Pipette סולם הדנ א, כמו גם את דגימת דנ א, לתוך הבארות ג'ל ולהפעיל את אלקטרופורזה מאובטח ב- 100 וולט.</li>
		<li>לנתח את הג'ל באמצעות תחנת ג'ל-ניתוח תחת אור UV.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לרוץ שעתוק במבחנה ליצירת mRNA של רצף הדנ א עם במבחנה שעתוק ערכת המכיל T7-פולימראז, תחליף את נוקלאוטידים ששונה UTP, CTP עם ענבל-UTP, מתיל-CTP.<ol>
<li>עבור במבחנה שעתוק, מערבבים את החומרים הבאים בטבלה 2. הערה: להחליף 1.5 µL של מתיל-CTP עם 1:10 Cy3-CTP מעורבבת עם H ללא נוקלאז2O במהלך שעתוק במבחנה של eGFP mRNA כדי להשיג Cy3-מצב רוח mRNA.</li>
		<li>דגירה המיקס התגובה IVT במשך 4 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>להוסיף 1 µL של DNase. אני מפולימראז T7 קיט, דגירה זה למשך 15 דקות על ידי 37 ° C כדי לעכל את תבנית ה-DNA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>כדי לטהר את ה-mRNA, להשתמש ערכת ניקיון RNA.<ol>
<li>ממלאים את התמהיל IVT לנפח של 100 µL עם H ללא נוקלאז2O.</li>
		<li>להוסיף 350 µL של פירוק מאגר, מיקס על ידי pipetting למעלה ולמטה.</li>
		<li>מוסיפים 250 µL של 100% אתנול ומערבבים שוב. Pipette את התערובת לתוך העמודות ' ניקוי '.</li>
		<li>צנטריפוגה 15 s ב- 8,000- g ולהשליך פילטרט של.</li>
		<li>להוסיף 500 µL של המאגר כביסה לעמודה, צנטריפוגה שוב על 15 s ב- 8,000 x gוהסר פילטרט של.</li>
		<li>לשטוף את העמודה 1 x עם 500 µL של המאגר לשטוף, צנטריפוגה למשך 2 דקות ב x 8000 g.</li>
		<li>להעביר את העמודה לתוך צינור התגובה 1.5-mL טריים. Elute את ה-mRNA 2 x על ידי דגירה 1-מין של 20 µL של נוקלאז ללא H2O בממברנה עמודה, ואחריו צנטריפוגה 1-מין במהירות המרבית.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הסר את קבוצות פוספט mRNA באמצעות ערכת dephosphorylation. להוסיף µL 4.5 מאגר פוספטאז x 10 ו- 1 µL של פוספטאז mRNA, תקופת דגירה של h 1-37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לטהר את ה-mRNA שוב, בצע את הפעולות 2.5.1 - 2.5.7.</li>
	<li>למדוד את concertation mRNA עם photometer.</li>
	<li>להשתמש בג'ל כדי לנתח את הטוהר ואת גודל mRNA. לכן, להכין עם ג'ל agarose כמתואר בצעדים 2.3.9 - 2.3.10.<ol>
<li>3.3 מיקס µL formamide, µL 1 של 37% פורמלדהיד, µL 1 של 10 x גברים, µL 1.7 של 6 x טוען לצבוע עם 200 ng של mRNA ממלאים אותו עד 10 µL נטולת נוקלאז H2O עבור כל דגימה ו RNA סמן.</li>
		<li>דגירה המיקס 10 דקות ב 65 ° C עבור ה-mRNA דנטורציה. לטעון הבארות של הג'ל עם ה-mRNA, סמן RNA ולהפעיל את הג'ל מאובטח ב- 100 וולט.</li>
		<li>לנתח את הג'ל באמצעות תחנת דוק ג'ל עם אור UV.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. complexation של mRNA סינתטי
<ol><li>להפשיר את mRNA סינתטי בקרח, מערבולת שזה, צנטריפוגה זמן קצר לפני לפתוח את הצינור.</li>
	<li>מיקס 10 µL של mRNA סינתטי (ריכוז ה-mRNA הוא 100 ng/µL) עם 1 µL, 2.5 µL, 5 µL, 10 µL או 20 µL של NLp השעיה (ריכוז NLp הוא 3 מ"ג/מ"ל). צנטריפוגה בקצרה, תקופת דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר (RT) עבור מבנה nanolipoplex. הערה: אל תערבב בין על-ידי pipetting. זה יכול להוביל אובדן נפח. מערבולת זמן קצר עבור ערבוב יסודי.</li>
	<li>להוסיף 1 מ"ל של תא רגיל בינוני nanolipoplexes ומערבבים אותם על-ידי pipetting למעלה ולמטה.</li>
</ol>4. ניתוח של יעילות כימוס Nanoliposomes
<ol><li>כדי לבצע את הניסויים כימוס, להשתמש בערכה כימות RNA.</li>
	<li>הכן את הפתרון עובד על ידי דילול של 1:200 הפלורסנט עבור מגוון גבוהה ו- 1:2,000 עבור וזמינותו נמוכה-טווח. הערה: להפשיר את הפלורסנט על קרח. הכינו את הפתרון עובד ישירות לפני השימוש.</li>
	<li>להכין את טווח גבוה וטווח נמוך רגיל עקומות באמצעות 1 מ"ל של פתרון 2 µg/mL במלאי של eGFP mRNA ב H נטולת נוקלאז2O. הערה: על העיקולים רגיל, השתמש mRNA שישמש בניסויים אנקפסולציה.</li>
	<li>השתמש בטבלה 3 עבור הכנת תקן גבוהה-טווח (20 ng/mL-µg 1/mL).</li>
	<li>על תקן נמוכה-טווח, לדלל eGFP 2 µg/mL mRNA מניות פתרון 1:20 להשגת ריכוז סופי של 100 ננוגרם למ"ל. להכין תקן נמוכה-טווח (1 ng/mL - 50 ng/mL) כפי שמתואר בטבלה 4.</li>
	<li>לשלב 1 µg של eGFP ה-mRNA (10 µL) ו- 7.5 µg של NLps (2.5 µL) דגירה במשך 20 דקות ב- RT. הערה: לשמור את ה-mRNA על קרח כדי למנוע השפלה.</li>
	<li>להוסיף 1 מ"ל של נוקלאז ללא H2O טופס nanolipoplexes, מיקס על ידי pipetting למעלה ולמטה.</li>
	<li>להוסיף 1 מ"ל של 1:200 או 1:2,000 של הפתרון עובד של RNA הפלורסנט דגימות שעברו אנקפסולציה, תקנים, תקופת דגירה של 5 דקות ב RT בחושך.</li>
	<li>Pipette את הסטנדרטים ודוגמאות שבו כפילויות לתוך צלחת 96-ובכן שחור ולמדוד את זריחה ב- 530 ננומטר על קורא microplate (איור 3).</li>
</ol>5. הכנה של התאים תקנים
<ol><li>צלחת 1.5 x 105 A549 תאים/טוב של צלחת 12-ובכן 1 י לפני תרביות תאים.</li>
	<li>תקופת דגירה התאים-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 תא רגיל בינוני (גלוקוז DMEM/גבוהה עם 10% עוברית שור סרום [FBS], 2 מ מגלוטמין, 1% פניצילין/סטרפטומיצין) של 24 שעות לפני תרביות תאים.</li>
</ol>6. תרביות תאים של תאי
<ol><li>לשטוף את מוכנה תאים x 1 עם mL 1/PBS טוב (בלי Ca2 /Mg2 +).</li>
	<li>להוסיף 1 מ"ל של תערובת nanolipoplex מוכן, המכיל µg 1 של ה-mRNA מקופל לתוך 1-µL, 2.5-µL, 5-µL, 10-µL או NLps 20-µL, אל באר אחת של צלחת מוכנה עם תאים A549 eGFP.</li>
	<li>להוסיף את המתלים nanolipoplex לתאים, דגירה על התנאים הקבועים במשך 24 שעות ביממה לנתח את היעילות תרביות תאים, או במשך 24 שעות ביממה ו- 72 h כדי לנתח את הכדאיות תא לאחר תרביות תאים. הערה: תרביות תאים עם NLps לא דורשת את שינוי בינוני.</li>
</ol>7. ניתוח של תאים תקנים יעילות Cytometry זרימה באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית
<ol><li>הסר את תגובת שיקוע, לשטוף את התאים עם 1 מ"ל/טוב PBS (ללא Ca2 +/Mg2 +) כדי להסיר את NLps הנותרים.</li>
	<li>להכין את התאים cytometry זרימה.<ol>
<li>Trypsinize התאים עם 500 µL/טוב טריפסין/EDTA (0.05%) ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות להפסיק את התהליך, בטל את טריפסין על-ידי הוספת כמות זהה (500 µL טוב) של בינוני המכילים FBS רגיל.</li>
		<li>Centrifuge את התאים עבור 5 דקות ב x 400 גרם , הסר בזהירות את תגובת שיקוע בלי לגעת בגדר התא.</li>
		<li>לשטוף את התאים עם 1 מ"ל ל- PBS (ללא Ca2 /Mg2 +).</li>
		<li>Resuspend תאי µL 300 בפתרון קיבוע 1 x ולהעביר את התאים לתוך צינורות cytometry זרימה.</li>
		<li>לנתח את התאים-488 ננומטר ב cytometer זרימה (איור 4A). הערה: מערבולת התאים 1 x ישירות לפני מדידה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין את התאים פלורסצנטיות מיקרוסקופ.<ol>
<li>לתקן את התאים עם 1 מ ל/טוב 100% מתנול, אשר אוחסן בעבר ב-20 ° C.</li>
		<li>להוסיף 500 nM µL/טוב 300 דאפי (4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole) התפרקה ב- PBS (ללא Ca2 +/Mg2 +), תקופת דגירה של 5 דקות בחושך.</li>
		<li>הסר את הפתרון דאפי ולשטוף את התאים שוב עם 100% מתנול המאוחסנים ב-20 ° C.</li>
		<li>לנתח את התאים באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (איור 4B). הערה: השתמש אורכי הגל עירור/פליטה הבאים: eGFP 488/509 ננומטר, דאפי 358/461 nm ו Cy3 550/570 ננומטר.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. תא הכדאיות Assay
<ol><li>להמיס 5 מ"ג של MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium ברומיד) 1 מ"ל של RPMI (ללא פנול אדום). הערה: MTT מומס חייב להיות עוד יותר 1:10 מדולל (הריכוז הסופי: 0.5 מ"ג/מ"ל) ב- RPMI לפני השימוש.</li>
	<li>לשטוף את התאים transfected 3 x עם 1 מ ל/טוב PBS (ללא Ca2 +/Mg2). הערה: השרידים של המדיום תא רגיל לחלוטין להסירם.</li>
	<li>להוסיף 500 µL/טוב של 1:10 מדולל MTT פתרון על התאים ואת תקופת דגירה של 4 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>להסיר את הפתרון MTT מתאי לאחר דגירה ולהוסיף µL 500/דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) טוב. דגירה שוב 10 דקות ב 37 º C.</li>
	<li>Pipette הפתרון דימתיל סולפוקסיד ברחם לתוך צלחת 96-ובכן ברור-התחתון ולמדוד את ספיחה-540 nm באמצעות קורא microplate.</li>
	<li>הגדר את הכדאיות של התא ללא טיפול ב- 100% ולחשב את הכדאיות תא של קבוצות אחרות לעומת תאי בקרה ללא טיפול (איור 5).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול הציג מתאר את הדור של NLps עם יעילות גבוהה כימוס של mRNA לאכסון שונה, כמו גם של תרביות תאים אמין של תאים במבחנה. יתר על כן, NLps להבטיח את שחרורו של mRNA, אשר בתורו, מתורגם חלבון פונקציונלי בתוך התאים. בנוסף, transfections באמצעות NLps יכול להתבצע במדיום תא רגיל, וכתוצאה מכך גבוהה תא viabilities במהלך תרביות תאים, והאחרונה עד שלושה ימים לאחר תרביות תאים.
להשתמש mRNA טיפולית, עצמי בהרכבת מערכת העברת היא עדיפה. ריאגנטים הנפוץ ביותר תרביות תאים כוללים cationic שומנים, כולל ליפוזו...

השימוש של mRNA שונה עבור יישומים טיפוליים הראו פוטנציאל גדול האחרונים של שנים. מחלות לב וכלי דם, דלקתיות, monogenetic, כמו גם בפיתוח חיסונים, ה-mRNA הוא מבטיח התרפויטי1.
חלבון בתחליפי עם ה-mRNA מציע כמה יתרונות על פני הטיפול הגנטי הקלאסית, אשר מבוססת על תרביות תאים DNA לתוך תאי היעד2. הפונקציה mRNA יוזם ישירות ב- ציטוזול. למרות את פלסמיד דנ א (pDNA), הבונה של גדילי כפול, מעגלי DNA המכיל אזור יזם רצף גנטי קידוד של חלבון טיפולית3, גם במעשי ציטוזול, זה ניתן רק לשלב לתוך תאים אשר עוברים מיטוזה בזמנו של תרביות תאים. זה מפחית את מספר התאים transfected1,רקמת4. באופן ספציפי, תקנים של רקמות עם פעילות מיטוזה חלש, כגון תאי לב, הוא קשה5. בניגוד pDNA, תרביות תאים של תרגום של mRNA להתרחש mitotic ותאי mitotic ב רקמות1,6. שילוב נגיפי DNA לתוך הגנום המארח עשוי לבוא עם אפקטים מוטגניות או החיסון תגובות7,8, אך לאחר תרביות של תאים תאים עם קידוד החלבון mRNA, דה נובו הסינתזה של החלבון הרצוי מתחיל באופן עצמאי9,10. יתר על כן, ניתן להתאים את סינתזת חלבונים דווקא הצורך של המטופל באמצעות מינונים בודדים, ללא מפריע הגנום ולסכן אפקטים מוטגניות11. הפוטנציאל הפעלת החיסונית של mRNA לאכסון שנוצר יכול להיות הוריד באופן דרמטי באמצעות uridine הדמה ו- 5'-methylcytidine במקום uridine, cytidine12. Uridine מדומה mRNA שונה יש גם הוכח להיות יציבות ביולוגית מוגברת ו translational קיבולת גבוה משמעותית של13.
כדי שתוכל להפיק תועלת מן המאפיינים המבטיח של מבוסס ה-mRNA טיפול ביישומים רפואיים, זה חיוני כדי ליצור הרכב המתאים עבור הובלה של mRNA לתוך התא. הרכב הזה צריך לשאת רעיל מאפיינים במבחנה ויוו, להגן על ה-mRNA נגד נוקלאז השפלה וספק ספיגת הסלולר מספקת זמינות ממושך, תרגום של mRNA14.
בין כל סוגי נושא אפשרי למסירה ויוו סמים, כגון פחמן, נקודות קוונטיות ליפוזומים, האחרון היה למד ביותר15,16. ליפוזומים הם שלפוחית המורכב השומנים bilayer10. הם amphiphilic עם הידרופוביות וכן מקטע הידרופיליות, דרך הסדר עצמית של מולקולות אלה, שכבה כפולה כדורית הוא בנוי17. בתוך ליפוזומים, סוכני טיפולית או סמים יכול להיות אנקפסולציה, לפיכך, מוגן מפני השפלה אנזימטי18. ליפוזומים המכיל N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium כלוריד (DOTMA)19[1, 2-bis (oleoyloxy)-3-פרופאן (trimethylammonio)] (DOTAP)20ו- dioctadecylamidoglycylspermine (כלבים)21, או DC-כולסטרול22, ובכן מאופיין, שימוש תכוף עבור תרביות תאים סלולריים עם ה-DNA או RNA.
ליפוזומים cationic מהווים ליפופרוטאין הטעון חיובית של פוספוליפיד לא טעונים23. תרביות תאים באמצעות ליפוזומים cationic הוא אחת השיטות הנפוצות ביותר עבור הובלה של חומצות גרעין לתוך תאים24,25. החלקיקים השומנים cationic בצורה מתחמי עם קבוצות פוספט טעונים שלילית עמוד השדרה של מולקולות של חומצות גרעין26. אלה lipoplexes כביכול לצרף פני השטח של קרום התא והזן את התא באמצעות אנדוציטוזה או אנדוציטוזה-כמו-מנגנונים27.
בשנת 1989, מאלון ואח. בהצלחה תיאר cationic בתיווך השומנים mRNA תרביות תאים28. אולם, באמצעות תערובת של DOTMA ושל 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (סמים), הקבוצה מצאו כי DOTMA בא לידי ביטוי תופעות ציטוטוקסיות28. בנוסף, Zohra. et al. הראה כי DOTAP (1, 2-dioleoyloxy-3-trimethylammonium-פרופאן כלוריד) יכול לשמש ריאגנט תרביות תאים mRNA29. עם זאת, עבור תרביות תאים יעיל של תאים, DOTAP אמור לשמש בשילוב עם חומרים כימיים אחרים, כגון fibronectin29 או סמים30. עד כה, DOTMA היה השומנים cationic הראשונה בשוק המשמש עבור משלוח ג'ין31. ליפידים אחרים משמשים להגנה טיפולית או במקצועות בשלבים שונים של ניסויים קליניים (למשל, EndoTAG-אני, המכיל DOTAP כנשא שומנים בדם), כעת נחקרת ב שלב-II קליניים משפט32.
עבודה זו מתארת את פרוטוקול עבור הדור של NLps המכיל כולסטרול DC וסמים. שיטה זו מקלה על ביצוע ומאפשר את הדור של NLps בגדלים שונים. המטרה הכללית של דור NLp שימוש בשיטת סרט יבש היא ליצור ליפוזומים עבור complexation mRNA, ובכך מאפשר את תרביות תאים תאים מסתיימים ויעילה במבחנה14,33.

<table><tbody><tr><td>(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)</td><td>AppliChem, דרמשטדט, גרמניה</td><td>A2231</td><td></td></tr><tr><td>(3&beta;-[N-(N&prime;,N&prime;-dimethylaminoethane)-carbamoyl]כולסטרול הידרוכלוריד (DC-כולסטרול</td>)<td>Avanti, אלבמה, ארה"ב</td><td>700001</td><td></td></tr><tr><td>4&nbsp; &prime;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td><td>Thermo Fisher Scientific, דרמשטדט, גרמניה</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>BD FACScan system</td><td>BD Biosciences, היידלברג, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Fix (10x)</td><td>BD Biosciences, היידלברג, גרמניה</td><td>340181</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Merck, דרמשטדט, גרמניה</td><td>102445</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td><td>Serva Electrophoresis GmbH, היידלברג, גרמניה</td><td>20385.02</td><td></td></tr><tr><td>Dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE)</td><td>Avanti, אלבמה, ארה"ב</td><td>850725</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>Zeiss Axio, Oberkochen, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific, דרמשטדט, גרמניה</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>מיני מכבש</td><td>Avanti, אלבמה, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מים נטולי נוקלאז</td><td>Qiagen, הילדן, גרמניה</td><td>129114</td><td></td></tr><tr><td>Opti-Mem</td><td>Thermo Fisher Scientific, דרמשטדט, גרמניה</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>מאגר PBS (w/o Ca2+/Mg2+)</td><td>Thermo Fisher Scientific, דרמשטדט, גרמניה</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>ערכת ריאגנט RNA Quant-iT Ribo Green</td><td>Thermo Fisher Scientific, דרמשטדט, גרמניה</td><td>Q33140</td><td></td></tr><tr><td>RPMI (עם פנול אדום)</td><td>Thermo Fisher Scientific, דרמשטדט, גרמניה</td><td>11835030</td><td></td></tr><tr><td>ג'ל סיליקה</td><td>קארל רוט, קרלסרוהה, גרמניה</td><td>P077</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA (0.05%)</td><td>Thermo Fisher Scientific, דרמשטדט, גרמניה</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>HotStar HiFidelity Polymerase</td><td>Kit Qiagen, הילדן, גרמניה</td><td>202602</td><td></td></tr><tr><td>ערכת טיהור PCR QIAquick</td><td>Qiagen, הילדן, גרמניה</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td> Pseudouridine-5'-Triphosphate (&Psi;-UTP)</td><td>TriLink Biotechnologies, סן דייגו, ארה"ב</td><td>N-1019</td><td></td></tr><tr><td>5-Methylcytidine-5'-Triphosphate (Methyl-CTP)</td><td>TriLink Biotechnologies, סן דייגו, ארה"ב</td><td>N-1014</td><td></td></tr><tr><td>ציאנין 3-CTP</td><td>PerkinElmer, בייסוויילר, גרמניה</td><td></td><td></td>NEL580001EA</tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen, הילדן, גרמניה</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>ערכת תמלול MEGAscript T7</td><td>Thermo Fisher Scientific, דרמשטדט, גרמניה</td><td>AM1333</td><td></td></tr><tr><td>3&acute;-O-Me-m7G(5')ppp(5')G מבנה כובע RNA אנלוגי</td><td>מעבדות ביולוגיות ניו אינגלנד, איפסוויץ', ארה"ב</td><td>S1411L</td><td></td></tr><tr><td>פוספטאז אנטארקטי</td><td>חדש England Biolabs, איפסוויץ', ארה"ב</td><td>M0289S</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific, דרמשטדט, גרמניה</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Biotium, פרמונט, ארה"ב</td><td>41003</td><td></td></tr><tr><td>peqGOLD DNA סולם</td><td>תערובת VWR, פנסילבניה, ארה"ב</td><td>25-2040</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen 0.5-10kb סולם RNA</td><td>פישר סיינטיפיק, G&ouml; teborg, שבדיה</td><td>11528766</td><td></td></tr></tbody></table>

דור של cationic nanoliposomes למסירה יעיל של במבחנה עיבד rna שליח

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

הפיתוח של RNA שליח (mRNA)-מבוסס הרפוי עבור הטיפול במחלות שונות הופך יותר ויותר חשוב בגלל החיובי מאפייני במבחנה עיבד mRNA (IVT). עם העזרה של IVT mRNA, דה נובו הסינתזה של חלבון הרצוי יכולה להיגרם ללא שינוי מצב פיזיולוגי תא היעד. יתר על כן, חלבון ביוסינטזה אפשר לשלוט בדיוק בגלל ההשפעה ארעית של IVT mRNA.
עבור תרביות תאים יעיל של תאים, nanoliposomes (NLps) עשוי לייצג רכב משלוח בטוח ויעיל עבור mRNA טיפולית. מחקר זה מתאר פרוטוקול ליצירת יעילה ובטוחה cationic NLps המורכב של DC-כולסטרול, 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (סמים) כמו וקטור משלוח עבור IVT mRNA. NLps נתקל מוגדרת גודל, התפלגות אחידה, וקיבולת גבוהה complexation, ולא יכול להיות מיוצר בשיטת סרט יבש. יתר על כן, אנו מציגים מערכות בדיקה שונים כדי לנתח את complexation שלהם, תרביות תאים efficacies באמצעות סינתטי משופרת חלבון פלואורסצנטי ירוק (eGFP) ה-mRNA, כמו גם את השפעתם על יכולת הקיום התא. בסך הכל, פרוטוקול שהוצגו מספקת גישה יעילה ובטוחה mRNA complexation, אשר עשוי לקדם ולשפר את הממשל של mRNA טיפולית.

באמצעות פרוטוקול כמתואר, NLps המורכב של ליפידים DC-כולסטרול וסמים הוכנו באמצעות השיטה יבש-סרט (איור 1). במהלך ההכנות, הפתרון nanoliposome מציג שלבים שונים עכירות (איור 2).
ניתן ואז לנתח את היעילות כימוס של NLps לאחר העטיפה של µg 1 של mRNA קידוד eGFP על-ידי ניתוח הסכום חינם של mRNA, אשר היה לא עוברת אנקפסולציה, באמצעות ערכת כימות RNA (איור 3...

כאן נתאר פרוטוקול לדור של cationic nanoliposomes, אשר מבוססת על שיטת יבש-סרט והוא יכול לשמש עבור הכספת, אספקה יעילה של במבחנה עיבד RNA שליח.

דור של Cationic Nanoliposomes למסירה יעיל של במבחנה עיבד RNA שליח

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive ...

פרוטוקול זה מאפשר ייצור של ננו-ליפוזומים בטוחים ויעילים אשר יכולים לשמש כלי רכב transfection עבור RNA שליח טיפולית. ננו-ליפוזומים אלה מאפשרים ספיגת mRNA בתאים וכתוצאה מכך רמות ביטוי חלבון מוגברות מבלי להשפיע על הכדאיות של התא. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא דור מהיר וקל של ננו-ליפוזומים יציבים עם גודל מוגדר והפצה הומוגנית.יתר על כן, הם מגנים על mRNA אנקפסולציה מפני השפלה ולהוביל לתרגום ממושך. הפגנת ההליך תהיה אנטוניה לינק, דוקטורנטית מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל בהליך זה, להכין פתרונות מלאי עבור שומנים, DC-כולסטרול ו DOPE על ידי המסת כל אחד כלורופורם לריכוז סופי של 25 מיליגרם למיליליטר.מערבבים 40 מיקרוליטרים של כולסטרול DC מומס עם 80 microliters של DOPE מומס בבקבוק זכוכית. לאדות את הכלורופורם תחת זרימת גז ארגון במשך 15 דקות. לאחר מכן, מלאו את היודשן בג'ל סיליקה.מניחים את בקבוק הזכוכית הפתוח בפנים ולהחיל ואקום לילה כדי להבטיח כי כלורופורם הנותר מתאדה. סרט השומנים שנוצר ייווצור בתוך בקבוקון הזכוכית. למחרת, להוסיף מיליליטר אחד של מים ללא גרעין כדי rehydrate הסרט השומנים.ומערבולת ההשעיה במשך 15 דקות. מניחים את ההשעיה לתוך אמבטיה sonication במשך שעה אחת. לאחר מכן, להרכיב את extruder מיני על פי הוראות היצרנים.ממלאים מזרק עם ההשעיה הנוזלית ומ מניחים אותו בצד אחד של האלט. מניחים מזרק ריק בצד השני. לחץ על השעיית השומנים דרך הממברנה ממזרק אחד לשני, כ 20-25 פעמים כדי להבלט את ההשעיה.לאחר מכן, לאחסן את nanoliposomes בבקבוק זכוכית בארבע מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש. ראשית, להפשיר את mRNA סינתטי על קרח. מערבולת mRNA קפוא ולאחר מכן צנטריפוגה זה זמן קצר לפני פתיחת הצינור.לאחר מכן, מערבבים מיקרוגרם אחד של mRNA סינתטי עם כמויות שונות של השעיה nanoliposome. צנטריפוגה לזמן קצר דגירה בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות עבור היווצרות nanolipoplex. לאחר מכן, מוסיפים מיליליטר של מדיום תא רגיל לננו-ליפופלקס ומערבבים על-ידי צינור למעלה ולמטה.הכינו את התאים יום אחד לפני ההתהפוכיות. לכן, צלחת 150, 000 תאים A549 לתוך כל באר של 12 צלחת גם יום אחד לפני transfection. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני ובינוני תא רגיל במשך 24 שעות.ואז למחרת, לשטוף כל באר של תאים מוכנים פעם אחת עם מיליליטר אחד של PBS. מוסיפים מיליליטר אחד של תערובת ננו-ליפופלקס מוכנה לאחת מה בארות המכילות את תאי A549. דגירה בתנאים קבועים במשך 24 שעות כדי לנתח את יעילות transfection, או במשך 24-72 שעות כדי לנתח את הכדאיות התא לאחר transfection.הסר את supernatant ולשטוף כל באר עם מיליליטר אחד של PBS כדי להסיר את הננו-ליפוזומים הנותרים. כדי להכין את התאים לציטומטריה, ראשית להוסיף 500 microliters של טריפסין EDTA לכל באר דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות כדי לנסות את התאים. לאחר מכן, להוסיף 500 microliters של מדיום רגיל המכיל FBS כדי לעצור את התהליך ולהשבית את טריפסין.צנטריפוגה התאים ב 400 פעמים G במשך חמש דקות. ובזהירות להסיר את supernatant מבלי להפריע גלולת התא. לשטוף את התאים עם מיליליטר אחד של PBS.ואז להשעות מחדש את התאים ב 300 microliters של פתרון קיבוע התא ולהעביר אותם לתוך צינורות cytometry זרימה. השתמש בציטומטר זרימה כדי לנתח את התאים ב 488 ננומטר. כדי להכין את התאים למיקרוסקופיה פלואורסצנטית, מוסיפים מיליליטר אחד של מתנול צונן לכל באר כדי לתקן את התאים.הוסף 500 מיקרוליטרים של פתרון 300 ננומולרים של DAPI מומס PBS לכל באר. דגירה בחושך במשך חמש דקות. לאחר מכן, להסיר את פתרון DAPI ולשטוף את התאים שוב עם 100% מתנול שאוחסן בעבר במינוס 20 מעלות צלזיוס.השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לנתח את התאים באמצעות אורכי גל העירור וההפלה המוצגים כאן. במחקר זה, ננו-ליפוזומים נוצרים עם יעילות אנקפסולציה גבוהה עבור mRNA שונה לאכסון. באמצעות ערכת כימות RNA, יעילות אנקפסולציה של nanoliposomes ניתן לנתח לאחר אנקפסולציה של מיקרוגרם אחד של mRNA קידוד eGFP על ידי ניתוח הכמות החופשית של mRNA אשר אינו עקיף.לאחר אנקפסולציה של mRNA EGFP בכמויות שונות של nanoliposomes, nanolipoplexes נוצר יכול להיות דגירה עם תאים במבחנה ואת אחוז התאים eGFP-expressing ניתן לנתח באמצעות cytometry זרימה 24 שעות לאחר ההמרה. כפי שניתן לראות כאן, אפילו רק מיקרוליטר אחד של פתרון nanoliposomes מספיק כדי להשיג transfection גבוה של התאים invitro. כאשר התאים מגולמים עם ננו-ליפוזומים המכילים Cy3 שכותרתו eGFP mRNA, נוכחות של mRNA eGFP בציטופלסמה, כמו גם חלבון eGFP המיוצר כבר, ניתן לדמיין.מאז transfection של תאים באמצעות nanolipoplexes יכול להיות השפעות שליליות על תאים, הכדאיות של התאים נבדק לאחר 24 שעות ו 72 שעות לאחר transfection. לא ניתן היה לזהות השפעות על הכדאיות של התאים כאשר התאים טופלו עם 2.5 או חמישה מיקרוליטרים של ננו-ליפופלקסים. כאשר מנסים הליך זה, חשוב לזכור לעבוד בסביבה ללא אתנול כל הזמן כי זה יכול לפגוע ביציבות nanoliposome.בעת הכנת ערבוב DC-כולסטרול עם DOPE, אתה צריך להשתמש פיפטה זכוכית כדי למנוע זיהום של שומנים מומס עם רכיבים מסיסים של טיפים פיפטה פלסטיק. בעקבות פרוטוקול זה, nanoliposomes שנוצר ניתן לתפעל בקלות במהלך או אחרי ההכנה. לדוגמה, שילוב של מולקולות PEG או נוגדנים ספציפיים יוביל ליציבות מוגברת או ליזום מיקוד רקמות פעילות.nanoliposomes שנוצר למלא את ההיבטים הבטיחות הדרושים להקל על ספיגת mRNA לתאי היעד. Nanoliposomes מורכב עם nRNA טיפולי ספציפי יכול לתרום תרומה חיונית לפיתוח של טיפולים מבוססי mRNA הרומן בתחום הנדסת רקמות או טיפול חלופי למשל.

generation-cationic-nanoliposomes-for-efficient-delivery-vitro

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

זריקות רטרו מסלולית חוזרות ונשנות של מתחמי קטיוני liposomes/siRNA/ITSN-1s בעכברים, בכל 72 שעות למשך 24 ימים, ביעילות לספק דופלקס siRNA לmicrovasculature ריאות עכבר הפחתת mRNA ITSN-1S וביטוי חלבון על ידי 75%. טכניקה זו היא שחזור מאוד במודל של בעלי חיים, אין לו תופעות לוואי ונמנע הרוגים.

השתקה ארוכת טווח של Intersectin-1S בעכבר על ידי משלוח ריאות חוזר ונשנה של siRNA ספציפי באמצעות ליפוזומים קטיוני. הערכה של השפעות מציאה על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים

מטרת פרוטוקול זה היא להשתמש בליפוזומים קטיוניים/אניונים עם פפטיד ממוקד עצבי כמערכת העברת מערכת העצבים המרכזית כדי לאפשר ל-siRNA לחצות את ה-BBB.  אופטימיזציה של מערכת אספקה לטיפולים, כמו siRNA, תאפשר אפשרויות טיפול נוספות לפריונים ומחלות ניווניות אחרות.

משלוח siRNA טיפולית על מערכת העצבים המרכזית באמצעות קטיוני anionic ליפוזומים

אנו מתארים שיטה של שימוש polyethyleneimine (פיי)-מצופה חלקיקי תחמוצת ברזל פאראמגנטי עבור מקרופאגים transfecting עם siRNA. חלקיקים אלה יכולים להעביר ביעילות siRNA מקרופאגים במבחנה , ויוו , שתיקה ביטוי גנים היעד.

חלקיקי תחמוצת ברזל מצופה Polyethyleneimine כרכב למסירה של RNA מפריעות קטן כדי מקרופאגים במבחנה , In Vivo

שיטות להכין ולאפיין את המאפיינים הפיסיוכימיים ואת אתריים של מחויב נייטרליים, מגיב pH-תגובה sirna מוצגים. הקריטריונים של siRNA nanomedicines מוצלחת כגון גודל, מורפולוגיה, טעינה משטח, העמסה siRNA, והשתקה גנים נדונים.

הכנת מנטרל-טעון, pH-מגיבים חלקיקים פולימריים עבור משלוח ציטוזה מסירה

חלקיקי שומנים מפותחים באמצעות גישה פלטפורמת ערבוב microfluidic עבור mRNA ו- DNA אנקפסולציה.

גיבוש ואפיון חלקיקי שומנים בדם לאספקת גנים באמצעות פלטפורמת ערבוב מיקרופלואידית

מיקרופלוידי מבוסס שומנים ננו חלקיקים (LNP) שיטות הייצור משכו תשומת לב במערכות אספקת תרופות (DDSs), כולל אספקת RNA. פרוטוקול זה מתאר את הייצור, ייצור LNP (siRNA טעון LNP) ותהליכי הערכת LNP באמצעות המכשיר המיקרופלואידי המקורי שלנו בשם iLiNP.

ייצור חלקיקי שומנים טעונים siRNA באמצעות מכשיר מיקרופלואידי

באמצעות שימוש בפולימר קטיוני פולימרי זול פוליאתילן (PEI), ייצרנו חלקיקים לנטי-ויראליים לביטוי יציב של shRNA בתאי גזע עובריים אנושיים H9 (hESCs) ותאי אב עצביים שמקורם ב-H9 (NPCs) שעברו התמרה חולפת ביעילות גבוהה.

Lentiviral מתווך אספקה של shRNA ל- hESCs ו- NPCs באמצעות פולימר קטיוני בעלות נמוכה Polyethylenimine (PEI)

ננו-חלקיק פפטיד-פולוקסאמין בהרכבה עצמית (PP-sNp) פותח באמצעות מכשיר ערבוב מיקרופלואידי כדי לתמצת ולהעביר רנ"א שליח מתועתק במבחנה . ה-mRNA/PP-sNp המתואר יכול להעביר ביעילות תאים בתרבית במבחנה.

טרנספקציה יעילה של mRNA מתועתק במבחנה בתאים בתרבית באמצעות ננו-חלקיקים פפטיד-פולוקסאמין

כאן מוצג פרוטוקול לניסוח ננו-חלקיקי שומנים (LNPs) המכילים mRNA המקודד לוציפראז גחלילית. LNPs אלה נבדקו על עוצמתם במבחנה בתאי HepG2 ו-in vivo בעכברי C57BL/6.

בדיקת יעילות In Vitro ו-In Vivo של ננו-חלקיקי mRNA-ליפידים שנוסחו על ידי ערבוב מיקרופלואידי

הודגם פרוטוקול מפורט לסינתזה של ננו-חלקיקי שומנים (LNPs) באמצעות טכנולוגיות מיקסר סילון פוגע כלוא (CIJ), כולל CIJ דו-סילוני ומערבל מערבולות רב-סילוני בעל ארבעה סילונים (μMIVM). מערבלי CIJ יוצרים סביבות מיקרו-ערבוב טורבולנטיות הניתנות לשחזור, וכתוצאה מכך מייצרים LNPs חד-מפוזרים.

סינתזה של ננו-חלקיקי שומנים על ידי זרימה טורבולנטית במערבלי סילון פוגעים מוגבלים

למד לייצר ננוליפוזומים קטיוניים בשיטת הסרט היבש למסירת mRNA תרפויטי. השיטה מגבירה את קליטת ה-mRNA בתאים ואת ביטוי החלבון ללא פגיעה בחייות התאים.

דור של Cationic Nanoliposomes למסירה יעיל של במבחנה עיבד RNA שליח

גלה סרטונים נוספים