מיפוי קשרי מבנה-פונקציה של גורמי שעתוק אונקוגניים מופרעים באמצעות ניתוח תמלול

ביצוע ניתוח תפקודי מבנה על גורמי שעתוק חוזרים ומופרעים הוא קשה. על ידי צימוד טרנסקריפטומיקה עם ההקשר התאי הנכון, גישה זו חושפת טוב יותר קשרים חשובים בתפקוד המבנה. שימוש בריצוף RNA כפלט פונקציונלי מאפשר הערכה יעילה של כל הגנים המווסתים על ידי חלבון יחיד בניסוי אחד, מה שמגדיל את הסיכוי לזיהוי תפקוד חלקי.

זיהוי תפקוד חלקי חשוב במיוחד עבור גורמי שעתוק היתוך אונקוגניים, מכיוון שאיננו יודעים כיצד חלבונים אלה מתפקדים וריצוף שלהם יכול להוביל לטיפולים טובים יותר בסרטן מונע היתוך. למרות שנתמקד בתחום ה-EWS הלא מסודר ב-EWS/FLI, EWS מעורב באיחויים אחרים המכילים תחומי הפרעה עם פונקציות מוגדרות בצורה גרועה. עבור ביטוי cDNA מבנה התמרה תחילה, הפשירו במהירות את הנגיף הקפוא עם מבני cDNA באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס וערבבו בעדינות 2.5 מיקרוליטר של שמונה מיליגרם למיליליטר פוליברן לכל נבל.

לאחר מכן, הסר את המדיום מצלחת תרבית תאים אחת של 50 עד 70% 10 סנטימטר לכל מבנה בקבוקון ועקוף בעדינות את כל נפח המיליליטר של המבנה במורד הצלחת. נדנד את הצלחת כדי להפיץ את הנגיף באופן שווה על פני התאים והנח את הצלחת באינקובטור תרבית רקמות של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים, ונדנד את הצלחת כל 30 דקות כדי למנוע התייבשות של אזורים בצלחת. בתום הדגירה מוסיפים חמישה מיליליטר של מדיום בתוספת סרום בקר עוברי, אנטיביוטיקה, נתרן פירובט ופוליברן.

לאחר דגירה של לילה בחממת תרבית התאים החלף את הסופרנטנט במדיום ברירה והחזיר את התאים לחממת תרבית התאים למשך שבעה עד 10 ימים נוספים כדי לאפשר ברירה וביטוי מבנה cDNA. בתום תקופת הבחירה, אספו את התאים לצינור חרוטי של 15 מיליליטר לספירה והקצו 5 עד 10 פעמים 10 לתאים החמישיים לצינור חדש לריצוף RNA ופעמיים 10 לששת התאים לצינור חדש נוסף למיצוי חלבון. משקעים את התאים על ידי צנטריפוגה והשעיה מחדש של הכדורים במיליליטר אחד של PBS קר או צנטריפוגה של חמש דקות.

לאחר מכן הקפיא את הכדורים ואת החנקן הנוזלי ואחסן את התאים במינוס 80 מעלות צלזיוס. כדי לאמת את הפלת החלבונים המעניינים ואת הביטוי של פאנל המבנים, יש למחוק את דגימות הליזאט של החלבון בנוגדנים הראשוניים והמשניים המתאימים על פי פרוטוקולי ניתוח כתמים מערביים סטנדרטיים. כדי להעריך את איכות וכמות ה-RNA, השתמש במאגר הליזיס מערכת מיצוי מבוססת עמודת ספין סיליקה כדי ללכוד את דגימות תאי ריצוף ה-RNA ולהחיל את הליזטים על עמודת הסרת DNA גנומית במהירות של יותר מ-13,000 סיבובים לדקה למשך 30 עד 60 שניות.

לאחר מכן, המשך בטיהור עמוד ספין סיליקה ושטוף את ה- RNA על העמוד בהתאם להוראות הערכה. לאחר מכן יש להוציא את ה-RNA ב-30 מיקרוליטר של מאגר פליטה ולנתח לפחות 2.5 מיקרוגרם של RNA על ספקטרופוטומטר ביחס של 260 עד 280 ננומטר כדי להעריך את כמות ה-RNA ואיכות הדגימה. לניתוח קבצי fastq השתמש במרק כדי לפתוח את הטרמינל לסביבת המחשוב בעלת הביצועים הגבוהים וליצור ספריית ניתוח בשם project.

נווט אל הנתיב לספריית הפרויקט וצור ספרייה עבור קבצי fastq. gz הגולמיים הדחוסים בשם fastq וספרייה שנייה בשם cutmmed. לנו תוכנית העברת קבצים מאובטחת מתאימה להעברת ה- fastq הגולמי הדחוס.

gz מאחסון מקומי לנתיב לספריית Project FastQ ובדוק שיש קובץ R1 ו- R2 עבור כל דוגמה. נווט לנתיב לפרויקט fastq והשתמש בפקודה בקיצוץ בשפע כפי שמצוין כדי לקצץ את הקריאות באיכות נמוכה מה-fastq. קובצי GZ.

נווט אל הנתיב לספריית הפרויקט וצור ספרייה חדשה בשם פלט STAR. נווט אל הנתיב לספריית החיתוך של הפרויקט והשתמש בפקודה כפי שצוין כדי להפעיל את STAR כדי ליישר את ה-fastq החתוך. קובצי GZ.

אתר את הפלט הנדרש עבור השלבים הבאים, המכילים את הספירה לכל תעתיק במיקום המצוין והשתמש בפקודה כדי לקרוא בכל קובץ כרטיסייה של קריאות לכל גן. עבור העמודה הראשונה השתמש רק בתווים שלפני הנקודה בעמודה מזהה הגן ENSEMBL כדי להקל על העיבוד במורד הזרם. לאחר מכן השתמש בפקודה כדי להרכיב את הספירה של כל הדגימות לתוך מסגרת הנתונים הנקראת totcts ולשמור את הטבלה החדשה הזו של נתוני ספירה גולמיים כקובץ טקסט מופרד בטאבים.

כדי להגדיר את פרופיל הביטוי הדיפרנציאלי עבור כל מבנה באמצעות DESeq2, הזן את עיצוב DESeq2 הניסיוני והשתמש במערך הנתונים של DESeq מפונקציית מטריצה כדי לבנות מערך נתונים של DESeq כדי להעריך את גורמי הגודל ולהפעיל את DESeq2. כדי להעריך את איכות הניתוח, השתמש ב-DESeq2 כדי לחלץ את ספירת הנורמליזציה של היומן הרגיל. בעת חילוץ התוצאות עבור כל פרופיל שעתוק מתוצאות DESeq2, בצע השוואות זוגיות בהתייחס למצב הנוקדאון או לווקטור הריק של קו הבסיס.

תקן עוד יותר את התוצאות הללו עם סמלי הגן HGNC וחלץ את הנתונים מנתוני DESeq2 כקובץ יחיד עם מזהה הגן ENSEMBL, סמל HGNC, ביטוי baseMean ונתוני ביטוי דיפרנציאלי עבור כל המבנים עם שינוי כפול של יומן וערכי P גולמיים ומותאמים. העריכו את הנורמליזציה המוצלחת של האצווה ואת הדמיון בין דגימת העניין, והשתמשו בקוד כדי להשתמש בספירות המנורמלות של היומן המוסדר כדי לבדוק את אשכולות הדגימה עם ניתוח רכיבים עיקריים ותרשימי מרחק של דגימה לדגימה. השתמש בספירות המנורמלות של היומן הרגיל כדי לחלץ את 1,000 הגנים המשתנים ביותר למטריצה והשתמש במפת חום כדי לבצע אשכולות היררכיים ללא פיקוח של הדגימות המבוססות על גנים אלה.

כדי לחלץ את אשכולות העניין מהדנדרוגרמה, החליטו איזו רמה של אשכולות העניין של הדנדרוגרמה מופיעים והגדירו את K שווה למספר האשכולות באותה רמה. כדי לקבוע אילו אשכולות מעניינים, שרטטו מחדש את מפת החום מסודרת לפי אשכול וייצאו את רשימת הגנים המשויכים לכל אשכול בטבלה, ולאחר מכן השתמשו בכלי ביואינפורמטי מתאים כדי לזהות את התפקידים הביולוגיים של אשכולות הגנים השונים שזוהו והושוו בין המחלקות. בניתוח מייצג זה ניתן לראות נוקדאון והצלה יעילים עם המבנים החיוביים והשליליים.

שימו לב שתאים שהצילו DAF לא הצליחו ליצור מושבות, מה שמרמז על טרנספורמציה אונקוגנית לקויה. לאחר השלמת אימות הרפליקנטים, ניתן לקבל בדיקות פנוטיפיות וספירת גנים ראשונית של עיבוד נתוני ריצוף RNA עבור כל הדגימות לצורך נורמליזציה וניתוח אצווה. DESeq2 ללא נורמליזציה של אצווה עלול לגרום לפגמים מבלבלים באצווה, ככל הנראה עקב שונות ביולוגית המוכנסת על ידי מעבר תאים בתרבית והבדלים בעיבוד של כל אצווה.

לאחר נורמליזציה של אצווה, ניתן להשתמש ב-DESeq2 כדי ליצור פרופילי שעתוק עבור המבנים המעניינים, ביחס לקו הבסיס. ניתוח רכיבים עיקריים עבור נתונים אלה מצביע על כך שפרופיל השעתוק של DAF הוא ביניים, בין EWS/FLI מסוג פרא לדלתא 22, המאשר תפקוד חלקי. יתר על כן, אשכולות היררכיים של 1,000 הגנים המשתנים ביותר על פני דגימות מראה כי DAF לא מצליח לדכא את גני המטרה של EWS/FLI, ושומר רק באופן חלקי על פעילות הפעלת הגנים.

ניתוח גנים מוביל מצביע על כך שמחלקות הגנים ש-DAF מפעיל נבדלות מבחינה תפקודית מאותן מטרות המופעלות על ידי EWS/FLI שבהן DAF אינו מתפקד. מעניין לציין ש-DAF מסוגל להציל גנים המופעלים על ידי מיקרו-לוויין GGAA, אך אינו מסוגל להציל גנים מופעלים ליד אתר זיקה גבוה. זיווג הפלט הטרנסקריפטומי עם המבחנים הפנוטיפיים הרלוונטיים משלים את ניתוח פונקציית המבנה.

חוקרים יכולים גם להשתמש בטכניקות אחרות כדי לחקור את המניעים המכאניסטיים של פונקציות שעתוק שונות.