פרופיל תאי בתפוקה גבוהה של תרכובות ממוקדות לפירוק חלבונים באמצעות קווי תאי HiBiT CRISPR
November 9th, 2020
פרוטוקול זה מתאר את הגילוי הכמותי של קינטיקה של פירוק חלבונים בתאים חיים שהונדסו באמצעות CRISPR/Cas9 כדי לבטא תג זיהוי חלבון אנדוגני נטול נוגדנים שהתמזג עם חלבון מטרה. הוראות מפורטות לחישוב וקבלת פרמטרי השפלה כמותיים, קצב, Dmax, DC 50 ו- Dmax50 כלולים.
גישה זו מאפשרת ניטור תאי של פירוק חלבונים וסינון מהיר של תרכובות מתכלות. ניתן לנטר את הדינמיקה של השפלה בהקשר תאי בצורה רגישה וכמותית ביותר, המאפשרת קביעה מדויקת של פרמטרי השפלה מרכזיים. שיטות אלו מאפשרות פרופיל HTS של פעילות תרכובת משפילה, מה שמאפשר טריאז' בשלב הגילוי הטיפולי המוקדם.
הם גם מספקים תובנה לכל מי שרוצה לחקור אפנון של רמות יעד אנדוגניות, בין אם הן עולות או יורדות. מי שתדגים את ההליך תהיה סיליה ביסבאך, מדענית חוקרת במעבדה שלי. התחל בהכנה וציפוי של תאי דבקות או תרחיף.
התאם את צפיפות התאים ל-2.22 כפול 10 לתאים החמישיים למיליליטר והחלק אותם לצלחות עם מינימום שלוש בארות לכל תנאי ניסוי ובקרה. הכן PROTAC בדילול סדרתי, או צלחות תרכובת בדיקה משפילות, בריכוז פי 1000 ב-100% DMSO. לאחר מכן יש לדלל אותו לריכוז סופי פי 10 במדיום תרבית התאים.
הוסף נפח שווה של DMSO למדיום כדי ליצור בקרת DMSO ללא מורכבות. הוסף את הכמות המתאימה של תרכובת פי 10 או תמיסת בקרה לתאים בצלחת ודגר את הצלחות ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני. כדי למדוד אות זוהר של נקודת קצה, הכן מגיב זיהוי ליטי פי 2 על ידי הוספת 20 מיקרוליטר של מצע ליטי ו-10 מיקרוליטר של חלבון LgBiT עבור כל מיליליטר אחד של המאגר הליטי.
הכן מספיק מגיב לכל הבארות שייבדקו, כולל נפח נוסף כדי לקחת בחשבון שגיאת פיפטינג. הוסף את המגיב לזיהוי ליטי מוכן לתאים וערבב את הצלחת על מערבל מערבולת מיקרופלייט למשך 10 עד 20 דקות ב -350 סל"ד. מדוד זוהר על לומינומטר המסוגל לקרוא צלחת באר 96 או 384.
אם משתמשים בריבוב כדאיות תאים, עשה זאת לפני הוספת המגיב הליטי. 30 עד 40 דקות לפני מדידת נקודת הקצה הרצויה, הכינו תמיסת ריאגנט לזיהוי כדאיות תאים פי 6 על ידי הוספת 10 מיקרוליטר של המצע לשני מיליליטר של מאגר הבדיקה. מוסיפים את המגיב המוכן לבארות ומערבבים קצרות על מערבל מערבולת מיקרופלייט.
לאחר מכן דגרו את הצלחת למשך 30 דקות בחממה של 37 מעלות צלזיוס. בנקודת הקצה הרצויה, מדוד את הקרינה במכשיר המסוגל לקרוא פלואורסצנטיות בפורמט 96 או 384 בארות. הכן מגיב ליטי פי 2 כפי שתואר קודם לכן.
לאחר מכן מוסיפים את המגיב לבארות ומערבבים את הצלחת על מערבל מערבולת מיקרופלייט למשך 10 עד 20 דקות. לאחר הערבוב, השתמש בלומינומטר למדידת זוהר. כדי להדגים ניתוח פירוק ליטי של נקודת קצה בריכוז יחיד, מספר חלבוני מטרה של CDK תויגו באופן אנדוגני עם HiBiT וטופלו ב-PROTAC TL12-186 מבוסס מוח פאן קינאז.
רמת החלבון CDK נמדדה בנקודות זמן שונות, ונקבע ה-RLU החלקי. כדי להבין כיצד חלבוני CDK בהשוואה ישירה זה לזה במונחים של אובדן חלבון, חושבו ה-RLUs החלקיים כפירוק כולל באחוזים. ניתוח פירוק קינטי בוצע על ידי תיוג אנדוגני של חלבונים ממשפחת BET עם תאי HiBiT ו-HEK293 המבטאים ביציבות את חלבון ה-LgBiT.
לאחר מכן טופלו התאים בשלושה ריכוזים שונים של pan-BET PROTACs. ה-dBET6 מבוסס ה-cereblon, וה-ARV-771 מבוסס VHL. פרופילי פירוק תגובת מינון קינטית של תאי Ikaros IKZF1-HiBiT CRISPR Jurkat המבטאים ביציבות חלבון LgBiT שטופלו בארבע תרכובות דבק מולקולאריות שונות מוצגים כאן.
נצפים הבדלים משמעותיים בתגובת הפירוק בין התרכובות, כמו גם בין סדרות הריכוזים. כדי להעריך כמותית את הפירוק ואת סדר הדירוג של התרכובות, נעשה שימוש בפרופילי תגובת המינון לחישוב פרמטרי השפלה מרכזיים כולל קצב הפירוק, מקסימום הפירוק וערכי Dmax50. מבחני מולטיפלקס כדאיות התאים לא הראו אובדן בכדאיות התאים עבור הריכוזים שנבדקו.
השלבים החשובים ביותר בפרוטוקול זה הם קביעת ה-RLU השברירי או אחוז ההשפלה על ידי נורמליזציה לבקרת DMSO. בעקבות פרוטוקול זה, ניתן לבצע בדיקה פנוטיפית כדי להבין כיצד אובדן של חלבון מסוים יכול להשפיע על בריאות התא או תפקודו. בנוסף, ניתן להשתמש בקווי תאי HiBiT אלה גם לחקר אינטראקציות חלבון או קשירת מולקולות קטנות באמצעות טכנולוגיית NanoBRET.
סקירה
פרוטוקול זה מתאר שיטה לגילוי כמותי של קינטיקה של פירוק חלבונים בתאים חיים באמצעות טכנולוגיית CRISPR/Cas9. הוא מספק הוראות מפורטות לחישוב פרמטרים של פירוק כמו קצב ו-Dmax.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- ביולוגיה של תאים
- פירוק חלבונים
- טכנולוגיית CRISPR/Cas9
רקע
- הבנת פירוק חלבונים היא חיונית לבריאות התא.
- CRISPR/Cas9 מאפשרת שינויים גנטיים מדויקים.
- מעקב אחר פירוק יכול לסייע בגילוי טיפולים.
- שיטות כמותיות משפרות את הדיוק של מחקרי פירוק.
מטרת המחקר
- לפתח פרוטוקול למעקב אחר פירוק חלבונים בתאים חיים.
- לאפשר סינון גבוה של תרכובות מפרקות.
- לספק תובנות על ויסות רמות חלבון אנדוגניות.
שיטות בשימוש
- הכנה והטמעה של תאי יונקים בצפיפויות ספציפיות.
- דילול סדרתי של תרכובות PROTAC לבדיקה.
- שימוש בריאגנטים לגילוי זורחים למדידת פירוק.
- חישוב פרמטרים של פירוק מנתוני זורחנות.
תוצאות עיקריות
- מעקב מוצלח אחר קינטיקה של פירוק חלבונים בתאים חיים.
- זיהוי הבדלים משמעותיים בתגובות פירוק בין תרכובות.
- הערכה כמותית של קצבי פירוק וערכי פירוק מקסימליים.
- לא נצפתה אובדן בכדאיות התאים במהלך הניסויים.
מסקנות
- פרוטוקול זה מאפשר את המחקר על דינמיקת פירוק חלבונים.
- ניתן ליישם אותו כדי להעריך את ההשפעה של אובדן חלבון על פונקציות תאיות.
- קווי תאים מתויגים ב-HiBiT מועילים לחקר אינטראקציות חלבונים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This protocol enables quantitative, high-throughput assessment of targeted protein degradation in physiologically relevant cellular contexts, supporting early triage of degrader compounds. By maintaining endogenous expression and regulation of target proteins, it provides predictive confidence in lead optimization and reduces mechanistic ambiguity in discovery pipelines. The approach directly informs go/no-go decisions by linking compound-induced target degradation to measurable phenotypic outcomes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through direct measurement of target protein loss in native cellular environments.
- Operational Value: Supports functional target validation by quantifying degradation kinetics and potency under physiological regulation.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by generating degradation rate, Dmax, and DC50 parameters for lead prioritization.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: CRISPR-engineered HiBiT cell lines provide standardized, reproducible systems for luminescent readout of target degradation.
- Multiplexing Capability: Compatible with cell viability assays to distinguish specific target effects from cytotoxicity during screening.
- Scalability: Luminescent signal detection in 96- or 384-well formats enables high-throughput profiling of degrader compound libraries.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains endogenous protein expression and regulation, improving relevance to in vivo disease models.
- Mechanistic De-risking: Allows correlation of target degradation with functional cellular phenotypes, supporting biomarker-aligned advancement decisions.
- Predictive Confidence: Quantitative degradation profiling reduces late-stage failure risk by confirming target engagement in relevant cellular backgrounds.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows following target identification and preceding lead optimization, providing degradation-competent cellular systems for compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling real-time or endpoint measurement of target protein degradation in live cells.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs (rate, Dmax, DC50) for high-throughput evaluation of degrader compound libraries.
- Analytics: Generates normalized degradation metrics that allow cross-compound comparison and rank-ordering based on target engagement.
- Translational Research: Connects target degradation to functional outcomes via multiplexed viability assays, informing risk-adjusted advancement.
- Enterprise Reuse: HiBiT-tagged cell lines serve as reusable assets across multiple projects targeting different proteins or degradation mechanisms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target modulation, reduces mechanistic ambiguity, and enables functional target validation.
- Operational Value: Ensures assay standardization, reproducibility, and scalability across screening campaigns.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality, enhances capital efficiency, and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of degrader leads based on quantitative degradation profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in CRISPR/Cas9 genome editing and clonal cell line development.
- Dependent on luminescent plate readers capable of 96- or 384-well format detection.
- Necessitates standardization of cell plating density and reagent preparation across wells.
- Adaptation considerations include varying endogenous expression levels and subcellular localization of target proteins.
- Practical limitations include signal dynamic range constraints in highly abundant or rapidly turning over target proteins.
