מיקרופריקציה ביולוגית בסיוע מיקרוסקופיית חמצן במחיר סביר של ספרואידים רב-תאיים

הפרוטוקול מתאר יצירת כדוריות בתפוקה גבוהה להדפסה ביולוגית באמצעות ניתוח רב-פרמטרי של החמצון שלהם ומוות התאים שלהם במיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי. ניתן ליישם גישה זו כדי לשלוט בכדאיות הספרואידים ולבצע סטנדרטיזציה, החשובה במידול רקמה תלת-ממדית, מיקרו-סביבה של הגידול וביו-פבריקציה מוצלחת (מיקרו)של רקמות.

הפרוטוקול שלנו מסייע בהדמיית חמצון של כדוריות רב-תאיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונלי. באמצעות שיטה זו, ניתן לייצר אלפי מיקרוטיסים כדוריים מוכתמים בבדיקת חמצן ולאחר מכן להשתמש בהם ביישומי הדפסה תלת-ממדית. לדוגמה, שתלי רקמת עצם וסקולרית.

בדיקת חמצן אינפרא-אדום קרוב תואמת לשימוש בצבעים אחרים כגון צביעה פלואורסצנטית ירוקה של בסופו של דבר, זה מאפשר ניתוח חי ורב-פרמטרים לטווח ארוך. העבר חותמות PDMS עם מיקרו-דפוס מבקבוקון אחסון לצלחת פטרי סטרילית וייבוש באוויר עם המשטח החלק כלפי מעלה בתנאי זרימת האוויר הלמינרית הסטרילית למשך 10 דקות. שים כל חותמת באמצע הבאר של צלחת תרבית רקמה סטרילית של 12 בארות.

ייבוש באוויר במשך דקה עד שתי דקות עם מכסה פתוח. מכינים 50 מיליליטרים של תמיסת אגרוז הומוגנית של 3% ומיד מוסיפים כשני מיליליטרים של תמיסת אגרוז חם לכל באר של לוחות 12 הבאר כדי לכסות את חותמת ה- PDMS שהוכנסה. יש לחזק את האגרוז במשך 20 דקות על ידי דגירה תחת זרימת אוויר סטרילית.

באמצעות מרית סטרילית, סובבו את האגרוז עם חותמת PDMS מוטבעת במהופך בכל באר. הוסיפו כ-200 מיקרוליטרים של מים סטריליים בצד העליון החלק של הבול. נתקו אותו מהאגרוז עם מרית והסירו אותו מהבאר.

הוסיפו מיליליטר אחד של מדיה תואמת של תרבית תאים סטרילית לבולים האגרוזיים לשימוש ישיר. מכסים את הצלחת במכסה ודוגרים למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. לפני השימוש, מחממים את הלוחות המיקרו-תבניתיים של אגרוז למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור פחמן דו-חמצני.

יש לשטוף בתרבית תאים של 70% עד 90% עם PBS שחומם מראש. מוסיפים תמיסת אנזים מתנתקת ודגירה במשך שלוש עד חמש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. מאוחר יותר, נטרלו את הטריפסין עם מדיית תרבית תאים מלאה המכילה 10% FBS.

כדי לקבל תרחיף של תא בודד, דיסוציאציה של תאים מצטברת באמצעות קצה פיפטה של 1, 000 מיקרוליטר בחלק העליון של הפיפטה הסרולוגית. באמצעות תא ספירה, ספרו את מספר התאים למיליליטר של תרחיף התא. דיללו את תרחיף התא ל-500, 000 תאים למיליליטר והוסיפו לו תמיסת בדיקת חמצן מרוכזת.

הסירו את המדיה הישנה מבארות מיקרו-תבניות של צלחת תרבית התאים המצופה ב-12 בארות והוסיפו מיליליטר אחד של תרחיף התא המוכן לבארות. תרבית את הספרואידים בחממת פחמן דו-חמצני במשך יומיים עד חמישה ימים בנוכחות רציפה של גשושית החמצן כדי להבטיח שהיא נטענת במהלך היווצרות ודחיסת הספרואידים. סגור את הקצה של מחסנית סטרילית של שלושה סנטימטרים מעוקבים עם מכסה קצה ומלא בדיו ביו על ידי צנרת.

הכנס בוכנה למחסנית והחזק אותה במהופך. הסר את מכסה הקצה ודחף את הבוכנה לכיוון הדיו הביולוגי עד להסרת כל האוויר מהמחסנית. קררו את הדיו הביולוגי במעטפת החימום של הביופרינטר ב-23 מעלות צלזיוס.

מרססים את הביופרינטר ב-70% אתנול ומייבשים אותו בנייר סופג. בורג במתאם לחץ בחלק העליון של המחסנית. הרכיבו על המחסנית מחט פוליאתילן חרוטית בעלת 22 מדים.

התקן את המחסנית במעטפת החימום על ראש ההדפסה המבוסס על שחול. חבר את כניסת הלחץ ופתח את התפס בכניסה. טען את קובץ ה- G-code של העיצוב שלך לתוכנת ההדפסה.

התחל במדידת אורך המחט. לווסת את לחץ ההדפסה על ידי חלוקת מעט דיו ביו בצלחת פטרי סטרילית. התקינו צלחת בעלת שש בארות, פתחו את צלחת הבאר, סגרו את מכסה המנוע והדפיסו.

לאחר ההדפסה, הנח לפיגומים להיות מקושרים פיזית במשך 10 דקות בחמש מעלות צלזיוס. הקרין את הפיגומים המודפסים למשך 60 שניות עם מנורת LED אולטרה סגולה. הוסיפו מיד את מדיית הגדילה המתאימה המכילה תמיסת אנטיביוטיקה כפולה לכל הבארות עם רשתות מודפסות ביולוגית.

תרבית את הפיגומים ב 37 מעלות צלזיוס בחממת פחמן דו חמצני. לתצפית מיקרוסקופיה, העבירו רשת וופל מודפסת לכיסוי צלחת מיקרוסקופיה עם מדיית הדמיה. באמצעות פיפטה של מיליליטר אחד, שטפו בעדינות את כדוריות החמצן המוכתמות מראש מבארות המיקרו האגרוזיות והעבירו אותן לצינור תחתון חרוטי של 15 מיליליטר.

כדי להבטיח את איסוף כל הספרואידים מבאר בעלת תבנית מיקרו, שטפו את הבאר אחת עד שלוש פעמים עם מיליליטר אחד נוסף של מדיית התרבית ושלבו את כל ההשעיות הספרואידיות בבקבוקון אחד. השאירו את הבקבוקון אנכי עד 10 דקות כדי לאפשר לספרואידים להתיישב בתחתית. יש להסיר בזהירות את המדיה מהצינור ולהשאיר את הספרואידים ללא הפרעה.

הוסיפו מדיום תרבית טרי שיספיק ל-20 ספרואידים לפחות לכל מנה לדוגמה והחזירו בעדינות את הספרואידים על ידי צנרת. יש להוסיף מיד נפח שווה של תרחיף ספרואידי לכל באר מיקרוסקופיה מצופה מראש. השאירו את הספרואידים למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי להיצמד לפני השטח של המיקרוסקופיה היטב.

מוציאים את המדיום מהמיקרוסקופיה היטב ושוטפים פעם אחת עם מדיית הדמיה. הוסף את הכמות המדויקת של מדיית ההדמיה לדוגמה. הגדר את המיקרוסקופיה היטב עם כדוריות מוכתמות בשלב המיקרוסקופיה.

באמצעות מטרת ההגדלה של 10X, תצוגה מקדימה של הדגימה בתאורת שידור. בצע התמקדות ראשונית בספרואידים, אתר אותם במרכז התמונה והביא את המטרה עם ההגדלה הגבוהה הנדרשת לעמדת העבודה. התמקדו במצב אור שידור בחתך המשווני של הספרואיד.

התאם הגדרות לאיסוף אותות פלואורסצנציה או זרחן של ייחוס ותעלות ספקטרליות רגישות של גשושית החמצן והתחל בתהליך ההדמיה. פתח את קובץ ה- vsi עם נתוני עוצמת בדיקה חמצן מתוך ייחוס וערוצים ספקטרליים רגישים במצב ממוזג. פתח את חלון פונקציית ניתוח היחס מתפריט המדידה.

בחר את עוצמת ערוץ הייחוס כנומרטור ואת עוצמת הערוץ הרגיש כמכנה לחישוב R. בחלון ניתוח היחסים, החל את הגדרות סף העוצמה המתאימות על כל ערוץ ספקטרלי כדי להפחית את הרקע מתמונת העוצמה הממוזגת. מסכות ROI שהוחלו על תמונות ספרואידיות קובעות גבולות ספרואידים.

הגדל את ערכי הסף עד שרקע התמונה יהיה שחור באופן אחיד. בחלון ניתוח היחסים, התאם את מקדם שינוי קנה המידה לתמונת היחס עד שתמונת התצוגה המקדימה תספק את הרזולוציה הרצויה של מעבר הצבע R. התמונה של התפלגות יחס העוצמה מתווספת כשכבה לתמונה הרב-ערוצית המקורית.

בחלון התמונה הרב-ערוצית, הפעל את השכבה באמצעות סרגל צבע שגוי. קבע באופן ידני את גבולות הקישור והניתוק של היסטוגרמה של היסטוגרמה של התפלגות יחס באמצעות אפשרות שינוי קנה המידה הקבועה בחלון התצוגה של ההתאמה. פתח את תמונת אור השידור המתאימה של ספרואידים.

בחר פונקציית סרגל ליניארית ומדוד את קוטר הספרואידים. ייצוא נתונים כקובץ טבלת גיליון אלקטרוני. בחר את ההחזר ההשקעה של הגודל והצורה הנדרשים ויישם אותו על הפריפריה והליבה ההיפוקית של הספרואיד.

שנה את ההחזר על ההשקעה לאובייקט המדידה כדי לנתח את ה-R הממוצע בתוך ההחזר על ההשקעה שנבחר. ייצא נתונים בתבנית טבלה תואמת לגיליון אלקטרוני. החל מדידות על כל מקטע מיקרוסקופיה של ספרואידים כדי לקבל את מערך הנתונים של קוטרי הספרואידים RC ו- RP כדי לבצע חישובים נוספים והשוואה סטטיסטית.

שלב את כל הנתונים בקובץ גיליון אלקטרוני אחד. לגשושית MMIR1 יש הלבנת תמונות נמוכה והיא מתאימה למחקר בזמן אמת של תגובה נשימתית מהירה בספרואידים hDPSC לגירויים שונים במיטוכונדריה. FCCP הציג רק אפקט קל של אי-שיתוף פעולה באזורים מסוימים ולאחר מכן ירידה קלה בנשימה של התאים.

מצד שני, רוטנון עיכב מאוד את הנשימה והוביל לראוקסיגנציה ספרואידית ולפיזור של שיפועי החמצן מהפריפריה לליבה תוך כ-80 שניות לאחר הגירוי. באמצעות חישובי הפרוטוקול האוטומטי של יחס עוצמת פיקסל אחר פיקסל המסופקים על ידי תוכנת ההדמיה, שיפועי חמצן שזוהו בזמן אמת בפריפריה לליבה בכל סוגי הספרואידים מוצגים באמצעות הפריפריה המחומצנת והנישות ההיפוקסיקיות במרכז. הגרפים כאן מתארים פרופילי יחס של חתכי הספרואידים המשווניים עבור סוגים שונים של ספרואידים.

בהשוואה לספרואידים hDPSC הומו-תאיים, לספרואידים הטרוצלולריים hDPSC ל-HUVEC היו שיפועים תלולים יותר באופן משמעותי. שיפוע החמצן מהפריפריה לליבה בספרואידים ההטרוצלולריים נוצר ככל הנראה על ידי hDPSC בהרכבם על פי חמצון כדוריות hDPSC בעל פעילות נשימה חזקה. הגרפים מראים כי לספרואידים hDPSC שהודפסו ביולוגית היה פריפריה מחומצנת באופן משמעותי מאשר לספרואידים שנמדדו לפני ההדפסה הביולוגית, בעוד שלחמצון הליבה שלהם היו ערכים דומים.

אם משקעי בדיקה מזדמנים מפריעים להיווצרות כדורית אחידה, סנן או צנטריפוגציה של תמיסת הגשושית במהירות גבוהה לפני השימוש. תיקון מדידת אורך המחט וויסות הלחץ הם שלבים חיוניים להתאמה לקצב ההדפסה הביולוגית ולקוטר התמוכת ומיקרו-אגרגטים של הדפסה ביולוגית בפיגום נקבובי. בחר את הגדרות המיקרוסקופיה להדמיית גשושיות רגישות לחמצן, בהתחשב בהשפעתן על פוטו-יציבות הבדיקה.

הדמיית חמצן תואמת לסוגים רבים של מדידות מיקרוסקופיה חיה. לאחר ההדמיה, ניתן גם לבצע אימונופלואורסצנציה, לחלץ חלבונים לכתם מערבי, או לבצע ניתוח ביטוי גנים.