יצירת תבניות למיקרוסקופיית מתיחה מיקרופטרן

אנו מתארים שיפורים בשיטה סטנדרטית למדידת כוחות המתיחה התאית, המבוססת על הדפסה מיקרו-קונטרקטית עם שלב דפוס תת-קרקעי יחיד של מערכי נקודות של חלבוני מטריצה חוץ-תאית על הידרוג'לים רכים. שיטה זו מאפשרת ייצור פשוט ועקבי יותר של דפוסי איים, החיוניים לשליטה בצורת צביר התאים.

פרוטוקול זה מאפשר יצירה עקבית של מיקרו-תבניות חלבוניות בעלות נאמנות גבוהה בכל צורה רצויה, במיוחד איים מבודדים של דפוסים לחקר צבירי תאים. ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי ליצור תבניות מיקרו מבודדות של איים בכל צורה וגודל בצעד אחד בלבד, בעוד שבעבר יצירת תבניות כאלה דרשה שני שלבים נפרדים. התחל על ידי ערבוב PDMS ביחס הנכון של סוכן ריפוי לבסיס כמתואר בהוראות היצרן.

דגירה בטמפרטורת החדר ובלחץ במשך 15 דקות, ולאחר מכן דגה את התערובת תחת ואקום במשך 15 דקות. יוצקים את ה-PDMS לתבנית הראשית ומעבירים אותה לחממה שנקבעה ל-37 מעלות צלזיוס כדי לרפא הלילה. הסירו את התבנית הראשית מהאינקובטור ואפשרו לה להתקרר עד לטמפרטורת החדר.

בזמן שהתבנית הראשית מתקררת, תסניעו כיסויים של 25 מילימטרים באתנול למשך 10 דקות. השתמש בכיסויים רבים כמו מספר הבולים המוכנים. יש לשטוף ביסודיות את הכיסויים במי DI ולייבש אותם באמצעות אקדח אוויר מסונן.

טפלו בכיסויים עם פלזמה למשך דקה אחת באמצעות שואב הפלזמה תחת ואקום גבוה. שחררו באיטיות את הוואקום לאחר הטיפול כדי למנוע מהכיסויים לנוע בתוך התא. מצפים כל אחד מהם מכסה ב-100 מיקרוליטרים של תמיסת החלבון המסומנת בפלואורסצנט בחדר נטול אור שמש ישיר או תאורה תקורה.

מכסים את הדגימות להגנה נוספת מפני אור ומדגרים אותן למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. יש לשטוף היטב כל כיסוי במים DI. יש להסיר את עודפי המים מהמשטח על ידי הקשה עדינה על דפנות כל כיסוי על מגבת נייר או על חומר סופג דומה.

אפשרו לכיסויים להתייבש לחלוטין על ידי השארתם חשופים בחושך למשך 30 דקות לפחות. בזמן שהכיסויים המצופים בחלבון מתייבשים, הסירו את חותמת ה-PDMS מהתבנית הראשית על ידי חיתוך שלה עם אזמל או כל להב חד. טפלו בחותמות ה-PDMS עם פלזמה במשך שתי דקות תחת ואקום גבוה.

מניחים את הבולים במיכל עם מכסה מתחת למכסה האדים, ואז מצפים כל בול בשכבה דקה של 10%3-APTMS מדוללת ב-100% אתנול. מכסים את המיכל בבולים ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. יש לשטוף ביסודיות כל חותמת משני הצדדים במי DI.

מניחים את הבולים במיכל נקי ומצפים אותם ב-2.5% גלוטארלדהיד מוכנים במי DI. מכסים את הבולים ומדגרים אותם בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. יש לשטוף היטב את הבולים במי DI.

יש להסיר את עודפי המים מפני השטח כפי שתואר קודם לכן ולאפשר לחותמות להתייבש במשך 30 דקות. אם לאחר 30 דקות הכיסויים המצופים בחלבון או הבולים אינם יבשים לחלוטין, השתמשו באקדח אוויר מסונן כדי לייבש אותם לחלוטין. דחפו את צד התבנית של הבולים אל הכיסויים בלחץ מספיק כדי שיוכלו ליצור מגע מלא.

השאירו אותו ללא הפרעה במשך 15 דקות. לאחר מכן קלפו בזהירות את חותמות ה-PDMS מהכיסויים. באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם המסנן המתאים, בדוק את הנאמנות של הכיסויים המעוצבים.

השתמשו מיד בכיסויים המעוצבים או אחסנו אותם הרחק מאור ישיר עד לשימוש נוסף. לפני הכנת מבשר ההידרוג'ל PAA, הסר את אסטר החומצה האקרילית NHS מהמקרר כדי להגיע לטמפרטורת החדר לפני פתיחתו. מכינים תבשיל כיסוי להחלפה על ידי עיקור שלו עם 70% אתנול, ואז מדגרים אותו תחת אור UV בארון בטיחות ביולוגית לפחות 30 דקות לפני השימוש.

מתחת למכסה האדים, הוסיפו 1.25 מיליליטר של 40% אקרילאמיד המוכן במי DI לצינור חרוטי 15 מיליליטר. לאותו צינור, להוסיף 175 microliters של תמיסת bis-acrylamide מוכן במי DI. לאחר מכן הוסף 500 מיקרוליטרים של 10X PBS, ואחריו 2.915 מיליליטר של מי DI.

מיקרוליטרים של פיפטה 969 של מבשר זה לתוך צינור מיקרו-צנטריפוג של 1.5 מיליליטר ומאחסנים את השאר בארבע מעלות צלזיוס למשך עד שבועיים. יש למדוד 50 עד 100 מיליגרם של APS בצינור מיקרוצנטריפוג' טרי ולדלל אותו ל-100 מיליגרם למיליליטר במי DI. פתחו את אסטר ה-NHS במכסה המנוע ומדדו בזהירות עד שלושה מיליגרם של NHS בצינור מיקרו-סנטריפוג'.

דיללו את אסתר ה-NHS למיליגרם אחד למיליליטר ב-1X PBS. מתחת למכסה המנוע של האדים, הוסיפו שני מיקרוליטרים של TEMED לצינור המיקרוצנטריפוגה המכיל את ה-969 מיקרוליטר אליקוט של מבשר PAA. הוסיפו 15 מיקרוליטרים של HCL טוחנת אחת כדי להפחית את ה-pH של תמיסת ההידרוג'ל ולמנוע הידרוליזה של אסטר NHS.

הוסף 10 מיקרוליטרים של תמיסת האסטר של NHS לצינור. בצע את השלבים הבאים בארון בטיחות ביולוגית. הניחו בזהירות את מכסה ה-30 מ"מ בתוך החלק האמצעי של צלחת הכיסויים עם 3-APTMS וגלוטראלדהיד מטופלים בצד כלפי מעלה והברג את טבעת הפלסטיק למעלה.

הגדר את הכיסוי המעוצב עם חשיפה מינימלית לאור כדי להתכונן לשלב הבא. פיפט חמישה מיקרוליטרים של תמיסת APS לתוך צינור האליקוט המבשר של PAA, ואז הופכים ומערבבים. מיד pipette 35 microliters של תמיסה זו על כיסוי 30 מילימטר.

מניחים את הכיסויים המעוצבים על התמיסה עם צד החלבון כלפי מטה. היזהרו לא ליצור בועות אוויר בהידרוג'ל. הגן על ההידרוג'ל מפני אור ואפשר לו להתפלמר במשך 90 דקות.

לאחר שעבר הידרוג'ל פולימריזציה, השתמשו בסכין גילוח או באזמל כדי להסיר את הכיסוי העליון, ודאו שהכיסוי לא ייפול לאחור או יחליק מהג'ל לאחר שהוסר כדי להימנע מהרס התבנית על פני הג'ל. כדי להעביר כל אסתר NHS שנותרה בהידרוג'ל, הוסיפו שני מיליליטרים של PBS סטרילי לג'ל ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות. מיד להכין את הג'לים לניסויים או לאחסן אותם לילה ב PBS סטרילי בארבע מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.

ההידרוג'לים עוצבו בעקיפין עם פיברונקטין פלואורסצנטי כדי לדמיין ולמדוד את כוחות המתיחה התאית בתוך אשכולות וליצור תבניות איים בגודל ובצורה שנקבעו מראש. איכות התבנית הייתה קשורה ישירות לנאמנות של התבנית הראשית שממנה נוצקה חותמת PDMS. שיטה זו יכולה לייצר תבניות אי מבודדות ומוגדרות היטב בעלות צורה קבועה מראש.

נקודות הידבקות הפיברונקטין היו קיימות רק באזור הרצוי של האי. איים מבודדים אלה של נקודות הידבקות אפשרו עוד יותר שליטה טובה יותר על צורת האשכול. ציפוי חותמות PDMS עם שני 3-APTMS קטנים הוא קריטי מכיוון שהוא יגביל את היעילות של שיטת ההסרה, בעוד שיותר מדי ייצור שאריות כתומות על משטח ההטבעה.

ניתן להשתמש בדפוסים שנוצרו כאן כדי לקבוע את כוחות המתיחה התאית הן בתאים בודדים והן באשכולות, מה שנותן תובנה לגבי יכולתם לשמור על הומאוסטזיס מכני.