מיקרוסקופ גרירה משולב עם מיקרופלואידיקה עבור הגירה קולקטיבית כימוטקטיק

הגירה תא קולקטיבי בפיתוח, ריפוי הפצע, וגרורות סרטן מונחה לעתים קרובות על ידי מעברי הצבע של גורמי גדילה או מולקולות איתות. המתואר כאן היא מערכת ניסיונית המשלבת מיקרוסקופ המתיחה עם מערכת microflu, והפגנה של איך לכמת את המכניקה של הגירה קולקטיבית תחת הדרגתי הביוכימי.

נדידת תאים קולקטיבית מונחית לעתים קרובות על ידי שיפוע של מולקולות איתות. בסרטון זה, אנו מדגימים כיצד לכמת כוחות תאיים במהלך הגירה קולקטיבית מונחה על ידי שיפוע ביוכימי. לכן, אנו משלבים את השבב המיקרופלואידי עם מיקרוסקופיה של המתיחה, ואז אנו משתמשים בשבב המיקרופלואידי כדי ליצור שיפוע ביוכימי, ואנחנו משתמשים במיקרוסקופיה של המתיחה כדי למדוד כוח תאי.

ד"ר הוונסוק ג'אנג, תואר שני במעבדה שלי, ידגים את ההליך. הכן את פתרון PDMS על ידי ערבוב אלסטומר הבסיס וריפוי סוכן ביחס של עשר לאחד. מניחים 15 מיליליטר של אלסטומר הבסיס בצינור חרוט 50 מיליליטר, ומוסיפים 1.5 מיליליטר של סוכן ריפוי.

הכינו שניים מהצינורות האלה. Vortex תערובת PDMS במשך חמש דקות לפני צנטריפוגה ב 196 זמן g במשך דקה אחת כדי להסיר בועות. כדי להמציא את סטנסיל PDMS, יוצקים כמיליליטר אחד של תערובת PDMS על הוופל תוך הימנעות מאזורים בדוגמת SU-8 כך שה- PDMS נוגע בצד עמודי SU-8 אך לא בחלק העליון של תבנית SU-8.

מניחים את הוופל על משטח שטוח במשך יותר מ -30 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לרפא את PDMS בתנור יבש ב 80 מעלות צלזיוס במשך יותר משעה. בזהירות לקלף את PDMS מעובש SU-8, לקצץ את קרום PDMS דק באמצעות אגרוף חלול 14 מילימטר. הסר את האבק על פני השטח של חתיכות PDMS באמצעות סרט דביק לפני autoclaving סטנסילים PDMS.

כדי להמציא מיקרו-ערוצים PDMS, יוצקים כ-30 מיליליטר של תערובת PDMS מעל תבנית SU-8. דגה במשך 30 דקות בתא ואקום, ולאחר מכן לרפא את PDMS בתנור יבש ב 80 מעלות צלזיוס במשך יותר משעה. בזהירות לקלף את PDMS מעובש SU-8, לחתוך את PDMS לגודל של 24 מילימטרים על ידי 24 מילימטרים.

בכל בלוק PDMS, ליצור שקע אחד ושלושה inlets באמצעות אגרוף ביופסיה מילימטר אחד. ייצור וסילוניזציה של שקופיות זכוכית כמתואר בפרוטוקול הטקסט. מכסים את המשטח הקצוות של הזכוכית התחתונה עם 100 מיקרוליטרים של תותר הסילאן.

לאחר השארת ה בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת, לשטוף את הזכוכית שלוש פעמים עם מים deionized. ואז לתת את הזכוכית להתייבש בטמפרטורת האוויר הסביבה או על ידי נושבת אוויר דחוס. הכן את פתרון ג'ל פוליאקרילמיד כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

לאחר מכן מעבירים ל-10 מיקרוליטרים של תווי ג'ל מעורבים אל המיקרווול המלבני וממקמים מעל תלוש כיסוי עגול. תקן את ההרכבה של זכוכית מותאמת אישית, פתרון ג'ל, ולהחליק כיסוי על העטיפה של צלחת שש באר עם סרט דביק ולהפוך אותו. ואז צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 96 פעמים g להביא חלקיקים פלואורסצנטיים לשכבה העליונה של ג'ל פוליאקרילמיד.

מוציאים את ההרכבה מהצנטריפוגה וממקמינים אותה על משטח שטוח עם החלקת הכיסוי הפונה כלפי מטה. לאחר 30 דקות, להפוך את ההרכבה ולמקום אותו בצלחת פטרי 35 מילימטר. ממלאים את המנה בשני מיליליטר של מים דה-מיוננים.

באמצעות מדפים, להסיר בעדינות את החלקת המכסה על ידי החלקת אותו לצד אחד. כדי לקודד קולגן על ג'ל פוליאקרילמיד, ממיסים מיליגרם אחד למיליליטר סולפו-SANPAH במאגר HEPES חם של 50 מילימולרים. זרוק 200 microliters של הפתרון על פני השטח ג'ל ולהפעיל על ידי אור UV במשך 10 דקות.

לאחר הפעלת UV, לשטוף את הג'ל פעמיים עם חיץ HEPES 0.1 טוחן, ולאחר מכן פעם אחת עם PBS. מקודדים את ג'ל הפוליאקרילמיד עם תותבוני קולגן בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, לשטוף את הג'ל שלוש פעמים עם PBS.

טבול את סטנסיל PDMS אוטומטית בפתרון F-127. שמור את זה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. לשטוף את סטנסיל PDMS עם PBS שלוש פעמים, ולהסיר נוזל הן סטנסיל PDMS וג'ל פוליאקרילמיד.

לאחר מכן מניחים את סטנסיל PDMS על ג'ל פוליאקרילמיד, ומוסיפים PBS לסטנסיל. הסר בועות בחורים של סטנסיל PDMS על ידי צינור בעדינות. לאחר הסרת בועות, נקה את ה- PBS מפני השטח של הסטנסיל PDMS.

עכשיו להוסיף 200 microliters של פתרון התא על סטנסיל PDMS ולמקם את הג'ל באינקובטור במשך שעה אחת, כך התאים לצרף ג'ל polyacrylamide. לאחר הדגירה, לשטוף בעדינות את פתרון התא עם מדיה תרבות התא ולהוסיף מדיה תרבות התא יותר. הסר את סטנסיל PDMS, לבדוק את היווצרות של איי תא תחת מיקרוסקופ.

לאחר מכן, לטפל על פני השטח של microchannel PDMS עם פלזמת חמצן במשך 30 שניות. לאחר הסרת כל נוזל על תחתונה מלאה בג'ל פוליאקרילמיד, מניחים את המיקרו-ערוצים PDMS על גבי הזכוכית התחתונה, ומניחים את ההרכבה על מחזיק הזכוכית המותאם אישית. מלא את המיקרו-ערוצים במדיום של תרבות התאים.

כדי להכין את צינורות המפרצון של המערכת המיקרופלואידית המשולבת, חבר מחט חתוכים וקו נפח מיני 30 ס"מ עם עצירה תלת-כיוון. הכינו שלושה מהסידורים האלה. עבור צינורות שקע, לחבר מחט קצוצה קו נפח מיני 75 ס"מ עם stopcock שלושה כיוון.

ממלאים את קווי הצינור במדיום שחומם מראש במשך שעה. הכינו מאגרים על ידי הסרת בוכנה ממזרקים וחיבור קווי צינורות הכניסה. חבר את מחברי המחט של כל קו צינורות לשלושת התוך ושקע אחד של המכשיר microfluidic.

ממלאים כל מאגר בשלושה מיליליטר של מדיום בינוני או ממוזג טרי. לבדיקת ההדרגתיות, מלאו את מאגר ההפניה השמאלי ב-20 ננוגרם לגורם גדילה של הפטוציט מיליליטר, או HGF, במדיום תרבות התאים. להדמיה של שיפוע הריכוז, הוסיפו 200 מיקרוגרם למיליליטר של צבע פלואורסצנטי למאגר ההתפלות השמאלי.

חבר את קו צינורות השקע למשאבת מזרק. מניחים את המערכת המיקרופלואידית המשולבת על הבמה של מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי קונבנציונלי. לצלם כל 10 דקות עד 24 שעות באמצעות מיקרוסקופ אוטומטי שוכנים באינקובטור.

בכל נקודת זמן, לקחת קבוצה של תמונות באמצעות עדשה אובייקטיבית 4X בשלושה ערוצים שונים, כולל תמונת שלב כדי לדמיין את נדידת התא, תמונה פלואורסצנטי ירוק לדמיין חרוזי פלואורסצנט מוטבע בג'ל, ותמונה פלואורסצנטי אדום כדי לדמיין את שיפוע הריכוז של כימיקל. לאחר צילום תמונות לשגות בזמן, להחדיר 0.25%פתרון טריפסין-EDTA לתוך microchannels לנתק תאים מג'ל פוליאקרילמיד. לאחר הסרת תאים לחלוטין מן הג'ל, לקחת תמונה פלואורסצנטי ירוק לשמש תמונת התייחסות עבור מיקרוסקופיה המתיחה.

המשך לניתוח נתונים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי למדוד כוח התכווצות ומתח בין תאי, מיקרוסקופיה המתיחה מיקרוסקופית מתח monolayer שולבו עם הערוץ microfluidic. המפות היו מותווים בתיאום רדיו עם מתיחה כלפי חוץ באמצעות צבע חם ומתיחה פנימה באמצעות צבע קר.

בזמן אפס, כל האיים הראו חלוקות אחיזה דומות עם מתיחה פנימית חזקה על הקצה ותנודות בתוך האי. לאחר 10 שעות של החלת שיפוע HGF, בעוד דרגת הרחבת האי הייתה שונה בכל עמודה, התפלגות המתיחה הייתה דומה במידה רבה לזמן אפס. המתיחה הממוצעת לא משתנה במשך 10 שעות.

עם זאת, בעת חישוב הלחץ המונולי, כל עמודה הראתה מגמות שונות. כאשר ריכוז HGF היה נמוך, המתח הממוצע בתוך האיים נשמר סביב 200 פסקלים לאורך תקופה של 10 שעות. כאשר ריכוז HGF היה גבוה, המתח הממוצע בתוך האיים ירד בהדרגה מ 230 פסקלים ל 100 פסקלים על פני 10 שעות, כפי שהוצג קודם לכן.

כאשר ריכוז HGF היה גבוה במחצית השמאלית ונמוך בחצי הימני של האי, המתח הממוצע נשמר סביב 150 פסקלים. מילוי התעלה המיקרופלואידית חייב להיות עדין. חשוב להסיר בועות לכודים בתעלה ובו זמנית לא לשבש איים תא אב מיקרו.

באמצעות מערכת משולבת זו, ניתן לחקור אותה כיצד קולקטיב התאים מגיב באופן מכני לשיפועים כימיים שונים, כגון משככים כימותרפיים או גורמי גדילה. פלטפורמה זו תעזור לנו לחקור עוד יותר את המכניקה של נדידת תאים קולקטיבית תחת שיפוע כימי, שהוא המפתח להבנת התחדשות, גרורות סרטן ופיתוח.