אופטימיזציה של תהליך הכנת הדגימה להעברת מיקרוסקופ אלקטרונים של צמתים עצביים-שריריים בזחלי דרוזופילה

הפיזור המפוזר והטווח החזותי המוגבל של ה- TEM מציבים אתגרים לניתוח התשתיות. פרוטוקול זה מציג שיטת הכנת דגימות חדשנית ויעילה העולה על הגישה הקונבנציונלית. שיטה מתקדמת זו של הכנת דגימות TEM יעילה יותר במניעת סלסול הדגימות בהשוואה לשיטה המסורתית בכך שהיא מאפשרת לדגימות להישאר שטוחות במהלך ההתייבשות שלאחר מכן.

הבחירה של ריאגנטים, והתאמת המינון חייב להיות נחוץ בהתאם לסוג המדגם. ישנם ריאגנטים כימיים רעילים רבים המשמשים בתהליך הכנת המדגם. מי שידגים את ההליך יהיה שנג צ'ינג-יואן, סטודנט מאסטר מהמעבדה של ד"ר גן גואנג-מינג.

כדי להתחיל, לנתח את זחלי הכוכב השלישי הנודד Drosophila בתמיסת ינואר, ולקבל את כל דופן הגוף על פי ההליכים הסטנדרטיים. מקבעים את דופן גוף הזחל עם הקיבוע בתא הדיסקציה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, מעבירים את דופן גוף הזחל מתא הדיסקציה לצינור צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר, ושוטפים אותו מספר פעמים עם חיץ נתרן קקודילט.

תקן את דופן גוף הזחל ב 1% osmium tetroxide במשך שעתיים. לאחר הקיבוע, לשטוף את הדגימות מספר פעמים עם מים מזוקקים. הוסף 2% תמיסת אצטט משתנה רווי לתוך הצינור כדי להכתים את צומת PHI neuromuscular.

ואחרי שעתיים, לשטוף את הדגימות עם מים deionized. הבא באמצעות מספריים, לחתוך שתי חתיכות עגולות של רשת מתכת בגודל נקבוביות 270 מיקרון. הניחו את רשת המתכת בבסיס בקבוק בעל תחתית שטוחה.

לאחר מכן מניחים את הזחלים הקבועים על הרשת, ולאחר מכן מניחים רשת נוספת. יש לייבש את הדגימות בריכוז אתנול עולה למשך 20 דקות כל אחת בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן שטפו את הדגימות פעמיים עם פרופילן אוקסיד בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות כל אחת.

לאחר מכן, הניחו את הדגימות בתמיסת פרופילן אוקסיד ושרף אפוקסי, ולאחר מכן שרף אפוקסי טהור למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. להטבעה, חותכים סרט פוליאתילן לריבוע גדול ותמיכה מלבנית קטנה וחלולה. הדביקו את הריבוע הקטן עם הריבוע הגדול.

מוסיפים מספיק שרף אפוקסי במרכז הריבוע הגדול. לאחר מכן הפעילו את הסטריאוסקופ, והניחו את הדגימות בשרף האפוקסי שהוצב מראש כשצד השריר פונה כלפי מעלה. מוסיפים כמה טיפות של שרף אפוקסי על הדגימות, ומכסים אותן בסרט פוליאתילן.

הניחו את הדגימות לפילמור בטמפרטורות עולות למשך 24 שעות כל אחת. לאחר פילמור, באמצעות להב חד, להסיר את החלקים העודפים של גוף הזחל תוך שמירה על טרפז, כולל קטע A2 ו A3. הסר את הטרפז מדופן גוף הזחל שנותר, וחבר אותו לקפסולה מלאת השרף עם דבק AB.

תחת מיקרוסקופ אור, לאשר את המיקום של השרירים השישי והשביעי של קטעי A2 ו A3, שמירה על המישור המשיק במקביל שריר שישי. לאחר מכן חתכו חמישית מהמדגם לאורך שני הצדדים של קטע A3. בעזרת מיקרוטום, הכינו חלק דק במיוחד של הדגימה החל מהשריר השישי.

לאחר החיתוך, חברו כמה שיותר פרוסות לכל רשת נחושת. השתמש במיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת כדי לצפות בדגימות. בקרב שרף Lowicryl K4M ושרף אפוקסי, שרף Lowicryl K4M סיפק תוצאות חדות וקלות יותר לצפייה של שרירי הגוף של דרוזופילה.

הדמיה קונפוקלית הדגימה הדמיה משופרת של הצומת העצבית-שרירית בין השרירים השישי והשביעי. מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת חשף צמתים עצביים-שריריים דמויי חרוזים, והציע מידע משופר על המבנה הסינפטי. הדגימות נותרו שטוחות לאורך כל תהליך ההתייבשות בשל הגבלת רשתות המתכת.

מלבד זאת, הדגימות עברו פולימריזציה בין מוצרי הפלסטיק, מה שמנע מהדגימות להתקפל. בעתיד, שיטת הכנת דגימת TEM יכולה להיות מיושמת על נוירופיל המוח וחוט העצב הגחוני, ובכך לשפר את הפוטנציאל של מחקר אולטרה-סטרוקטורלי.