הכנת הדוגמא ולמחקר במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים
July 27th, 2018
מכשיר ושיטות ההכנה של אמצעי אחסון מדגם בגודל nanoliter במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים מוצג. אין מדרגות נייר סופג נדרשים, וכך להימנע ההשלכות מזיקה שיכולה להיות חלבונים, הפחתת הדגימה אובדן ולאפשר הניתוח של תא בודד lysate עבור פרוטאומיקס חזותי באופן משמעותי.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה המבנית, כגון הכנת חלבונים רגישים, שבהם כמות מוגבלת של חלבון זמינה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שבהשוואה לשיטות הכנת דגימה סטנדרטיות, נדרשות רק כמויות זעירות של דגימה, וכי לא מעורב שלב ספיגת נייר קשה. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על ניתוח תא בודד על ידי פרוטאומיקה חזותית, או אבחון של מחלות הקשורות לחלבון.
הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כאשר הייתה לנו הטכנולוגיה הזמינה לפתרון מבנים ברזולוציה גבוהה עם כ-100,000 חלקיקים בודדים בלבד. כדי להתחיל, הכינו את המדגם כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. לאחר מכן, הרכיבו את האתאן, מחזיק קופסת הקריו והעכביש.
וממלאים את מיכל הקריוגן עד אפס מקום בחנקן נוזלי. לאחר מספר דקות, הכוס תהיה קרירה וללא חנקן נוזלי. לאחר מכן פתח את בקבוק הגז אתאן, ותן לאט לאט לגז לזרום לתוך האתאן.
תנו לכוס להתמלא באתאן נוזלי עד שהמפלס יהיה שניים עד שלושה מילימטרים מתחת לחלק העליון. זה ייקח כמה דקות ודורש כחמישה מיליליטר אתאן נוזלי. הסר את העכביש, הנח את מכסה הפוליסטירול מעל, והנח את מיכל הקריוגן על התושבת בכותב הקריוגן.
אחוז ברשת ה- EM המשוחררת הזוהר עם פינצטה של כותב הקריו, קשר את הפינצטה על האלקטרומגנט, והברג את המיקרומניפולטור כדי ליישר את הרשת שטוחה על הבמה, כשצד סרט הפחמן כלפי מעלה. בחזרה לתוכנה, לחץ פעמיים על grid_save. לאחר מכן כוונן את מיקום המיקרו-נימי, כך שהקצה יהיה בערך 10 מיקרומטר מעל פני הרשת.
ודא שהמיקרו-נימי יכול לנוע בחופשיות על פני הרשת, מבלי לגעת בו בשום מקום. ובמידת הצורך, משוך את המיקרו-נימי כמה מיקרומטרים. לאחר מכן החזירו אותו למקומו למרכז הרשת, ושמרו את המיקום החדש כרשת.
העבר את המיקרו-נימי בחזרה למצב הבית. לאחר מכן, שטפו את המיקרו-נימי עם כמה עשרות ננוליטרים של נוזל מערכת, והשתמשו ברקמה נטולת מוך כדי להסיר טיפות מהמיקרו-נימי. כשהכל מוכן כעת, התחל את סקריפט המאקרו.
המאקרו נע תחילה למקומו, ומוציא חמישה ננוליטרים של נוזל מערכת כדי להסיר בועות אוויר בקצה, ולאחר מכן עובר למיקום הדגימות. לאחר מכן, הוא שואב 65 ננוליטר של דגימה, ולאחר מכן מחדיר חמישה ננוליטרים בחזרה לתוך צינור הדגימה. זה מסביר את תגובת הנגד של המערכת, וזה מאפשר כתיבה מסונכרנת.
לאחר שהוא עובר למצב הרשת, הוא יוזם דפוס כתיבה, שיגרום למיקרו-נימי לנוע על פני הרשת ובו זמנית להוציא 45 ננוליטר של דגימה. לאחר מכן הוא מזיז את המיקרו-נימי בחזרה למרכז הרשת, מוריד אותו עוד 10 מיקרומטר ומושך עודפי נוזל דגימה. לבסוף, המאקרו מושך את המיקרו-נימי ומכבה את האלקטרומגנט, מה שמפעיל את מנגנון הקפאת הצלילה.
לאחר השחרור מהמגנט, שחרר בזהירות את המתאם המגנטי מהבוכנה והעביר במהירות את הרשת מכוס האתאן למיכל הקריוגן, המכיל את קופסת הקריו, והנח את הרשת לחריץ פנוי. כדי להתחיל, הכן תאים כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה, והרכיב את שקופית תחמוצת הבדיל של אינדיום על תוספת המיקרוסקופ. השתמש בשני ברגים כדי לקבע את המגלשה על תוספת האלומיניום, וכדי להבטיח מגע חשמלי בין ציפוי תחמוצת הפח של השקופית למסגרת האלומיניום המוארקת חשמלית.
לאחר מכן הסר את מדיום תרבית התאים מהבאר, ושטוף את התאים פעמיים עם 300 מיקרוליטר של מאגר אלקטרופורציה. לאחר הכביסה האחרונה, שמור את התאים במאגר האלקטרופורציה. לאחר מכן, הנח את תוספת האלומיניום המחזיקה את מגלשת תחמוצת הפח של האינדיום בשלב חממת התאים החיים, על ההגדרה.
בעזרת המיקרוסקופ אתר את תרבית התאים ובחר אזור ללא תאים. התקרב לקצה המיקרו-נימי על משטח ההחלקה וגע בו בעדינות. לאחר מכן משוך את הקצה ב -100 מיקרומטר ושמור את המיקום כתאים.
כעת עזבו במהירות את תרבית התא ושטפו את קצה המיקרו-נימי בכמה עשרות ננוליטרים של נוזל מערכת, ואז הכניסו אותו שוב לתרבית התא. הוצא כמה ננוליטרים במהלך הטבילה לבאר ה-PDMS כדי להבטיח שלא יילכדו בועות אוויר בקצה. לחץ פעמיים על מיקום התא והתקרב בעדינות לפני השטח של מגלשת תחמוצת הפח אינדיום ובמגע, משוך את הקצה 10 מיקרומטר.
בשלב זה, בחר תא סמוך לליזה. והנח את קצה המיקרו-נימי מעל התא הממוקד. לאחר מכן התחל את סקריפט המאקרו עבור ליזה של תא בודד.
לאחר שהתחיל, הסקריפט יבקש מיקום שאליו יש להעביר את המיקרו-נימי לאחר שהתא עבר ליזה מוצלחת. הזן את המיקום הרצוי, לדוגמה רשת, עבור רשת EM. לאחר מכן המאקרו ימשיך ללא התערבות המשתמש, ויתחיל בהזזת שלב המיקרוסקופ בתרבית התא 100 מיקרומטר שמאלה, שם הוא מצלם תמונה של התא הממוקד.
לאחר מכן 15 ננוליטר של מים מזוקקים כפולים יוצאים מהצינור המיקרו-נימי, עוקרים ומדללים את מאגר המלח הגבוה, ומפעילים לחץ אוסמוטי על התא. לאחר מכן, השלב חוזר כדי למקם שוב את הקצה מעל התא הממוקד. שם מופעל פרץ מתח מוגדר מראש, ולאחר 500 אלפיות השנייה, מערכת המשאבה מתחילה לשאוב שלושה ננוליטרים של דגימה בקצב זרימה של שני מיקרוליטר לדקה.
לבסוף, השלב זז שוב שמאלה, מה שמאפשר לבדוק את התא. מופיע חלון המבקש קלט מהמשתמש. אם התא הצליח, הזן כן כדי לצלם תמונה של התא המסומן.
לאחר מכן, המיקרו-נימי עוברים למיקום האנדו, שקועים בנוזל המאגר. השאירו את המיקרו-נימי שקוע במשך שמונה עד 12 דקות, תלוי בגיאומטריית הזרבובית. לאחר מכן, הוציא חמישה ננוליטרים של ליזאט התא המותנה על הרשת.
משוך את המיקרו-נימי ותן לדגימה המותנית להתייבש לאט על שלב נקודת הטל. לבסוף, הסר את הרשת מהבמה ואחסן אותה בטמפרטורת החדר בקופסת רשת. מוצגות כאן תמונות קריו טיפוסיות של דגימות קפואות באמצעות הגדרת CryoWriter המתוארת.
בסקירת הרשת, ניתן לראות בבירור את ההיקף של קרח הזגוגית. בבחינה מדוקדקת יותר של חריץ רשת עם סרט הפחמן החורי המכיל קרח זגוגית, ניתן למצוא חורים לבנים, מה שמצביע על כך שלא כל החורים היו מלאים במאגר דגימה. באחת הדגימות המכילות חורי פחמן, ניתן לראות בבירור את זנבו של בקטריופאג' בפירוט.
באמצעות ה-CryoWriter שהוגדר לביצוע פרוטאומיקה חזותית של תא בודד, ניתן לראות דברים כמו חלבונים בודדים, למשל אקטין חוטי וכתמי ממברנה עם חלבונים מחוברים. התמונה שאתה יכול לראות בלוח 6b מוכתמת לרעה בכתם שלילי של 2%, על בסיס תרכובת אורגנוטונגסטן. פאנל c מציג ליזאט חד-תאי שהוכן ל-cryo EM. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין רשתות EM של כתם שלילי או קריו, מנפח כולל של ננוליטר של דגימות חלבון או תמציות תא בודד.
אל תשכח שעבודה עם אתאן וחנקן נוזלי עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות, כגון הרכבת משקפי בטיחות וחלוק מעבדה, על ידי ביצוע הליך זה.
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה חדשה להכנת נפחי דגימה בגודל ננוליטר להדמיית מיקרוסקופ אלקטרונים ללא צורך בשלבי בליטת נייר. טכניקה זו מפחיתה משמעותית את אובדן הדגימה ומאפשרת ניתוח של ליזטים של תאים בודדים לפרוטאומיקה ויזואלית.
מרכיבי המחקר העיקריים
תחום המדע
- ביולוגיה מבנית
- פרוטאומיקה
- ניתוח תא יחיד
רקע
- שיטות הכנת דגימות מסורתיות לעיתים קרובות דורשות כמויות גדולות של דגימה.
- בליטת נייר עלולה להשפיע לרעה על חלבונים רגישים.
- שיטה זו מאפשרת ניתוח של כמויות חלבון מוגבלות.
- ניתן לפתור מבנים ברזולוציה גבוהה עם דגימה מינימלית.
מטרת המחקר
- לפתח טכניקה שממזערת אובדן דגימה במהלך ההכנה.
- להקל על ניתוח של ליזטים של תאים בודדים.
- לשפר את האבחון של מחלות הקשורות לחלבונים באמצעות פרוטאומיקה ויזואלית.
שיטות בשימוש
- הכנת דגימות במיכל קריוגני.
- שימוש במיקרו-קפילרה להתפלגות מדויקת של הדגימה.
- יישום של סקריפט מאקרו לטיפול אוטומטי בדגימות.
- יישום של לחץ אוסמוטי לליזה של תאים.
תוצאות עיקריות
- השיטה מכינה בהצלחה נפחי ננוליטר ללא אובדן דגימה.
- ניתן לנתח באופן יעיל ליזטים של תאים בודדים.
- ניתן להשיג הדמיה ברזולוציה גבוהה של חלבונים.
- הטכניקה מראה הבטחה לאבחון מחלות הקשורות לחלבונים.
מסקנות
- שיטה חדשנית זו משפרת את המחקר של חלבונים רגישים.
- היא פותחת דרכים חדשות לניתוח תאים בודדים בפרוטאומיקה.
- היעדר בליטת נייר משפר את שלמות הדגימה.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This method addresses a critical bottleneck in structural biology by enabling high-resolution protein analysis from nanoliter sample volumes, directly supporting target validation when protein availability is limited. By eliminating paper blotting and reducing sample loss, it enhances sample integrity and reproducibility—key factors for reliable assay development and mechanistic de-risking in early discovery. The capability to integrate with single-cell lysis opens pathways for visual proteomics, expanding the utility of cryo-EM in phenotypic screening and biomarker discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables structural characterization of low-abundance or sensitive protein targets that are difficult to isolate in sufficient quantities using conventional methods.
- Operational Value: Reduces sample consumption from microgram to nanogram scales, conserving precious material for downstream assays and minimizing waste in precious target validation campaigns.
- Predictive Value: Supports confident target de-risking by providing high-fidelity structural data from minimal input, improving go/no-go decisions in lead identification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces vitrified samples suitable for single-particle cryo-EM, enabling quantitative structural readouts that can inform binding affinity and conformational dynamics in assay development.
- Operational Value: Uses a dispensing system with sub-nanoliter precision, ensuring reproducible sample deposition across grids and supporting assay standardization.
- Scalability: The macro-driven automation allows consistent processing of multiple samples, facilitating medium-throughput screening campaigns when integrated with robotic sample handling.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Enables structural follow-up of biomarkers identified in phenotypic screens, linking target engagement to atomic-level mechanism.
- Mechanistic De-risking: Facilitates visualization of protein complexes, post-translational modifications, or mutation effects in disease-relevant systems without requiring large-scale protein production.
- Quantitative Readiness: The method’s ability to prepare “lossless” total sample supports accurate quantification of complex mixtures, aiding in biomarker validation and pharmacokinetic studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting target validation through structural insight and enabling progression to lead identification by reducing biological uncertainty in protein targets.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by providing high-resolution structural data on protein targets, clarifying binding sites and mechanistic function from limited samples.
- Screening: Delivers assay-ready grids with standardized sample thickness and ice quality, improving reliability in downstream screening and hit validation.
- Analytics: Generates quantitative structural outputs such as particle distribution, ice thickness, and molecular occupancy, enabling objective comparison across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by allowing structural analysis of disease variants or biomarker candidates derived from patient samples or single-cell lysates.
- Enterprise Reuse: The automated macro script and temperature-controlled platform create a reusable infrastructure for structural proteomics across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target structure and function, reducing ambiguity in mechanistic interpretation.
- Operational Value: Eliminates variability introduced by manual blotting, improving reproducibility and throughput in grid preparation.
- Strategic Value: Lowers the barrier to studying challenging targets, enabling broader exploration of the proteome and reducing reliance on overexpression systems.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing structural evidence early in the discovery pipeline, de-risking investment in high-value targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryo-EM sample preparation, microfluidic handling, and macro-based automation systems.
- Dependent on specialized instrumentation including a cryogen container, ethane plunge system, temperature-controlled stage, and precision microcapillary dispenser.
- Necessitates standardization of environmental controls (humidity, temperature) to ensure consistent sample vitrification across runs.
- Adaptation to different sample types (e.g., membrane proteins, complexes) may require optimization of buffer conditions and blotting alternatives.
- Practical limitations include the need for hazardous material handling (liquid ethane, nitrogen) and initial setup complexity, though operational simplicity improves post-training.
