גירוי רב-מודאלי אוטומטי והקלטה עצבית סימולטנית מאורגניזמים קטנים מרובים
March 3rd, 2023
אנו מציגים שיטה לגירוי כימי גמיש ורב-מודאלי ורישום של פעילות עצבית בו זמנית מתולעים רבות של Caenorhabditis elegans . שיטה זו משתמשת במיקרופלואידיקה, חומרה ותוכנה בקוד פתוח, וניתוח נתונים אוטומטי מפוקח כדי לאפשר מדידה של תופעות עצביות כגון הסתגלות, עיכוב זמני וגירוי crosstalk.
תגובות עצביות נותנות תובנה לפעילות המוח, אך יכולות להשתנות בין ניסויים ואנשים. פרוטוקול זה מסייע על ידי אוטומציה של רישום גירוי וניתוח, ופישוט התכנות של סוגים ודפוסים שונים של גירויים. הטכניקה האוטומטית מאפשרת הקלטות של מספר נוירונים ואורגניזמים באותה תבנית מיקרופלואידית במקביל.
זה משפר את החזרתיות של הקלטות ומאפשר לחקור את השונות העצבית בין אוכלוסיות. יש צורך בדפוסי גירוי שונים כדי לחשוף תופעות עצביות כמו הסתגלות ואינטגרציה חושית. שיטה זו ניתנת להכללה לאותות דינמיים אחרים מתאים ואורגנואידים לאורגניזמים ולצמחים.
כדי להתחיל, הפעל את המיקרוסקופ, מלא והסר את בועות האוויר מצינור המאגר באמצעות מזרק הפריימינג, ולאחר מכן מלא את צינורות הזרימה בחיץ. הסר את המכשיר microfluidic מן מייבש ואקום. הניחו את המכשיר על המיקרוסקופ והכניסו במהירות את צינור השקע.
לחץ בעדינות על מזרק השקע כדי להזריק נוזל לתוך המכשיר עד שטיפה יוצאת מתוך פתח. בכניסה זו של טיפה, השתמש בחיבור טיפה לטיפה כדי להכניס את צינור הכניסה הנוזלי המתאים, וודא שטיפות נוזל נמצאות הן על צינור הכניסה והן על אשנב המכשיר כדי למנוע החדרת בועה. חבר את צינור הכניסה הבא לטיפה הבאה.
יש להזריק עוד נוזל מהשקע במידת הצורך ולחזור על הפעולה עד שכל הפתחים מתמלאים. הכנס פין חסימה מוצק בכניסות שאינן בשימוש וביציאת טעינת התולעת. בדוק את הזרימה על המסך כדי לוודא שהזרימה הולכת בכיוון הרצוי.
הפוך שסתום אחד על בקר השסתום והתבונן בזרימת הגירוי הזורמת לזירה המיקרופלואידית. אם הזרימה אינה מאוזנת, התאימו את גובה המאגר. העבירו את החיות הבוגרות הצעירות למדיום גידול נמטודות ללא זרעים או לצלחת אגר NGM באמצעות פיק קצה חוט, ואז הציפו את הצלחת בכחמישה מיליליטר של חיץ בסיסי XS אחד כך שהחיות יוכלו לשחות.
משכו את התולעים לתוך מזרק טעינה של מיליליטר עד שלושה מיליליטר באמצעות הצינור המצורף שמולא מראש במאגר בסיסי XS אחד. באמצעות סטריאוסקופ, העבירו את הצינורית מתחת לפני השטח הנוזליים ביד אחת לכל חיה רצויה ומשכו אותה לתוך הצינור באמצעות המזרק המוחזק ביד השנייה. סגור את מתאר השקע, הסר את פין טעינת התולעת וחבר את מזרק טעינת התולעת למכשיר באמצעות חיבור טיפה לשחרור.
לאחר מכן הזרימו בעדינות את החיות לזירה. ליצור זרימת חיץ ולאפשר עד שעה עבור immobilization על ידי tetramisole. באמצעות עורך הטקסט, צור קובץ טקסט להגדרת גירוי בשם userdefinedacquisitionsettings.
TXT המכיל את הגדרות הגירוי עבור רכישת התמונה האוטומטית. קובץ זה מגדיר פרמטרים של רכישת מיקרוסקופ כגון תזמון חשיפה ועירור, משך ניסיון, מרווחי זמן וספריית שמירה. הוא גם מגדיר את סוג הניסוי ואת הגדרות תזמון הגירוי.
עבור ניסוי גירוי יחיד, השתמש בתבנית עם פקודת גירוי חוזרת אחת בלבד. לניסוי מרובה תבניות, השתמש בתבנית עם פקודות גירוי מרובות על-ידי הכללת רצף תבניות של ספרות המייצג את סדר תבניות הגירוי. לכל דוגמת מילוי, הזינו פקודת גירוי בשורה נפרדת.
לאחר מכן, הפעל את תוכנת בקרת המיקרוסקופ. ודא שכל פתחי הנוזלים פתוחים, שהזרימה רצויה בתוך הזירה, והנוירונים המעניינים נמצאים בפוקוס בתוך החלון החי. לאחר מכן סגור את החלון החי והפעל את הסקריפט multipatternrunscript.
BSH בתוך התוכנה. כדי לנתח את הנתונים, הפעל את NeuroTracker על ידי לחיצה ברצף על תוספים, לאחר מכן מעקב ולאחר מכן NeuroTracker. בחר את התיקייה המכילה את קובצי הווידאו tiff שברצונך לעקוב אחריהם ובחר את טווח הקבצים לעיבוד.
לאחר מכן, באמצעות התמונה ולהתאים תפריטים, לפתוח את ניגודיות בהירות ואת חלונות בקרת הסף. בדוק את הרקע הכהה ואל תאפס את הטווח בחלון הסף, תוך הגדרת שיטת הסף כברירת מחדל ואת הפריט החזותי לאדום. לאחר מכן לחץ על אוטומטי בחלון ניגודיות הבהירות עבור נראות תא העצב.
בחלון ניגודיות הבהירות, כוונן את המחוונים המינימליים והמרביים עד שניתן יהיה להבחין בבירור בין הנוירונים. לאחר מכן כוונן את רמת הסף עד שכל תאי העצב יופיעו ככתמים אדומים קטנים המופרדים מעצמים אחרים. התאם את מחוון המסגרת כדי לצפות בתנועת תא העצב ובשינויי העוצמה, וציין בעלי חיים שאין לכלול במעקב, כגון עקב חפיפה עם בעלי חיים אחרים.
לאחר זיהוי תאי העצב למעקב, התאימו את רמת הסף לכל חיה במידת הצורך, כך שאזור הסף האדום מעל תא העצב ייראה בכל פריים. לחץ על תא העצב כדי לרשום את מיקומו ואת רמת הסף שלו. כאשר כל תאי העצב נבחרים, הקש על מקש הרווח כדי להתחיל במעקב.
עקוב אחר תהליך המעקב אחר כל בעל חיים ובצע את כל התיקונים הדרושים. אם NeuroTracker משתהה, הוא מאבד את תא העצב. התאם את רמת הסף לפי הצורך ולחץ מחדש על תא העצב.
אם תיבת האינטגרציה קופצת לבעל חיים קרוב אחר או למבנה שאינו עצבי, הקש על מקש הרווח כדי להשהות. הזז את המחוון בחזרה למסגרת השגויה הראשונה ולחץ שוב על מיקום תא העצב הנכון. הפעל את neurotrackersummarypdf.
m קובץ ב- MATLAB ובחר את התיקיה המכילה את קבצי הטקסט של נתוני NeuroTracker. המתינו ליצירת מסמך PDF מסכם, המאפשר אימות של תהליך המעקב. ניתן לזהות את בעלי החיים על פי המספרים והתגובות העצביות מכל חיה וניסוי ולצפות בהם כדי להעריך את השונות באוכלוסייה.
השתמש בפונקציה databrowse. M כדי לחקור את הנתונים העצביים מקובצים לפי מספר ניסוי, מספר בעלי חיים, דפוס גירוי או לפי קטגוריה אחרת. תופעת עיכוב הזמן נבדקה בניסוי דופק זוגי שהפיק שמונה דפוסים המורכבים משני פולסי ריח של שנייה אחת המופרדים במרווח הנע בין אפס ל-20 שניות.
דופק הריח הראשון של שנייה אחת עורר עוצמת תגובה שווה בדיאצטיל המזהה נוירוני AWA והתגובות בפעימה השנייה השתנו עם מרווח הגירוי הבין-גירוי. דיסאינהיביציה הוערכה על ידי ניסוי המלכוד שבו נצפתה הסתגלות לגירוי הדיאצטיל, אך הצגת הגירוי החדש 2-methylpyrazine לא עוררה אפקט דיסאינהיביציה חזק. הגירוי הרב-מודאלי שנבדק גילה כי גירוי כימי לבדו גרם להסתגלות ואילו גירוי אופטי לבדו לא.
עם זאת, דפוס הגירוי הרב-מודאלי המשולב הראה כי תגובות אופטוגניות היו רגישות להסתגלות כימית. על ידי שינוי העיצוב המיקרופלואידי כך שיכלול שתי זירות, אנו יכולים להשוות הפרעות גנטיות או אחרות לצד התייחסות תואמת בו זמנית. לאחר ההגדרה, ניתן לשנות את המערכת בדרכים רבות.
לדוגמה, מדדנו באופן אוטומטי תגובות מינון כימיות ושינויים תלויי מצב בפעילות עצבית, כגון בין מצבי שינה וערות.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה לגירוי כימי ורב-ממדי והקלטה של פעילות עצבית ב-Caenorhabditis elegans באמצעות מיקרו-נוזלים וניתוח נתונים אוטומטי. הגישה מאפשרת בחינה של תופעות עצביות כמו הסתגלות ועיכוב זמני דרך מדידת תגובות אותות של מספר אורגניזמים בו זמנית.
מרכיבי המחקר העיקריים
תחום המדע
- נוירומדע
- מיקרו-נוזלים
- ניתוח התנהגותי
רקע
- תגובות עצביות מספקות תובנות לגבי פעילות המוח אך יכולות להשתנות בין אנשים וניסויים.
- קיים צורך בשיטות אוטומטיות שמשפרות את הניתנות לחזרה של הקלטות עצביות.
- עבודה זו מתמקדת בפשטת תכנות הגירויים וניתוח התגובות העצביות.
- השיטה שואפת לאפשר הקלטות רב-עצביות במסגרת מיקרו-נוזלית.
מטרת המחקר
- להפוך את הגירוי, ההקלטה והניתוח של הפעילות העצבית ב-C. elegans לאוטומטיים.
- לחקור את השונות העצבית בין אוכלוסיות ולשפר את חזרתיות הנתונים.
- לחשוף תופעות עצביות קריטיות דרך דפוסי גירוי שונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- המחקר משתמש בפלטפורמת מיקרו-נוזלים לגירוי והקלטה בו זמנית.
- הוא כולל שימוש ב-C. elegans כמודל ביולוגי לחקר מנגנונים עצביים.
- טכניקות אוטומטיות מייעלות את תהליך ניתוח הנתונים, ומשפרות את שלמות הנתונים.
- שלבים קריטיים כוללים הכנת המכשיר המיקרו-נוזלי והגדרת פרמטרים של גירוי.
- הניתוח מתבצע באמצעות תוכנה שנועדה למעקב ולסיכום הפעילות העצבית.
תוצאות עיקריות
- השיטה מספקת אמצעי אמין להערכת תגובות עצביות לדפוסי גירוי שונים.
- הממצאים הדגימו כיצד עיכוב זמני מתבטא בפעילות עצבית, ותומך בפונקציונליות שלו.
- ניתוח הנתונים מאפשר מעקב אחר נוירונים בודדים ותגובותיהם בין ניסויים.
- הגישה משפרת את ההבנה של אינטגרציה חושית והסתגלות ברמה העצבית.
מסקנות
- מחקר זה מבסס כלי רב-תכליתי לחקירת מנגנונים עצביים באורגניזמים פשוטים.
- השיטה האוטומטית מאפשרת ניתוח יעיל של דינמיקת אוכלוסייה ותגובות עצביות.
- יש לכך השלכות לקידום ההבנה שלנו על פלסטיות עצבית והתנהגות בתגובה לגירויים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Automated multimodal stimulation and parallel neuronal recording in small organisms addresses the challenge of biological variability and throughput in early discovery neuroscience. This platform enables high-content, quantitative assessment of neural function across populations, supporting predictive confidence and mechanistic de-risking at the target validation stage. Its scalability and flexibility position it as a reusable capability for portfolio-wide interrogation of neural dynamics and adaptation phenomena.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of neural adaptation, inhibition, and sensory integration across multiple individuals.
- Supports functional target validation by quantifying neural responses to diverse, programmable stimuli.
- Facilitates mechanistic de-risking by revealing population-level variability and state-dependent neural dynamics.
- Provides a platform for comparative studies of genetic or pharmacological perturbations in parallel arenas.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, repeatable stimulation protocols for robust assay development.
- Generates quantitative, population-wide neural activity readouts suitable for downstream screening workflows.
- Enables rapid evaluation of compound or genetic effects on neural excitability and adaptation.
- Supports scalable, automated data acquisition and analysis for high-throughput screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Allows exploration of state-dependent neural responses relevant to disease modeling and biomarker discovery.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling cross-condition and cross-genotype comparisons.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by quantifying functional neural endpoints in relevant biosystems.
Pipeline & Workflow Integration
This automated platform integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical model validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of neural circuits and adaptation mechanisms.
- Screening: Provides reproducible, quantitative neural activity assays for compound or genetic screening.
- Analytics: Delivers population-level and single-neuron quantitative outputs for robust statistical comparison.
- Translational Research: Enables alignment of neural response phenotypes with disease-relevant or state-dependent endpoints.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible, open-source platform adaptable to diverse small biosystems and experimental paradigms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neural target validation.
- Operational Value: Standardizes stimulation and recording workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust, parallelized data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neural targets and mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics, fluorescence imaging, and neural data analysis.
- Depends on instrumentation for automated microscopy and programmable stimulus delivery.
- Needs cross-team standardization of data acquisition and analysis protocols.
- Adaptable to various small organisms, cells, or organoids with appropriate genetic indicators.
- Manual oversight may be needed for data quality control and tracking adjustments.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:48
Microfluidic Device Preparation
2:04
Animal Loading
3:02
Automated Stimulation and Neuronal Recording
4:15
Data Analysis Using NeuroTracker
6:08
Data Exploration and Visualization
6:47
Results: Assessment of Temporal Inhibition, Disinhibition, and Multimodal Stimulation
7:51
Conclusion
