שיטת מיקרו-חרוזים מגנטיים מהירה לטיהור יעיל של נויטרופילים בצפיפות נמוכה

אנו חוקרים נויטרופילים בצפיפות נמוכה בתוך תאי הדם המונו-גרעיניים ההיקפיים כדי לאפיין את תפקידם ולהגדיר את תפקידם במחלות שונות. נויטרופילים בצפיפות נמוכה נדירים בדם בריא, אך הם עולים משמעותית במחלות כמו זאבת אריתמטית מערכתית וסרטן. כדי להתחיל, הוסיפו 10 יחידות לכל מיליליטר של הפארין כנוגד קרישה לצינור צנטריפוגה קוני בקוטר 15 מיליטר.

ואז הוסיפו שני מיליליטרים של T500 דקסטרן 6% ב-PBS. קבל 10 מיליליטר דם ממתנדב בוגר בריא באמצעות ורידים. בצינור צנטריפוגה חדש נוסף בנפח 15 מיליטר, הוסיפו חמישה מיליליטרים של מדיום גרדיאנט צפיפות.

הפיזמה בזהירות בלי לגעת באריתרוציטים ושכבת אותו מעל המדיום ליצירת שתי פאזות נפרדות. צנטריפוגה את הצינור ב-516 גרם למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. כדי לבודד PBMCs, יש לשאוב ולהשליך את הפלזמה מעל רצועת ה-PBMC מבלי להפריע לתאים.

אסוף את רצועת התא המונוגרעינית בין הפלזמה לתווך, ומזער את איסוף המדיום. הוסף 20 מיליליטר PBS לצינור המכיל PBMCs, ואז צנטריפוגה ב-400 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. שואף בזהירות את הסופרנטנט וגרד את הצינור כדי להפריד את הכדור.

הוסיפו 10 מיליליטר של PBS קר כדי להחזיר את התאים. כדי לבודד נויטרופילים, גרדו את הצינור כדי להפריד את התאים לאחר שהוצאו את המדיום. ואז מוסיפים 10 מיליליטר של PBS קר.

עכשיו העבר את התאים לצינור צנטריפוגה חרוטי חדש בנפח 50 מיליליטר וצנטריפוגה. שאפו את הסופרנטנט וגרדו שוב את הצינור. עכשיו מפעילים פיפטה של 10 מיליליטר של תמיסה היפוטונית קרה לצינור ומערבבים בעדינות.

ערבבו בעדינות בדיוק דקה אחת. הוסף במהירות 10 מיליליטר של תמיסה היפרטונית קרה כדי להפוך את התמיסה לאיזוטונית. לאחר מכן סופרים את הנויטרופילים באמצעות תא נויבאואר ווודאו שהטוהר גבוה מ-95%. צנטריפוגה את המתלה כדי לקבל כדור תא.

אחר כך תלה מחדש את הכדור ב-PBS קר. צנטריפוגה את תאי הדם המונוגרעיניים ההיקפיים ב-400 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסרת הסופרנאנט, החזירו את התאים ל-120 מיקרוליטר של בופר קר.

לאחר מכן פיפט 35 מיקרוליטר של מיקרו-חרוזי CD66b מגנטיים אל מתלה התא. דגרו את התערובת בחושך בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. עכשיו תזרקו פיפטה של מיליליטר אחד של בופר שטיפה קרה לצינור.

צנטריפוגה את הצינור ב-400 גרם למשך שלוש דקות. גרד את הצינור כדי להפריד את כדור התא לאחר הסרת הסופרנטנט. והחזרת התאים למיליליטר אחד של בופר שטיפה.

הנח עמוד הפרדה מגנטי על מגנט. הוסיפו 0.5 מיליליטר של בופר שטיפה לעמודה, כדי לאפשר לו לעבור דרכו לחלוטין. העבר מיליליטר אחד מהתאים המוחזרים אל העמודה ותן לבופר לעבור דרכו טיפה אחר טיפה.

לאחר השטיפה, העבר את העמודה לצינור מיקרוצנטריפוגה. אחר כך פיפט מיליליטר אחד של בופר שטיפה לעמודה. עכשיו הכניס את הבוכנה מעל העמוד.

הפעילו לחץ עדין כדי להוציא את התאים. לאחר מכן הסר את הבוכנה ומניח את העמוד על צינור מיקרוצנטריפוגה חדש. הוסף עוד מיליליטר של בופר שטיפה לעמודה.

לאחר מכן הכנס שוב את הבוכנה ולחץ בעדינות כדי להוציא את התאים שנותרו. צנטריפוגה את שני צינורות המיקרוצנטריפוגה ב-800 גרם למשך שלוש דקות. החזירו את כדורי התאים משני הצינורות למיליליטר אחד של PBS קר.

תשאיר את המתלה של התא על קרח. החזירו את התאים המטוהרים לבופר תיוג המורכב מסרום בקר עוברי 1% ב-PBS. העבר 250 מיקרוליטר מהמתלה לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר.

הוסיפו את הנוגדנים המתאימים נגד מולקולות ממברנת הנויטרופילים לצינור. לאחר מכן דגרו את התאים למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס, מוגנים מאור. עכשיו הפיפטה של מיליליטר אחד של PBS לצינור.

סובב את הצינור במיקרוצנטריפוגה ב-800 גרם למשך שלוש דקות. לשאוב את הסופרנטנט. הקיש על הצינור כדי לשבור את הכדור.

ותחזיר את התאים ל-0.5 מיליליטר של 1% פאראפורמלדהיד. לאחר מכן שמרו על התאים בארבע מעלות צלזיוס, מוגנים מאור עד לניתוח באמצעות ציטומטריית זרימה. נתח את הדגימות באמצעות ציטומטריית זרימה, תוך לכידת 10,000 אירועים לכל דגימה.

נויטרופילים בצפיפות נמוכה באנשים בריאים ייצגו כ-5% מהתאים המונוגרעיניים ההיקפיים בדם ההיקפיים, בעוד שפרוטוקול הבידוד המגנטי המתואר הניב נויטרופילים בצפיפות נמוכה בהתאוששות של כ-98%. נויטרופילים מבטאים את סמני הממברנה CD10, CD11b, CD15, CD62L ו-CD66b. נויטרופילים בצפיפות נמוכה מטוהרים מגנטית ביטאו את אותם סמנים כמו נויטרופילים.

נויטרופילים מטוהרים בצפיפות נמוכה הציגו גרעין רב-אוני והיו דומים בגודלם לנויטרופילים. גם נויטרופילים וגם נויטרופילים בצפיפות נמוכה יצרו מיני חמצן תגובתיים בתגובה לגירוי PMA, כאשר נויטרופילים בצפיפות נמוכה מייצרים רמות גבוהות יותר מאלו של נויטרופילים. נויטרופילים בצפיפות נמוכה שחררו מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים בתגובה לגירוי PMA, כפי שניתן לראות בקולוקליזציה של DNA עם אלסטאז וציטרולין.

גם נויטרופילים מטוהרים וגם נויטרופילים בצפיפות נמוכה שחררו NETs עם קינטיקה וכמויות דומות לאחר טיפול ב-PMA. הפרוטוקול שלנו מספק דרך מהירה וניתנת לשחזור לקבלת נויטרופילים טהורים ופונקציונליים בצפיפות נמוכה. אנו מתמודדים עם היעדר פרוטוקול סטנדרטי ויעיל בזמן לבידוד נויטרופילים בצפיפות נמוכה מדם אדם.

פרוטוקול זה אינו דורש הכשרה מיוחדת למכשירים מורכבים, והוא גם חסכוני ומהיר יותר מ-FACS.