שיטת מיקרו-חרוזים מגנטיים מהירה לטיהור יעיל של נויטרופילים בצפיפות נמוכה
11 בנובמבר 2025
נויטרופילים בצפיפות נמוכה (LDN) גדלים באופן משמעותי במספר מחלות. LDN מבודדים בדרך כלל באמצעות מיון תאים. אנו מציגים שיטה מעשית להשגת LDN טהור ובר קיימא. לאחר צנטריפוגה של שיפוע צפיפות של דם היקפי, התאים מודגרים עם מיקרו-חרוזים מגנטיים, ולאחר מכן LDN מופרדים באמצעות עמודות מגנטיות.
אנו חוקרים נויטרופילים בצפיפות נמוכה בתוך תאי הדם המונו-גרעיניים ההיקפיים כדי לאפיין את תפקידם ולהגדיר את תפקידם במחלות שונות. נויטרופילים בצפיפות נמוכה נדירים בדם בריא, אך הם עולים משמעותית במחלות כמו זאבת אריתמטית מערכתית וסרטן. כדי להתחיל, הוסיפו 10 יחידות לכל מיליליטר של הפארין כנוגד קרישה לצינור צנטריפוגה קוני בקוטר 15 מיליטר.
ואז הוסיפו שני מיליליטרים של T500 דקסטרן 6% ב-PBS. קבל 10 מיליליטר דם ממתנדב בוגר בריא באמצעות ורידים. בצינור צנטריפוגה חדש נוסף בנפח 15 מיליטר, הוסיפו חמישה מיליליטרים של מדיום גרדיאנט צפיפות.
הפיזמה בזהירות בלי לגעת באריתרוציטים ושכבת אותו מעל המדיום ליצירת שתי פאזות נפרדות. צנטריפוגה את הצינור ב-516 גרם למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. כדי לבודד PBMCs, יש לשאוב ולהשליך את הפלזמה מעל רצועת ה-PBMC מבלי להפריע לתאים.
אסוף את רצועת התא המונוגרעינית בין הפלזמה לתווך, ומזער את איסוף המדיום. הוסף 20 מיליליטר PBS לצינור המכיל PBMCs, ואז צנטריפוגה ב-400 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. שואף בזהירות את הסופרנטנט וגרד את הצינור כדי להפריד את הכדור.
הוסיפו 10 מיליליטר של PBS קר כדי להחזיר את התאים. כדי לבודד נויטרופילים, גרדו את הצינור כדי להפריד את התאים לאחר שהוצאו את המדיום. ואז מוסיפים 10 מיליליטר של PBS קר.
עכשיו העבר את התאים לצינור צנטריפוגה חרוטי חדש בנפח 50 מיליליטר וצנטריפוגה. שאפו את הסופרנטנט וגרדו שוב את הצינור. עכשיו מפעילים פיפטה של 10 מיליליטר של תמיסה היפוטונית קרה לצינור ומערבבים בעדינות.
ערבבו בעדינות בדיוק דקה אחת. הוסף במהירות 10 מיליליטר של תמיסה היפרטונית קרה כדי להפוך את התמיסה לאיזוטונית. לאחר מכן סופרים את הנויטרופילים באמצעות תא נויבאואר ווודאו שהטוהר גבוה מ-95%. צנטריפוגה את המתלה כדי לקבל כדור תא.
אחר כך תלה מחדש את הכדור ב-PBS קר. צנטריפוגה את תאי הדם המונוגרעיניים ההיקפיים ב-400 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסרת הסופרנאנט, החזירו את התאים ל-120 מיקרוליטר של בופר קר.
לאחר מכן פיפט 35 מיקרוליטר של מיקרו-חרוזי CD66b מגנטיים אל מתלה התא. דגרו את התערובת בחושך בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. עכשיו תזרקו פיפטה של מיליליטר אחד של בופר שטיפה קרה לצינור.
צנטריפוגה את הצינור ב-400 גרם למשך שלוש דקות. גרד את הצינור כדי להפריד את כדור התא לאחר הסרת הסופרנטנט. והחזרת התאים למיליליטר אחד של בופר שטיפה.
הנח עמוד הפרדה מגנטי על מגנט. הוסיפו 0.5 מיליליטר של בופר שטיפה לעמודה, כדי לאפשר לו לעבור דרכו לחלוטין. העבר מיליליטר אחד מהתאים המוחזרים אל העמודה ותן לבופר לעבור דרכו טיפה אחר טיפה.
לאחר השטיפה, העבר את העמודה לצינור מיקרוצנטריפוגה. אחר כך פיפט מיליליטר אחד של בופר שטיפה לעמודה. עכשיו הכניס את הבוכנה מעל העמוד.
הפעילו לחץ עדין כדי להוציא את התאים. לאחר מכן הסר את הבוכנה ומניח את העמוד על צינור מיקרוצנטריפוגה חדש. הוסף עוד מיליליטר של בופר שטיפה לעמודה.
לאחר מכן הכנס שוב את הבוכנה ולחץ בעדינות כדי להוציא את התאים שנותרו. צנטריפוגה את שני צינורות המיקרוצנטריפוגה ב-800 גרם למשך שלוש דקות. החזירו את כדורי התאים משני הצינורות למיליליטר אחד של PBS קר.
תשאיר את המתלה של התא על קרח. החזירו את התאים המטוהרים לבופר תיוג המורכב מסרום בקר עוברי 1% ב-PBS. העבר 250 מיקרוליטר מהמתלה לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר.
הוסיפו את הנוגדנים המתאימים נגד מולקולות ממברנת הנויטרופילים לצינור. לאחר מכן דגרו את התאים למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס, מוגנים מאור. עכשיו הפיפטה של מיליליטר אחד של PBS לצינור.
סובב את הצינור במיקרוצנטריפוגה ב-800 גרם למשך שלוש דקות. לשאוב את הסופרנטנט. הקיש על הצינור כדי לשבור את הכדור.
ותחזיר את התאים ל-0.5 מיליליטר של 1% פאראפורמלדהיד. לאחר מכן שמרו על התאים בארבע מעלות צלזיוס, מוגנים מאור עד לניתוח באמצעות ציטומטריית זרימה. נתח את הדגימות באמצעות ציטומטריית זרימה, תוך לכידת 10,000 אירועים לכל דגימה.
נויטרופילים בצפיפות נמוכה באנשים בריאים ייצגו כ-5% מהתאים המונוגרעיניים ההיקפיים בדם ההיקפיים, בעוד שפרוטוקול הבידוד המגנטי המתואר הניב נויטרופילים בצפיפות נמוכה בהתאוששות של כ-98%. נויטרופילים מבטאים את סמני הממברנה CD10, CD11b, CD15, CD62L ו-CD66b. נויטרופילים בצפיפות נמוכה מטוהרים מגנטית ביטאו את אותם סמנים כמו נויטרופילים.
נויטרופילים מטוהרים בצפיפות נמוכה הציגו גרעין רב-אוני והיו דומים בגודלם לנויטרופילים. גם נויטרופילים וגם נויטרופילים בצפיפות נמוכה יצרו מיני חמצן תגובתיים בתגובה לגירוי PMA, כאשר נויטרופילים בצפיפות נמוכה מייצרים רמות גבוהות יותר מאלו של נויטרופילים. נויטרופילים בצפיפות נמוכה שחררו מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים בתגובה לגירוי PMA, כפי שניתן לראות בקולוקליזציה של DNA עם אלסטאז וציטרולין.
גם נויטרופילים מטוהרים וגם נויטרופילים בצפיפות נמוכה שחררו NETs עם קינטיקה וכמויות דומות לאחר טיפול ב-PMA. הפרוטוקול שלנו מספק דרך מהירה וניתנת לשחזור לקבלת נויטרופילים טהורים ופונקציונליים בצפיפות נמוכה. אנו מתמודדים עם היעדר פרוטוקול סטנדרטי ויעיל בזמן לבידוד נויטרופילים בצפיפות נמוכה מדם אדם.
פרוטוקול זה אינו דורש הכשרה מיוחדת למכשירים מורכבים, והוא גם חסכוני ומהיר יותר מ-FACS.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
מחקר זה מתמקד בנויטרופילים בצפיפות נמוכה (LDN) שנמצאים בתאי דם חד-גרעיניים היקפיים, שהם נדירים אצל אנשים בריאים אך גדלים משמעותית במחלות שונות. המאמר מציג שיטה מעשית לבידוד נויטרופילים נקיים ובמצב תקין דרך צנטריפוגה של שיפוע צפיפות וטכניקות הפרדה מגנטיות.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה תאית
- אימונולוגיה
רקע
- נויטרופילים בצפיפות נמוכה קשורים למחלות כמו זאבת מערכתית ושחפת.
- הבנת LDN יכולה לספק תובנות לגבי תפקידיהם במנגנוני המחלה.
- בידוד של LDN חיוני לחקר תפקודיהם ופוטנציאל טיפולי.
- שיטות עכשוויות לבידוד LDN עשויות שלא להניב תאים טהורים ובמצב תקין.
מטרת המחקר
- לאפיין את התפקודים של נויטרופילים בצפיפות נמוכה.
- להגדיר את תפקיד ה-LDN במחלות שונות.
- להציג שיטה יעילה לבידוד LDN מדם היקפי.
שיטות ששימשו
- שימוש בהפרין כנוגד קרישה באיסוף דם.
- יישום של דקסטרן T500 להפרדה בשיפוע צפיפות.
- דגירה במיקרו-חרוזים מגנטיים למיון תאים.
- הפרדת LDN באמצעות עמודים מגנטיים.
תוצאות עיקריות
- השיטה מבודדת בהצלחה נויטרופילים טהורים ובמצב תקין בצפיפות נמוכה.
- ניתן לאפיין את LDN לגבי תפקידיהם הפונקציונליים במחלה.
- הבנה מוגברת של LDN עשויה להוביל לאסטרטגיות טיפוליות טובות יותר.
- ניתן ליישם את טכניקת הבידוד במגוון הגדרות מחקר.
מסקנות
- בידוד LDN חיוני לחקר השפעתם על בריאות ומחלות.
- השיטה המוצגת משפרת את טוהר ואת מצב התקינות של התאים המבודדים.
- מחקר נוסף על LDN יכול לתרום להתקדמות באימונולוגיה ובגישות טיפוליות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Efficient isolation of low-density neutrophils (LDN) addresses a critical bottleneck in immunology-focused drug discovery, enabling robust functional studies of disease-associated neutrophil subpopulations. This rapid magnetic-microbead method delivers high-purity, viable LDN, supporting mechanistic de-risking and target validation in autoimmune, oncology, and infectious disease pipelines. Scalable, reproducible LDN purification enhances predictive confidence for translational biomarker and preclinical model development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of LDN-mediated disease mechanisms and immune pathway clarification.
- Supports biological de-risking by isolating functionally intact LDN for hypothesis testing.
- Facilitates target validation by providing pure cell populations for downstream assays.
Screening & Assay Development
- Prepares validated LDN samples for quantitative flow cytometry and functional assays.
- Improves assay reproducibility and standardization through high-purity cell isolation.
- Accelerates screening readiness by reducing isolation time and preserving cell viability.
Translational & Preclinical Research
- Enables disease-relevant functional studies of LDN in autoimmune, cancer, and infection models.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by providing scalable LDN yields.
- Facilitates omics and biomarker analyses aligned with translational research objectives.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling rapid, reproducible LDN isolation for mechanistic studies, assay development, and translational research.
- Discovery Biology: Provides a platform for hypothesis testing and immune pathway analysis using purified LDN.
- Screening: Delivers standardized, viable LDN for quantitative flow cytometry and functional readouts.
- Analytics: Supports robust measurement of LDN marker expression and functional outputs such as ROS and NET formation.
- Translational Research: Aligns with biomarker and disease model development by enabling scalable LDN purification.
- Enterprise Reuse: Offers a reproducible, time-efficient protocol adaptable across disease areas and research teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune cell studies.
- Operational Value: Standardizes LDN isolation, improving reproducibility and scalability for high-throughput workflows.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in immunology portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of immune targets and translational biomarker programs.
Implementation Considerations
- Requires basic cell biology expertise and standard laboratory instrumentation.
- Utilizes magnetic separation columns and flow cytometry for validation.
- Enables cross-team standardization due to protocol simplicity and reproducibility.
- Adaptable to various disease models and sample volumes for scalable studies.
- Limited by the need for specific antibodies and magnetic bead reagents.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:26
Isolation of Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) and Neutrophils from Human Blood
2:55
Purification of Low-Density Neutrophils (LDNs) Using Magnetic Microbeads
4:59
Multicolor Flow Cytometry Staining and Analysis of Purified Neutrophils
6:13
Results
7:43
Conclusion
