Name: נויטרופילים בידוד פרוטוקול (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-23T22:05:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: למד שיטה לאיסולציה של נויטרופילים מדם אנושי באמצעות הפרדת צפיפות. פרוטוקול זה מאפשר חקר תפקודי תאי דם לבנים בתגובות דלקתיות ומחקרים אימונולוגיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

מימון NIH R01 HL56621.

נויטרופילים בידוד פרוטוקול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביאו את כל ריאגנטים לטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף 5.0 מ&quot;ל של התקשורת נויטרופילים בידוד צינור צנטריפוגות. בזהירות שכבה 5.0 מ&quot;ל של דם על התקשורת ההפרדה. בצע שלב זה לאט ובזהירות, ועם קצה פיפטה קרוב לפני השטח של התקשורת, כדי למנוע ערבוב הדם בכלי התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב RCF 500 דקות 35 ב 20-25 ° C. הדם צריך להפריד החוצה 6 להקות שונות: פלזמה, מונוציטים, מדיה בידוד, נויטרופילים, מדיה בידוד יותר, תא דם אדום גלולה (איור 1). אם להקות אלה אינם ברורים, את תהליך ההפרדה לא היה נקי יהיה צורך לחזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות את החלק העליון שלוש שכבות (פלסמה, מונוציטים, התקשורת בידוד) באמצעות פיפטה. השלך את השכבות הללו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה בזהירות את השכבה של נויטרופילים וכל מדיה הבידוד מתחת נויטרופילים. מניחים את הפתרון לתוך צינור צנטריפוגות נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הפתרון נויטרופילים עד 10 מ&quot;ל עם HBSS ללא Ca 2 + / Mg 2 +. הפוך את הצינור כמה פעמים להשעות את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הפתרון נויטרופילים ב RCF 350 במשך 10 דקות. גלולה אדומה צריכים להיות נוכחים בחלק התחתון של הצינור, המכילה נויטרופילים שיורית בתאי הדם האדומים (RBCs). הסר את supernatant עם טפטפת בקפידה כך גלולה אינה מופרעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי lyse RBCs שיורית, להוסיף 2 מ&quot;ל הצפת האדום תמוגה תא אל הצינור. כדי resuspend, גלולה מערבולת את הבקבוקון על ההגדרה של 3-4. הימנע להגדיל את ההגדרה מערבולת מעל 4, שכן זה עלול לגרום נויטרופילים כדי להפעיל. זה עשוי להיות נחוץ כדי מערבולת למשך מספר שניות, או &quot;דופק&quot; מערבולת לפזר את גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התחתית RCF 250 דקות 5. הסר את supernatant עם פיפטה. חזור על התהליך lysing אם נדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl HBSS ללא Ca 2 + / 2 + Mg כדי צינור אחד. שוב, אל מערבולת resuspend גלולה בהגדרה של 3-4. מדולל ל 10 מ&quot;ל עם HBSS ללא Ca 2 + / Mg 2 +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצינורות בבית RCF 250 דקות 5. לשאוב supernatant וזורקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב 250 HBSS μl / פתרון HSA (2% HSA). תאים עשויים אז ייספרו והותאמו הריכוז הרצוי. </li></ol>

<ol><li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+leucocytes+from+blood+and+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Scand.+J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Separation of leucocytes from blood and bone marrow.</a> Scand. J. Clin. Invest. 21, Suppl 97. 77-83 (1968).</li>
<li>England, J. M., Rowan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assignment+of+values+to+fresh+blood+used+for+calibrating+automated+blood+cell+counters%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Lab.+Haemat%22%5BJournal%5D)">The assignment of values to fresh blood used for calibrating automated blood cell counters.</a> Clin. Lab. Haemat. 10, 203-212 (1988).</li>
<li>Garcia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+leukocyte+extraction+methods+for+cytomegalovirus+antigenemia+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of two leukocyte extraction methods for cytomegalovirus antigenemia assay.</a> J. Clin. Microbiol. 34, 182-184 (1996).</li>
<li>Ferrante, A., Thong, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+conditions+for+simultaneous+purification+of+mononuclear+and+polymorphonuclear+leucocytes+from+human+peripheral+blood+by+the+Ficoll-Hypaque+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimal conditions for simultaneous purification of mononuclear and polymorphonuclear leucocytes from human peripheral blood by the Ficoll-Hypaque method.</a> J. Immunol. Methods. 36, 109-109 (1980).</li>
</ol>

שיפוע צפיפות שיטת ההפרדה משמש כדי לבודד נויטרופילים האדם מן הדם כולו באמצעות תערובת של נתרן metrizoate ו dextran 500. שיטה זו מבוססת על שיטת ההפרדה mononuclear ליקוציט ידי Boyum (1968) אשר שונה להפרדה נויטרופילים ידי פראנטה Thong (1980). לאחר איסוף מתורם דם, כולו עשוי להיות anticoagulated עם EDTA, ציטרט או הפרין. מאז הם קצרי חיים, נויטרופילים יש להשתמש תוך 2-4 שעות של האוסף. ההליך מורכב דם על כל שכבות המדיום צפיפות שיפוע, צנטריפוגה, הפרדה של שכבת נויטרופ...

<table><tbody><tr><td>Lymphocyte Poly(R)</td><td>ריאגנט</td><td>Cedarlane Labs</td><td></td><td>ניתן להשתמש ב-PolymorphprepTM כחלופה</td></tr><tr><td>הנק&amp;rsquo;תמיסת מלחים מאוזנת ללא סידן כלורי</td><td>ריאגנט</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אלבומין מסרום אנושי</td><td>ריאגנט</td><td>ZLB Bioplasma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>בופר לליזיס של תאי דם אדומים</td><td>ריאגנט</td><td>קבוצת Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>כלי</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מערבל וורטקס (Vortexer)</td><td>כלי</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פיפטות פסטור ונבובית שאיבה</td><td>כלי</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PolymorphprepTM</td><td>ריאגנט</td><td>Axis-Shield</td><td></td><td>ריאגנט חלופי ל-Lymphocyte-Poly (R)</td></tr><tr><td>מסנן מזרק</td><td>אחר</td><td>EMD Millipore</td><td>SLGV033RS</td><td>Millex-GV, 0.22 &amp;#x03BC;מ', PVDF, 33 מ"מ, ניתן לסטריליזציה בקרני גמא</td></tr><tr><td>הנק (Hank)&amp;rsquo;תמיסת מלחים מאזנת עם סידן כלוריד</td><td>ריאגנט</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

נויטרופילים בידוד פרוטוקול

Neutrophil Isolation Protocol

גרנולוציטים polymorphonuclear נויטרופילים (PMN) הם leukocytes הנפוץ ביותר בבני אדם בין התאים הראשונים להגיע באתר של תגובה חיסונית דלקתית. בשל תפקיד המפתח שלהם דלקת, נויטרופילים פונקציות כגון תנועה, ייצור ציטוקינים, phagocytosis, ולחימה תאים סרטניים נלמדים בהרחבה. כדי לאפיין את פונקציות ספציפיות של נויטרופילים, שיטה נקי, מהיר, אמין הפרדתם כדוריות דם אחרים רצוי במבחנה, במיוחד מאז נויטרופילים הם קצרי חיים ויש להשתמש בהם תוך 2-4 שעות של האוסף. כאן, אנו מדגימים צפיפות תקן שיפוע ההפרדה שיטה לבודד נויטרופילים האדם מן הדם כולו באמצעות כלי התקשורת ההפרדה זמינים מסחרית כי הוא תערובת של נתרן metrizoate ו dextran 500. ההליך מורכב דם על כל שכבות המדיום צפיפות שיפוע, צנטריפוגה, הפרדה של שכבת נויטרופילים, ו תמוגה של אריתרוציטים שיורית. תאים נשטפים אז, נספר, ועל resuspended במאגר לריכוז הרצוי. כאשר מבוצע כהלכה, שיטה זו הוכח תשואה דגימות של&gt; 95% נויטרופילים עם הכדאיות&gt; 95%.

נויטרופילים הם בין התאים הראשונים להגיע באתר של התגובה החיסונית דלקתיות, ואת תפקידיהם מנגנוני נחקרו רבות במבחנה. אנו מדגימים תקן צפיפות שיפוע ההפרדה שיטה לבודד נויטרופילים האדם מן הדם כולו באמצעות כלי התקשורת ההפרדה זמינים מסחרית.

גרנולוציטים פולימורפנוקלאריים נויטרופיליים (PMN) הם הלויקוציטים השכיחים ביותר בבני אדם ואחדים התאים הראשונים המגיעים לאתר דלקתי...

פרוטוקול לבידוד נויטרופילים. הליך זה ישמש להוצאת תאי דם לבנים מדגימת דם מלאה באמצעות צנטריפוגה ומבחנות. וורטקס, מחט ומזרק, מסנן מזרק.חומרים מסוג Millipore ממותג MX gv 0.22 Micrometer. הפרדת נויטרופילים בתמיסת Hank's balanced salt solution דורשת שני סוגים של תמיסות HBSS. תמיסת HBSS עם calcium chloride תשמש להכנת תמיסה עם human serum albumin.HBSS ללא סידום כלורי ישמש להשעיה ושטיפה של הנויטרופילים. אנא הקפידו להשתמש בתמיסת ה-HBSS המתאימה בהליך זה. אלבומין מנתח אנושי או HSA הוא חלבון בפלזמה של הדם השומר על ה-pH ועל הלחץ האסמוטי.אין להשתמש בבופר לליזיס של תאי דם אדומים מסוג bovine serum amalgamate. מוצר זה מיוצר על ידי Roche Diagnostics, neutrophil Isolation Media NIM Cedar Line Labs Lymph light Poly separation media. יש להגן על המדיה מהאור ולשמור אותה במקרר לקבלת התוצאות הטובות ביותר. יש להביא את כל הריאגנטים לטמפרטורת החדר לפני השימוש.הוצא את הריאגנטים מהמקרר שעה לפני הניסוי. הכן תמיסת H-B-S-S-H-S-A להפרדת נויטרופילים. העבר באמצעות פיפט HBSS עם calcium chloride למבחנה.שאבו HSA למזרק. הימנעו מכליאת בועות אוויר. הסירו את מחט המזרק והחליפו אותה במסנן.הזריקו HSA דרך מסנן לתוך מבחנה של HBSS וערבבו במערבל Vortex. כאשר שאר החומרים מוכנים ובטמפרטורת החדר, השגי בעת כזו כ-15 milliliters של דם מ

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מדגים בדיקת מבחנה לחקר אינטראקציה בין נויטרופילים לביופילם. החיידקים הפתוגניים המשובצים בביופילם ובנויטרופילים המבודדים סומנו באמצעות תוויות פלואורסצנטיות, והתגובה החיסונית של הנויטרופילים והתחמקות התגובה החיסונית על ידי החיידקים הוערכו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

בדיקת מבחנה לחקר האינטראקציה בין נויטרופילים וביופילם

סרטון זה מדגים את ההשראות וההדמיה של מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות או NETs בנויטרופילים מסומנים מראש באמצעות נסיוב מטופלים המכיל נוגדנים ציטופלזמיים אנטי-נויטרופילים. יתר על כן, שימוש בצבע DNA בלתי חדיר ומיקרוסקופ פלואורסצנטי מאפשר הדמיה של NETs.

אינדוקציה והדמיה של מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים בנויטרופילים שסומנו מראש

בפרוטוקול הבא, אנו מתארים דרך פשוטה מאוד לבודד את מלכודות נויטרופילים תאיות (רשתות) מכל דם אנושי באמצעות ריאגנטים זמינים. לאחר מכן, אנו מדגימים כיצד ניתן להשתמש ברשתות המבודדות בassay הידבקות במבחנה עם תאים סרטניים.

פשוטה מלכודות תאיות נויטרופילים אדם בידוד (רשתות) וטיפול

נויטרופילים ממלאים תפקיד חשוב לא רק בהגנה על המארח מפני מיקרואורגניזמים פולשים, אלא גם מעורבים במעקב חיסוני אחר תאי גידול. כאן, אנו מתארים טכניקות הקשורות לבידוד נויטרופילים בעלי תכונות אנטי-גידוליות ושיטות לניטור תפקוד נויטרופילים נגד גידול במבחנה וב-vivo.

בידוד ואפיון של נויטרופילים עם תכונות אנטי-סרטניים

נויטרופילים הם הסוג הנפוץ ביותר של תאי דם לבנים. בידוד הנויטרופילים מדם אנושי בשיטת הפרדת שיפוע צפיפות והתמיינות של תאים פרומילוציטיים אנושיים (HL60) לאורך המסלול הגרנולוציטי מתוארים כאן; לבחון את תפקידם ברגישות של תאי לימפומה לחומרים אנטי-לימפומה.

בידוד נויטרופילים וניתוח כדי לקבוע את תפקידם רגישות תאים לימפומה לסוכנים טיפוליים

אנו מתארים כאן שיטה לקבלה והגדרה תת-אוכלוסייה חדשה מאופיינת של פגוציטים ענקים הנגזרות נויטרופילים. תאים אלה להתפתח תרבות מן נויטרופילים דם אדם טריים, ומאופייני phagocytosis, autophagy, גודל גדול מאוד, ואת תוחלת חיים מורחבות. שיטה זו היא חיונית כדי להמשיך לחקור תת-אוכלוסייה ייחודית זו נגזרה-נויטרופילים.

פיתוח זיהוי של subpopulation רומן של אדם נויטרופילים הנגזר הענק Phagocytes במבחנה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להפקת נויטרופילים מלכודות (רשתות) ו-NETQUANT הפעלה, תוכנה אוטומטית לחלוטין לכמת של רשתות בתמונות immunofluorescence.

הדמית מבוססת תמונה אוטומטית של מלכודות נויטרופילים באמצעות NETQUANT

פרוטוקול זה מפרט שיטה לבידוד של נויטרופילים מדם שלם, מעילי באפי או ממברנות לויקפרזיס, השגת תשואה טובה, טוהר גבוה, והפעלת תאים מינימלית. אנו משתמשים טיהור הדרגתי, משקעים בתאי דם אדומים (RBC), ותסיסת RBC כדי לקבל הכנה נויטרופיל באיכות גבוהה / טוהר.

בידוד של נויטרופילים אנושיים מדמם שלם ומעילי באפי

פרוטוקול מוגדר זה מתאר גישת מיקרוסקופיה בתפוקה גבוהה בזמן אמת כדי להמחיש ולכמת שחרור מלכודת נויטרופילים חוץ-תאית אנושית (NET) במבחנה. השיטה הניתנת לשחזור מאפשרת לחקור את המאפיינים והקינטיקה של שחרור NET בעת גירוי עם משפרי NETosis מובהקים ומאפשרת הערכה של הפרמקולוגיה של אנטגוניסטים של NETosis.

כימות מיקרוסקופי בזמן אמת בתפוקה גבוהה של שחרור מלכודת נויטרופילים חוץ-תאית אנושית והערכת הפרמקולוגיה של אנטגוניסטים

כאן, אנו מספקים גישה אמינה לבידוד נויטרופילים בצפיפות נמוכה ונורמלית מדם מלא באמצעות בידוד מגנטי (ברירה שלילית) ומדיום שיפוע צפיפות לא רציף. הוא מבטיח בידוד ללא נגיעה של תאים בעלי טוהר גבוה (≥93%), מה שמקל על ניתוח מדויק במורד הזרם של תת-אוכלוסיות נויטרופילים, חיוני להבנת תפקידיהם בבריאות ובמחלות.

בידוד ואפיון של נויטרופילים בצפיפות נמוכה ונורמלית מדם מלא

נויטרופילים בצפיפות נמוכה (LDN) גדלים באופן משמעותי במספר מחלות. LDN מבודדים בדרך כלל באמצעות מיון תאים. אנו מציגים שיטה מעשית להשגת LDN טהור ובר קיימא. לאחר צנטריפוגה של שיפוע צפיפות של דם היקפי, התאים מודגרים עם מיקרו-חרוזים מגנטיים, ולאחר מכן LDN מופרדים באמצעות עמודות מגנטיות.

שיטת מיקרו-חרוזים מגנטיים מהירה לטיהור יעיל של נויטרופילים בצפיפות נמוכה

למד שיטה לאיסולציה של נויטרופילים מדם אנושי באמצעות הפרדת צפיפות. פרוטוקול זה מאפשר חקר תפקודי תאי דם לבנים בתגובות דלקתיות ומחקרים אימונולוגיים.

נויטרופילים בידוד פרוטוקול

גלה סרטונים נוספים