נויטרופילים בידוד פרוטוקול
July 23rd, 2008
נויטרופילים הם בין התאים הראשונים להגיע באתר של התגובה החיסונית דלקתיות, ואת תפקידיהם מנגנוני נחקרו רבות במבחנה. אנו מדגימים תקן צפיפות שיפוע ההפרדה שיטה לבודד נויטרופילים האדם מן הדם כולו באמצעות כלי התקשורת ההפרדה זמינים מסחרית.
פרוטוקול בידוד נויטרופילים. הליך זה יחלץ תאי דם לבנים מציוד דגימת דם מלא, צנטריפוגה ובקבוקונים. מערבולת אדוני מחט ומסנן מזרק מזרק.
מילי למותג MX gv 0.22 מיקרומטר חומרים. הפרדת נויטרופילים של כישוף האנק ותמיסת מלח דורשת שני סוגים של פתרונות HBSS. HBSS עם סידן כלורי ישמש להכנת תמיסה עם אלבומין בסרום אנושי.
HBSS ללא סידן כלורי ישמש להשעיה ושטיפת הנויטרופילים. אנא הקפד במיוחד להשתמש בתמיסת HBSS המתאימה בהליך זה. אלבומין בסרום אנושי או HSA הוא חלבון בפלזמת הדם השומר על לחץ pH ו-SMO.
אין להשתמש במאגר ליזה של תאים אדומים בסרום בקר. זה מיוצר על ידי Roche Diagnostics, מדיה לבידוד נויטרופילים NIM Cedar Line Labs אמצעי הפרדה פולי אור לימפה מוגן מאור ונשמר במקרר לקבלת התוצאות הטובות ביותר. כל הריאגנטים צריכים להיות בטמפרטורת החדר בזמן השימוש.
מוציאים ריאגנטים מהמקרר שעה לפני הניסוי. הכן תמיסת H-B-S-S-H-S-A להפרדת נויטרופילים. פיפטה HBSS עם סידן כלורי לתוך הבקבוקון.
משוך HSA למזרק. הימנע מלכידת בועות אוויר. הסר את מחט המזרק והחלף אותה במסנן.
הזריק HSA דרך פילטר למערבולת בקבוקון HBSS תערובת שתיים כאשר יש לך את החומרים האחרים שלך מוכנים ובטמפרטורת החדר, רכוש כ -15 מיליליטר דם מלא. זה יניב 10 עד 15 מיליליטר של 10 עד הנויטרופילים השמיניים. התורם לא היה צריך לצרוך אלכוהול או תרופות ללא מרשם במשך 24 שעות לפני תרומת דגימת הדם.
אלה יכולים לשבש את תהליך ההפרדה. דם מלא עשוי להיות נוגד קרישה עם EDTA ציטראט או הפרין על ידי הוספת תשעה חלקי דם לחלק אחד, K, שלושה EDTA, נתרן ציטראט או הפרין, בהתאם להוראות היצרן. השלבים הבאים יתוארו בהליך זה.
הפרד והסר פלזמה ומונוציטים. הפרד ורכוש שכבת נויטרופילים ליזה תאי דם אדומים חופשיים להשעות נויטרופילים הפרדה ראשונה. לרכוש נויטרופילים בשכבת NIM.
אסוף חמישה מיליליטר של אמצעי בידוד בצינור הצנטריפוגה. הנחת אמצעי הבידוד נמוך יותר בצינור מאפשרת לו לפעול כמסנן, שכן הצנטריפוגה תאלץ את הדם לרדת דרכו בזהירות. שכבו חמישה מיליליטר דם מעל ה-NIM להפרדה נקייה.
היזהר מאוד להימנע מערבוב הפתרונות. בצע שלב זה לאט ובזהירות ועם קצה הפיפטה קרוב לפני השטח של אמצעי ההפרדה כדי למנוע ערבוב צנטריפוגה. הפתרון ב 500 RCF למשך 35 דקות.
בטמפרטורה של 20 עד 25 מעלות צלזיוס, הדם צריך להתפצל לשש רצועות נפרדות. שש הרצועות הן מונוציטים בפלזמה, אמצעי בידוד, נויטרופילים, אמצעי בידוד נוספים וכדורית כדוריות הדם האדומות בתחתית. אם שש הרצועות הללו אינן ברורות ומובחנות, תהליך ההפרדה לא היה נקי והיה צורך לחזור עליו.
הסיבות השכיחות לפרידה גרועה כוללות בידוד ישן, תורם מדיה שצרך אלכוהול ב-72 השעות האחרונות או תורם שצרך תרופות אחרות כגון טיילנול או אספירין. הסר והשליך בזהירות את מונוציטים הפלזמה ואמצעי הבידוד. הניחו את השכבות הללו בצינור אטום והשליכו בזהירות את שכבת הנויטרופילים ואת כל אמצעי הבידוד שמתחת לנויטרופילים לקובץ צנטריפוגות נקי כדי לשחזר כמה שיותר נויטרופילים.
לעתים קרובות קל יותר לכלול גם חלק מאמצעי הבידוד מהשכבה שמתחת. אל תפריע למזרן בתחתית. הצהרה שנייה, לחדד את שכבת הנויטרופילים.
מדללים את תמיסת הנויטרופילים ל -10 מיליליטר עם HBSS ללא סידן. הפוך את הצינור כמה פעמים כדי להשעות את צנטריפוגת התאים. תמיסת הנויטרופילים.
350 RCF למשך 10 דקות. בטמפרטורה של 20 עד 25 מעלות צלזיוס, כדור אדום אמור להיות נוכח בתחתית הצינור המכיל נויטרופילים ושאריות כדוריות דם אדומות. הסר את הסופרה נאטין עם הפיפטה.
היזהר. כדי להפריע לכדור בתחתית. ליזינג כדוריות הדם האדומות.
כעת יש להשמיד את תאי הדם האדומים בדגימה על ידי ליזה. כדי לשחרר את שאריות כדוריות הדם האדומות, הוסף שני מיליליטר של מאגר ליזה של כדוריות אדומות לצינור כדי להחיות אותו. השעו את מערבולת הכדורים את הבקבוקון בהגדרה של שלוש עד ארבע.
הימנע מהגדלת הגדרת המערבולת מעל ארבע מכיוון שהדבר עלול לגרום לנויטרופילים לפעול. ייתכן שיהיה צורך במערבולת למשך מספר שניות או לדופק את המערבולת כדי להמיס את החיך. צנטריפוגה את תמיסת הליזיס ב-250 RCF למשך חמש דקות.
השתמש באפשרות ההתחלה הרכה כדי למזער את הנזק לדגימה. הסר את הסופרה נאטין בעזרת פיפטה. חזור על תהליך הליזינג.
במידת הצורך, שחרר תרחיף של נויטרופילים, הוסף 500 מיקרוליטר HBSS ללא סידן לכל צינור. מערבולת את הגלולה בהגדרה של שלוש עד ארבעה, מדללת ל-10 מיליליטר עם HPSS ללא צנטריפוגת סידן. הנויטרופילים ב-250 RCF למשך חמש דקות שואבים את החטיפה ומשליכים.
השעו מחדש את הגלולה ב-250 מיקרוליטר של HBSS עם תמיסת HSA, פעמיים 10 עד שש. נויטרופילים למיליליטר נאספים בדרך כלל.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
מאמר זה מציג שיטה לבידוד נויטרופילים אנושיים מדם שלם באמצעות טכניקת הפרדה של שיפוע צפיפות סטנדרטי. לנויטרופילים תפקיד מכריע בתגובה החיסונית הדלקתית, והבנת בידודם חיונית למחקר נוסף.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- אימונולוגיה
- ביולוגיה של תאים
- מדעי המוח
רקע
- נויטרופילים הם מהמגיבים הראשונים בתגובות דלקתיות.
- תפקודיהם ומנגנוניהם נחקרו בהרחבה in vitro.
- טכניקות בידוד חיוניות לחקר התנהגות ותפקודים של נויטרופילים.
- שיטות סטנדרטיות משפרות את הניתנות לשחזור במחקר.
מטרת המחקר
- להדגים שיטה אמינה לבידוד נויטרופילים מדם אנושי.
- לאפשר מחקר נוסף על תפקודי נויטרופילים בדלקת.
- לספק פרוטוקול שניתן לאמץ בקלות במעבדות.
שיטות ששימשו
- שיטת הפרדה של שיפוע צפיפות.
- שימוש במדיום הפרדה זמין מסחרית.
- ציוד כולל צנטריפוגה ושפופרות.
- הכנת תמיסות באמצעות HBSS עם כלוריד סידן ואלבומין מסרום אנושי.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של נויטרופילים מדגימות דם שלם.
- הדגמה של יעילות שיטת ההפרדה.
- מתן פרוטוקול ברור לחוקרים.
- יישומים פוטנציאליים בחקר התנהגות נויטרופילים בתנאים שונים.
מסקנות
- השיטה המוצגת יעילה לבידוד נויטרופילים.
- פרוטוקול זה יכול לשפר מחקר על תגובות חיסוניות.
- מחקרים נוספים יכולים לבנות על טכניקת בידוד זו.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Reliable neutrophil isolation is foundational for early-stage immunology and inflammation research, enabling precise functional studies and mechanistic de-risking in drug discovery. High-purity, high-viability neutrophil preparations support robust target validation and quantitative assay development, directly impacting predictive confidence at key portfolio inflection points. Standardized isolation protocols facilitate reproducibility and cross-functional data integration across discovery and translational teams.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of neutrophil-specific pathways and immune mechanisms relevant to inflammation and oncology.
- Supports functional target validation by providing pure, viable neutrophil populations for downstream assays.
- Reduces biological ambiguity, strengthening predictive confidence in early-stage hypothesis testing.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, high-viability neutrophil samples for reproducible in vitro assays.
- Facilitates quantitative measurement of neutrophil functions such as phagocytosis and cytokine production.
- Enables assay scalability and platform reuse for compound screening and mechanistic studies.
Translational & Preclinical Research
- Provides disease-relevant cellular material for modeling inflammatory responses in preclinical systems.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by maintaining cell function and viability.
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling functional readouts in human immune cells.
Pipeline & Workflow Integration
This density gradient neutrophil isolation protocol integrates at the interface of early discovery and assay development, supporting workflows from target validation to preclinical research.
- Discovery Biology: Supplies pure neutrophils for hypothesis-driven functional studies and pathway analysis.
- Screening: Provides reproducible, quantitative cell-based assay inputs for compound evaluation.
- Analytics: Enables measurement of cell viability, purity, and functional outputs for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models using primary human immune cells.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized protocol adaptable across multiple research programs and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic uncertainty in immune cell studies.
- Operational Value: Enhances reproducibility, standardization, and scalability of neutrophil-based assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust early data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of inflammation and immunology assets.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in density gradient separation and cell handling.
- Needs access to centrifugation equipment, sterile reagents, and validated separation media.
- Demands strict adherence to timing and temperature controls to preserve cell viability.
- Necessitates cross-team standardization for reproducible outputs across studies.
- Limited by donor variability and short neutrophil lifespan, requiring rapid downstream use.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:08
Equipment
0:24
Materials
1:24
Preparation of HBSS/HSA
2:06
Blood sample
2:38
Stages of neutrophil isolation
2:53
First separation: acquire neutrophils
4:56
Second separation: refine neutrophil layer
5:39
Third separation: lysing the red blood cells
6:27
Fourth separation: resuspending the neutrophils
