נויטרופילים בידוד פרוטוקול

פרוטוקול לבידוד נויטרופילים. הליך זה ישמש להוצאת תאי דם לבנים מדגימת דם מלאה באמצעות צנטריפוגה ומבחנות. וורטקס, מחט ומזרק, מסנן מזרק.

חומרים מסוג Millipore ממותג MX gv 0.22 Micrometer. הפרדת נויטרופילים בתמיסת Hank's balanced salt solution דורשת שני סוגים של תמיסות HBSS. תמיסת HBSS עם calcium chloride תשמש להכנת תמיסה עם human serum albumin.

HBSS ללא סידום כלורי ישמש להשעיה ושטיפה של הנויטרופילים. אנא הקפידו להשתמש בתמיסת ה-HBSS המתאימה בהליך זה. אלבומין מנתח אנושי או HSA הוא חלבון בפלזמה של הדם השומר על ה-pH ועל הלחץ האסמוטי.

אין להשתמש בבופר לליזיס של תאי דם אדומים מסוג bovine serum amalgamate. מוצר זה מיוצר על ידי Roche Diagnostics, neutrophil Isolation Media NIM Cedar Line Labs Lymph light Poly separation media. יש להגן על המדיה מהאור ולשמור אותה במקרר לקבלת התוצאות הטובות ביותר. יש להביא את כל הריאגנטים לטמפרטורת החדר לפני השימוש.

הוצא את הריאגנטים מהמקרר שעה לפני הניסוי. הכן תמיסת H-B-S-S-H-S-A להפרדת נויטרופילים. העבר באמצעות פיפט HBSS עם calcium chloride למבחנה.

שאבו HSA למזרק. הימנעו מכליאת בועות אוויר. הסירו את מחט המזרק והחליפו אותה במסנן.

הזריקו HSA דרך מסנן לתוך מבחנה של HBSS וערבבו במערבל Vortex. כאשר שאר החומרים מוכנים ובטמפרטורת החדר, השגי בעת כזו כ-15 milliliters של דם מלא. זה יניב 10 עד 15 milliliters של 10^8 נוטרופילים. התורם לא אמור היה לצרוך אלכוהול או תרופות ללא מרשם במשך 24 שעות לפני תרומת דגימת הדם.

אלה עלולים להפריע לתהליך ההפרדה. ניתן למנוע קרישה של דם מלא באמצעות EDTA citrate או heparin על ידי הוספת תשעה חלקים של דם לחלק אחד של K three EDTA sodium citrate, או heparin בהתאם להוראות היצרן. השלבים הבאים יתוארו בפרוטוקול זה.

הפרידו והסירו את הפלזמה ואת המונוציטים. הפרידו והשיגו שכבת נויטרופילים תוך ליזיס של תאי דם אדומים להשגת נויטרופילים תלויים בהפרדה הראשונה. השיגו נויטרופילים בשכבת NIM.

אספו חמישה מיליליטר של מדיום בידוד לשפופרת צנטריפוגה. מיקום מדיום הבידוד בחלק התחתון של השפופרת מאפשר לו לשמש כמסנן, שכן הצנטריפוגה תדחף את הדם מטה דרכו בזהירות. הניחו שכבה של חמישה מיליליטר של דם מעל ה-NIM להפרדה נקייה.

יש להיזהר מאוד כדי למנוע ערבוב של התמיסות. בצע שלב זה באיטיות ובזהירות, כאשר קצה הפ pipette קרוב לפני השטח של תוכה המפריד כדי למנוע ערבוב. צנטריפוגה את התמיסה ב-500 RCF למשך 35 דקות.

בטמפרטורה של 20 עד 25 מעלות Celsius, הדם אמור להיפרד לשישה פסים מובחנים. ששת הפסים הם פלזמה, מונוציטים, מדיום בידוד, נויטרופילים, מדיום בידוד נוסף, ומשקוב של תאי דם אדומים בתחתית. אם שישה פסים אלו אינם ברורים ומובחנים, תהליך ההפרדה לא היה נקי ויש לחזור עליו.

גורמים נפוצים להפרדה לקויה כוללים מדיום בידוד ישן, צריכת אלכוהול על ידי התורם ב-72 השעות האחרונות, או צריכת תרופות אחרות על ידי התורם, כגון Tylenol או אספירין. הסר בזהירות והשלך את המונוציטים של הפלזמה ואת מדיום הבידוד. העבר שכבות אלו לשפופרת ניתנת לאטימה והשלכן; שאיב בזהירות באמצעות פיפט את שכבת הנויטרופילים ואת כל מדיום הבידוד שמתחת לנויטרופילים אל מבחנה נקייה לצנטריפוגה, כדי להשיג כמה שיותר נויטרופילים.

לעיתים קרובות הכי קל לכלול גם חלק ממדיום הבידוד מהשכבה שמתחת. אין להפריע למשקע בתחתית. הצהרה שנייה, זיקוק של שכבת הנויטרופילים.

דללו את תמיסת הנויטרופילים ל-10 milliliters באמצעות HBSS ללא סידן. הפכו את המבחנה מספר פעמים כדי להביא את התאים לתליה. סבבו בצנטריפוגה את תמיסת הנויטרופילים.

350 RCF למשך 10 דקות. בטמפרטורה של 20 עד 25 מעלות צלזיוס, אמור להיווצר משקע אדום בתחתית המבחנה המכיל נויטרופילים ותאי דם אדומים ששאריות. הסר את הנוזל העליון (supernatant) באמצעות פיפטה.

היזהרו לא להפריע למשקע שבתחתית. ליזיס של תאי הדם האדומים.

כעת יש להשמיד את תאי הדם האדומים שבדגימה באמצעות ליזיס. כדי לבצע ליזיס לתאי הדם האדומים שנותרו, הוסף לשפופרת resus שני מיליליטר של תמיפת ליזיס לתאי דם אדומים. השעה את המשקע על ידי ערבוב ב-vortex של המבחנה בהגדרה של שלוש עד ארבע.

הימנעו מהעלאת הגדרת הוורטקס מעל 4, שכן הדבר עלול לגרום להפעלת הנויטרופילים. ייתכן שיהיה צורך לבצע וורטקס למשך מספר שניות או להפעיל את הוורטקס בפולסים כדי להמיס את המשקע. סבבו במ centri-fuge את תמיסת הליזיס ב-250 RCF למשך חמש דקות.

השתמש באפשרות ההפעלה הרכה (soft start) כדי למזער את הנזק לדגימה. הסר את הנוזל העליון (supernatant) באמצעות פיפטה. חזור על תהליך הליסיס.

במידת הצורך, לשחרור תרחיף הנויטרופילים, יש להוסיף 500 microliters של HBSS ללא סידן לכל מבחנה. יש לערבב את המשקע בוורטקס בהגדרה של שלוש עד ארבע, לדלל ל-10 milliliters עם HPSS ללא סידן ולסבב בצנטריפוגה. יש לסבב את הנויטרופילים ב-250 RCF למשך חמש דקות, לשאוב את הנוזל העליון ולהשליכו.

יש להשעות מחדש את המשקע ב-250 µL של תמיסת HBSS עם HSA. בדרך כלל נאספים 2 × 10⁶ נויטרופילים למילליליטר.