מיקרוסקופיית מיקום מולקולה אחת של חלבוני ממברנה באמצעות תיוג נוגדן יחיד

המחקר שלי מתמקד בממברנה של תאי T ומטרתו לחשוף תובנות ננו-קנה מידה חדשות הרלוונטיות למיקוד טיפולי. שיטות הדמיה קיימות בדרך כלל אינן מדגימות ישירות אינטראקציות בין נוגדנים לאפיטופים בקנה מידה ננומטרי בתאים. פרוטוקול זה מתגבר על מגבלה זו בכך שהוא מאפשר תצפית ישירה בתוך הסביבה התאית.

לאחר התקנת הדגימה על המיקרוסקופ והפקדת קולואידים זהב על פני השטח, השתמשו בהארה בשדה בהיר כדי לוודא שכמות מספקת של קולואידים הושקעו באזור העניין. ודאו שהצפיפות האידיאלית של 5 עד 10 קולואידים זהב קיימת באזור העניין לפני הממשיכים. לגבי התצורה האופטית של גלאי הנוגדן פלואורופור, פתח את תוכנת ההדמיה וגש להגדרות הקונפיגורציה האופטית.

בחר את המראה הדיקרואית המתאימה וקבע את אורך גל ההתעוררות של הלייזר וצפיפות ההספק. כוון את זמן האינטגרציה של המצלמה ובחר את מסנן הפליטה. לאחר מכן, הגדר את סידור הפיקסלים של המצלמה כך שיגיע לגודל פיקסלים של 150 עד 160 ננומטר.

כעת, צור קונפיגורציה אופטית לשלב הלבנת התמונות על ידי בחירת מצב הלבנת תמונות בתוכנת ההדמיה. כוון את עוצמת הלייזר ל-100% וכוון את זמן האינטגרציה של המצלמה לשנייה אחת. הגדר את פרמטרי ההדמיה בתוכנת רכישת התמונה על ידי הגדרת המרווח הלא-מאירה, מספר הפריימים ותדירות שלב ההלבנת הפוטו.

לאחר מכן, יש להכין את בופר ההדמיה על ידי דילול נוגדן CD81 לריכוז של 1 מיקרוגרם למיליליטר ב-200 מיקרוליטר של 5% BSA המיוצר ב-DPBS. הריכוז הסופי המומלץ של נוגדנים הוא 0.5 ננומולר לתאי ג'ורקט T, או 2 ננומולר לתאי U-2 OS. הוסיפו את בופר ההדמיה המוכן לבאר המכיל את התאים והתחילו את רכישת התמונה בתוכנה כדי להתחיל באיסוף הנתונים.

השתמש בפונקציית התצוגה החיה בתוכנת ההדמיה המוגדרת לתיוג נוגדן יחיד בממברנה כדי לנטר את קישור הנוגדנים בזמן אמת. הגדר את פרמטרי ההדמיה בתוכנת רכישת התמונה לקבלת לפחות 10 פריימים וקבע את המרווח הלא-מאייר לחמש שניות. התחל ברכישה והעריך את הדלילות של מיקומי מולקולה בודדת בסרט המוקלט.

אם נצפו אירועי קשירת נוגדנים חופפים מיד לאחר הוספת בופר ההדמיה, או אם מצטברים לוקאליזציות של מולקולה בודדת עם הזמן, יש לבטל את הרכישה. הפחת את ריכוז הנוגדנים פי שניים וחזר על הרכישה על דגימה חדשה. המשך להפחית את ריכוז הנוגדנים פי שניים ולהעריך מחדש את מספר האירועים ליחידת שטח עד להשגת צפיפות המיקום הרצויה של מולקולה בודדת.

אם צפיפות האירוע נמוכה, יש להעלות פי שניים את ריכוז הנוגדנים בבופר ההדמיה. חוזרים על הרכישה על דגימה חדשה והמשיכו להעלות את ריכוז הנוגדנים פי שניים תוך הערכת מספר אירועי הקשר ליחידת שטח עד להשגת צפיפות המיקום הרצויה של מולקולה אחת. לאופטימיזציה של מרווחים שאינם מאירים, הגדר את פרמטרי ההדמיה בתוכנת רכישת התמונה כדי לקבל רכישה של 50 פריימים.

לאחר הוספת הנוגדן ותחילת הרכישה, הערך את הצפיפות והדלילות של מיקומי מולקולה בודדת בסרט המוקלט. קבעו את המרווח הלא-מאייר הנמוך ביותר שמניב צפיפות אירוע חד-מולקולית אופטימלית. לבסוף, אם אירועי קישור חופפים מרחבית מתרחשים במהלך תהליך קבלת התמונה, יש להכניס שלב הלבנת תמונות במרווחים קבועים.

כוונו את תדירות ההלבנה הפוטוגרפית כך שהפלואורסצנציה מנוגדנים קשורים תוסר לפני שאירועים חופפים מצטברים. הגדר את נתיב הקובץ בתוכנת MATLAB לתיקייה שמכילה את קובץ הערכים המופרדים בפסיקים של תא M ששוחזר. הרץ את הקוד על ידי לחיצה על Run בסרגל הכלים של MATLAB.

כאשר מתבקשים, בחר את קובץ ה-CSV של תא M ולחץ על פתח כדי לטעון אותו לתוכנית. הרץ את הניתוח באמצעות הקלטים שהוגדרו מראש כנקודת התחלה. הערכת תרשים הפיזור המכיל את נתוני הלוקליזציה הלא מקובצת.

בחרו ערך נקודה מינימלי שהוא גבוה ממספר לוקאליזציות הרעש אך נמוך ממספר הלוקליזציות בתא. הערך את החלון שמציג את הנתונים המקובלים. אשר כי אשכולות נשמרים על התא עם הפנוטיפ הצפוי בעוד שמיקומים מחוץ לתא מצטמצמים.

אם פרמטרי האשכול מגבילים מדי, יש להוריד את ערך הנקודות המינימליות ולהגדיל את האפסילון. אם פרמטרי האשכול כוללים מדי, הגדילו את ערך הנקודות המינימליות והקטינו את האפסילון. לבסוף, לאחר התאמת ערך הנקודות המינימלי ו-epsilon, הריץ מחדש את הקוד כדי לקבל אשכולות אופטימליים.

תאי T של ג'ורקט היו משובצים עם מרווח מספק לשמירה על שלמות הממברנה ולאפשר גישה לאפיטופים של הממברנה לנוגדנים. קולואידים זהב הוצגו ושימשו כסמנים פידוציאליים לתיקון סטייה צדדית במהלך רכישת תמונת תאי M. אופטימיזציה של מרווח האי-הארה הראתה כי מרווח של חמש שניות יצר אירועי קישור נוגדנים עם חפיפה מרחבית מינימלית לעומת מרווחים קצרים או ארוכים בריכוז נוגדן ננומולר אחד.

יישום תיקון הסחף שיפר את תמונת תא M המשוקמת בהשוואה לשחזור הלא מתוקן. קיבוץ מבוסס צפיפות של מיקומי תאי M הפחית אינטראקציות רקע בצפיפות נמוכה והדגיש אירועי קישור מקובצים של CD81. ניתן לצפות בנוגדנים הפועלים עם אפיטופי הממברנה שלהם בסביבה תאית, ולספק תובנות רלוונטיות לנוגדנים טיפוליים.

ריכוז הנוגדנים, מרווח אי-ההארה ושלבי הלבנת התמונות הם קריטיים לאופטימיזציה. פרמטרים לא אופטימליים יפגעו בתוצאות. ניתן להרחיב את סימון נוגדן יחיד כדי להעריך בו-זמנית קישור חלבוני ממברנה על ידי מספר נוגדנים באותה סביבה תאית.