מיפוי דיפוזיה מולקולרית בקרום פלזמה ידי מרובות יעד Tracing (MTT)

שלום. בסרטון זה אנו מציגים ניסוי מלא למעקב אחר קוונטום בודד. אלגוריתם ייעודי תוכנן במלואו בשיתוף פעולה עם מומחים מדימוג'י ISIS. במהלך סרטון זה, נשתמש בקולטן גורמי הגדילה של אפיתל (epidermal growth factor receptor) כמודל לתיאור השיטה של טכניקה זו.

קולטן גורם הגדילה האפידרמלי הוא חלבון טרנס-ממברנלי. קולטן זה יסומן באמצעות נוגדן מונוקלונלי, אשר יחורר כדי להשאיר רק את הפרגמנט A a B. פרגמנט A a B עובר ביוטיניליזציה, ולאחר מכן, בקישור לסטרפטאווידין של הנקודה הקוונטית, המערכת תזהה במדויק את קולטן ה-EGF.

מטרתנו היא לספק מבט מקיף על הדינמיקה של רספטורים על פני השטח של התא. ואכן, מסלולים מולקולריים עשויים לסטות מדיפוזיה חופשית על ידי היותם מוגבלים בתוך ננו-דומיינים. לדוגמה, וייתכן שזהו סימן לאינטראקציה בסיסית עם, למשל, שותפי איתות או פיגומים מולקולריים.

מטרתנו היא לתאר אירועים אלו באופן ממצה על ידי מיפוי שלהם על פני התא, דבר הדורש עבודה ברזולוציה טמפורלית גבוהה של SPECT יחד עם צפיפות סימון גבוהה. לפיכך, אנו מכנים גישה זו מעקב רב-מטרות (multi target tracing). השלב הראשון של הניסוי הוא הכנת הדגימה.

אנו עובדים עם תאים חיים ללא אנטיביוטיקה. כאן אנו משתמשים בתאי Cos-7, המבטאים באופן אנדוגני קולטני EGF. לאחר ניתוק התאים, עלינו לבצע ספירה מדויקת כדי להבטיח מספר זהה של תאים בכל באער של הפלטה.

מספר מדויק של תאים הוא חשוב מאוד להגברת הניבוי למספר ה-quantum dot לכל תא. לאחר חלוקת התאים לבארות, יש להדגיר את התרבית למשך 24 שעות ב-37 °C עם 7% CO2. השלב הבא הוא הכנת quantum dot המשורשרים לנוגדנים. quantum dots הם ננו-חלקיקים פלואורסצנטיים קטנים.

חלקיקים אלו בעלי עניין רב כאן מכיוון שהם בהירים ויציבים מאוד בהשוואה לגששים פלואורסצנטיים וסיגנלים קלאסיים. יחס רעש הוא חשוב מאוד לסוג זה של ניסוי. במקרה זה, אנו משתמשים במצע מלא כדי להרוויע את הסביבה סביב הנקודות הקוונטיות ולמנוע אגרגציה.

לאחר מכן, ערבבנו את הנקודות הקוונטיות עם החלבון או הנוגדנים הרצויים המצומדים ל-bioTE ביחס של אחד ለአחד, כדי להשיג סטטיסטית יותר נקודות קוונטיות חד-ערכיות. בניסוי זה, אנו משתמשים בפרגמנט Fab נגד קולטן EGF, שהופק במעבדה מנוגדנים מונוקלונליים ושסומן בביוטין. במהלך האינקובציה, שנמשכת כ-15 דקות, ניתן לשמור על בקרה על אגרגציה והומוגניות באמצעות שייקר במהירות של 1,200 סיבובים לדקה ובטמפרטורה של 25 °C.

כאשר התערובת מוכנה, ניתן להוסיף אותה לתאים. הסירו את המצע מהבאר בעדינות רבה כדי למנוע התנתקות של תאים מהמשטח, והוסיפו את כמות התערובת הדרושה לניסוי שלכם. במקרה זה, נוסיף 100 µL תערובת לכל באר.

לאחר הוספת התערובת, ניתן לדגרא את התאים למשך 15 דקות. במקרה זה, בטמפרטורה של 37°C עם 7% CO2. לאחר דגרציה זו, ייתכן שיופיע מספר רב של נקודות תאומות שכיחות התלויות במצע הגידול.

יש להסיר נקודות קוונטום אלו לפני ההדמיה, בשל הרעש שהן יוצרות. זו הסיבה לכך שעלינו לשטוף כל באר מספר פעמים, ובמקרה זה, חמש פעמים כדי לשטוף אותן היטב.

השתמשו בתווך דימוי ללא פלואורסצנציה עצמית. כאן אנו משתמשים בבופר HBSS עם aps. כעת התאים שלכם מוכנים.

הגיע הזמן לעבור למערך הרכישה. המערך מורכב מארבעה חלקים עיקריים: מיקרוסקופ הפוך, מצלמה בעלת רגישות גבוהה, מנורת כספית עוצמתית ואינקובטור לשמירה על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות. האור ממנורת הכספית עובר דרך סיב ודרך גלגל מסננים לפני שהוא מאיר את הדגימה.

הפלוורסנציה של הדגימה מסוננת ונאספת על ידי מצלמת E-M-C-C-D משמאל. אנו משתמשים כעת בעדשות עם מפתח מספרי (numerical aperture) של 1.3 ו-1.49 עם טבילה בשמן. השלב המרכזי בניסוי זה הוא הרכישה עצמה.

ברגע שהתאים נמצאים במיקוד, אנו בוחנים תא מייצג בעל סימון חזק. בנקודות קוונטיות, אנו מקבלים תחילה תמונה בודדת באור לבן חולף, שניתן להשתמש בה בהמשך כדי לבדוק את מראה התא ואת הגבול המרחבי של ה-LA podia. לאחר מכן אנו מקליטים וידאו, בדרך כלל בקצב של 36 מילישניות, הקצב המהיר ביותר המותר בפרימה מלאה (full frame).

אנו משתמשים ב-CCD בעל הכפלה אלקטרונית כדי להגיע לרגישות של מולקולה בודדת עם יחס אות לרעש מספיק, לפחות מעל 20 decibel. בדרך כלל סביב 25 decibel, ואנו רוכשים בדרך כלל 300 פריימים. כדי להעריך מערך נתונים נתון, עליכם לספק רק את הנתיב לספריה המכילה את קבצי הווידאו.

לאחר הקלדת הפקודה, הטקסט מתחבר מחדש ב-MetLab או באמצעות הפקודה MTT 23 I, אשר מציגה תחילה ממשק גרפי של רשימה. כל הפרמטרים שבשימוש יפעילו את הניתוח האוטומטי מלא. ניתוח ה-MTT הליבתי מבוצע על כל פריים, תוך הפעלת שלושה משימות עיקריות, ראשיתם זיהוי עבור כל פיקסל של נוכחות או היעדר של יחידת מטרה קוונטית.

לאחר מכן, עבור כל זיהוי, מתבצעת הערכה של הפרמטרים הרלוונטיים של המטרה, כגון מיקום הפיקסל שלה, עוצמת האות וכן הלאה. לבסוף, מתבצע חיבור מחדש של המטרות החדשות עם העקבות שכבר נבנו על פני הפריימים הקודמים עבור כל פיקסל.

בבחינת תת-אזור מקומי, אנו משווים בין שתי היפותזות קיומיות: נוכחות של רעש בלבד או נוכחות של אות. עם פונקציית הפיזור של הנקודה (point spread function), ל-ModuLite יש שיא דק. אנו משתמשים בסף המבטיח מספר נמוך מספיק של התראות שגויים, עם פחות מזיהוי אחד שגוי לכל פריים עבור כל מטרה שזוהתה.

לאחר מכן נבצע התאמה של ריבועים מינימליים (least square) של פונקציית גאוסיאן כדי להעריך את המיקום, הרוחב והגובה של הפסגות שזוהו. פעולה זו מספקת בייחוד את מיקום התא הספציפי של הצבע, בדרך כלל בדיוק של כ-10 עד 20 ננומטרים עבור יחסי אות לרעש טיפוסיים. בצפיפות גבוהה, פסגות עשויות להיות קרובות מדי, ופסגות חזקות עלולות להפריע לזיהוי של אלו החלשות יותר; כדי לטפל בכך, נבצע דפלציה (deflation) לפסגות שזוהו מהתמונה הראשונית.

שוב, זיהוי על השארית יכול בדרך כלל להחזיר כ-10% מהפסגות. הגעה לזיהוי כמעט מקיף היא פורייה מאוד עבור חיבור מחדש מדויק. לאחר מכן, קבוצת המטרות החדשות מותאמת לקבוצת העקבות הקודמים עבור אישון זה.

על מנת לשייך כל עקבה למטרה במידת האפשר, ולטפל בהבהובים פוטנציאליים, אנו משתמשים בכל המידע הסטטיסטי הזמין שהתקבל בשלב הגילוי. לפיכך, יעדים אינם משויכים פשוט לעקבה הקרובה ביותר. במקרה של קונפליקטים, כאשר עקבות עשויות להצטלב, כלומר כאשר אזורי המחקר הרלוונטיים חופפים, נבחן את הערכים הסטטיסטיים של העוצמה, המהירות, הרוחב וההבהוב הן עבור העקבות והן עבור המטרות.

פעולה זו מספקת את ציון החיבור מחדש האופטימלי מבחינה סטטיסטית. אסטרטגיה זו מאפשרת להימנע, במידת האפשר, מהטיה של החיבור מחדש לעבר השכנים הקרובים ביותר, דבר המעיד על התנועה האיטית ביותר. לאחר מכן, נשתמש בפונקציה להערכת כליאה זמנית אפשרית בתוך המסלולים.

פונקציה זו נמצאת ביחס הפוך לדיפוזיה המקומית, כפי שנקבע על ידי Sexton Simpson ועמיתיו. החלת סף מאפשרת להגדיר אירועים של כליאה או היעדר כליאה. על ידי חזרה על פעולה זו על פני כל העקבות, נוכל לבסוף למפות את דינמיקת הממברנה במונחים של כליאה חולפת, עדות להאטה, וניתן לייצג זאת.

לחלופין, באמצעות שימוש בערכים בינאריים או בדיסקרטיים של מדד כליאה זה, כברירת מחדל, MTT יבצע באופן אוטומטי משימות אלו, וישמור עבור כל סרטון את פרמטרי השורה עבור כל שיא בקובץ eski, לצורך מחקרים מתקדמים יותר. תוצאות טיפוסיות, כגון מפת עקבות מעל כל תא ותרשימי היסטוגרמות עבור פרמטרים רלוונטיים, עוצמות שיאים, יחס אות לרעש, ערכי מחסור מקומיים, וכך הלאה, יכולים להיות מותאמים בקלות לכל מחקר ייעודי. סרטון זה יסכם כעת תוצאות טיפוסיים שהתקבלו באמצעות MTT.

חלק ניכר מהעבודה טמון בפיתוח האלגוריתם, שעשוי לדרוש התאמה למחקרי ייעוד כגון דפוסי תנועה שונים או אינטראקציות. עם זאת, הרצת MTT היא פשוטה מאוד. על המשתמשים רק לבצע אופטימיזציה של מספר פרמטרים בודדים, כגון מגבלות המרחב והזמן.

בעת פיתוח ה-MTT, שאפנו לבחון מחדש באופן מלא את האפשרויות האנליטיות המשמשות לכל משימה. אנו מבצעים אופטימיזציה לתהליך לאורך שני צירים מאתגרים: ראשית, התמודדות עם צפיפויות גבוהות כדי לקבל את המידע המרחבי הטוב ביותר על פני השטח, ושנית, התמודדות עם SNR נמוך, מה שמאפשר בדרך כלל עבודה ברזולוציה נמוכה ובמהירות גבוהה; כך ניתן לפרש הימנעות מתנועה (confinement) כסימן לאינטראקציה בבסיס התהליך.

קולטני ממברנה עשויים לקיים אינטראקציה עם שלד התא התת-ממברנלי או עם דומיינים ליפידיים, למשל. ניתן לחקור אירועים כאלו באמצעות שינויים במידת ההגבלה (confinement) במרחב ובזמן. ניתן להשוות מדידות דינמיות לגישות משלימות כגון FRAP, FCS או FRET.

הקוד בקוד פתוח זמין למחקר אקדמי. ניתן להורידו מדף האינטרנט שלנו ב-CML dot univ תחת S fr בדף הצוותים שלנו, המספק קישור להורדה. גופים תעשייתיים המגלים עניין מוזמנים גם הם ליצור איתנו קשר.

ברצוננו להודות במיוחד לחברי הצוות שלנו ולצוותי המתקנים המשותפים על התמיכה והדיונים הפרוכתיים. פרויקט זה נתמך במימון מה-CNRS ב-c MAA University Pac Region National de La, וה-Foundation Medical נתמך על ידי league controller. תודה לצפייה.