מיפוי דיפוזיה מולקולרית בקרום פלזמה ידי מרובות יעד Tracing (MTT)

Hi.In סרטון זה אנו מציגים ניסוי מעקב קוונטי יחיד מלא. אלגוריתם ייעודי תוכנן כולו בשיתוף פעולה עם מומחי תדמית של דאעש. במהלך סרטון זה, נשתמש בקולטן גורם הגדילה האפידרמלי כמודל לתיאור השיטה של טכניקה זו.

קולטן גורם הגדילה האפידרמיס הוא חלבון טרנסממברני. קולטן זה יתויג באמצעות נוגדן חד-שבטי, אשר מצטמצם כדי לשמור רק על מקטע A A A. שבר A a B עובר ביוטיניליזציה, ולאחר מכן, מקושר לסטרפטווידין של הנקודה הקוונטית, מערכת הקירות תזהה במדויק את קולטן ה- EGF.

המטרה שלנו היא לספק מבט מקיף על הדינמיקה של קולטני פני התא. אכן, מסלולים מולקולריים יכולים לסטות מדיפוזיה של ברוט על ידי היותם מוגבלים בתוך תחומי ננו. למשל, וזו עשויה להיות חתימה של אינטראקציה בסיסית עם, למשל, שותפי איתות או פיגומים מולקולריים.

אנו שואפים לתאר אירועים כאלה באופן ממצה על ידי מיפוים על פני התא, מה שדורש עבודה ברזולוציה זמנית גבוהה של SPECT יחד עם צפיפות תיוג גבוהה. לכן אנו מכנים גישה זו מעקב מרובה מטרות. השלב הראשון בניסוי הוא הכנת הדגימה.

אנו עובדים על תאים חיים ללא אנטיביוטיקה. כאן אנו משתמשים בעלות שבעה תאים, המבטאים באופן אנדוגני קולטני EGF. לאחר ניתוק התא, אנו צריכים לאשר במדויק כדי שיהיה לנו אותו מספר תאים בבאר h של המעבדה.

מספר מדויק של תאים חשוב מאוד כדי להגדיל את יכולת החיזוי של מספר הנקודות הקוונטיות לתא לאחר חלוקת התא ב-H, ובכן, אתה צריך לדגור את ה-labate במשך 24 שעות ב-37 מעלות עם 7% של CO2. השלב הבא הוא הכנת נקודה קוונטית בשילוב נוגדנים. נקודות קוונטיות הן ננו-חלקיקים פלואורסצנטיים קטנים.

לחלקיקים האלה יש עניין גדול מאוד כאן מכיוון שהם בהירים ויציבים מאוד בהשוואה לבדיקה ואות פלואורסצנטיים קלאסיים. יחס האף חשוב מאוד לניסוי מסוג זה. במקרה זה, אנו משתמשים במדיום שלם כדי להרוות את רעיונות הרצועה סביב הנקודות הקוונטיות וכדי למנוע צבירה.

לאחר מכן, היו לנו את הנקודות הקוונטיות בחלבון המרומם של bioTE או בנוגדנים מעניינים עם יחס של אחד לאחד על מנת לקבל נקודות קוונטיות חד-ערכיות יותר מבחינה סטטיסטית. בניסוי זה, אנו משתמשים במקטע b כנגד קולטן EGF המיוצר במעבדה מנוגדנים חד שבטיים ואשר מכוונים לביוטין. במהלך הדגירה כ -15 דקות, אתה יכול לשמור על הבקרה תחת צבירה והומוגניות באמצעות שייקר ב -1, 200 סיבוב לדקה ושתיים חמש מעלות.

כשהתערובת מוכנה, אתה יכול להוסיף אותה על התאים שלך. הסר את המדיום מהבאר בעדינות רבה כדי למנוע ניתוק תאים בטכנולוגיית המעבדה והוסף את כמות התערובת הדרושה לניסוי שלך. במקרה זה, נוסיף 100 מיקרוליטר תערובת לבאר.

לאחר הוספת התערובת, אתה יכול לדגור על התא שלך למשך 15 דקות. במקרה זה ב-37 מעלות עם 7% CO2. לאחר דגירה זו, ייתכן שתמצא מספר גבוה של נקודות תאומות תכופות בהשעיה על המדיום.

יש להסיר את הנקודות הקוונטיות הללו לפני ההדמיה. בגלל הרעש שאנחנו מביאים. זו הסיבה שאנחנו צריכים לשטוף כל אחד, ובכן מספר פעמים במקרה זה, חמש פעמים כדי לשטוף את עצמכם.

השתמש במדיום הדמיה ללא אוטופלואורסצנטיות. כאן אנו משתמשים במאגר HBSS עם aps. עכשיו התאים שלך מוכנים.

הגיע הזמן ללכת להגדרה לרכישה. המערך מורכב מארבעה חלקים עיקריים, מיקרוסקופ הפוך, מצלמה עם רגישות לעיניים, מנורת כספית עוצמתית ואינקובטור לשמירה על התא ב-37 מעלות. האור ממנורת הכספית עובר דרך סיב ודרך גלגל פילטר לפני שהוא מאיר את הדגימה.

תחושת השפעת של הדגימה מסוננת ונאספת על ידי מצלמת E-M-C-C-D משמאל. אנו משתמשים כרגע ב-1.3 ו-1.49 סוחר נפט עם צמצם מספרי של יעדים. השלב המרכזי בניסוי זה הוא הרכישה בפני עצמה.

ברגע שהתאים נמצאים בפוקוס, אנו מסתכלים על תא מייצג עם תווית חזקה. בנקודות קוונטיות, אנו רוכשים תחילה תמונה בודדת באור לבן מועבר, שניתן להשתמש בה עוד יותר כדי לבדוק את היבט התא ואת הגבול המיוחד של LA podia. לאחר מכן אנו רוכשים וידאו בדרך כלל בקצב של 36 אלפיות השנייה, הקצב המהיר ביותר המותר בפריים המלא.

אנו משתמשים ב-CCD המכפיל אלקטרונים כדי להגיע לרגישות של מולקולה בודדת עם יחס אות לצפון מספיק לפחות מעל 20 דציבלים. בדרך כלל בסביבות 25 דציבלים, אנו בדרך כלל רוכשים 300 פריימים. כדי להעריך מערך נתונים נתון, עליך רק לספק את האישור לספרייה המכילה את קבצי הווידאו.

לאחר מכן, הקלדת הפקודה, הטקסט מתחבר מחדש ב-MetLab או בפקודה MTT 23 I, המציגה תחילה רישום ממשק גרפי. כל הפרמטרים המשמשים יתחילו את הניתוח האוטומטי לחלוטין. ניתוח הליבה של MTT מבוצע על פני כל פריים, תוך הפעלת שלוש משימות עיקריות, זיהוי ראשון עבור כל פיקסל לנוכחות או היעדר חוב קוונטי יעד.

לאחר מכן עבור כל הערכת זיהוי של הפרמטרים הרלוונטיים של היעד כגון מיקום הפיקסל שלו, עוצמת האות וכן הלאה. חיבור מחדש אחרון של היעדים החדשים. עם העקבות שכבר נבנו מעל הפריימים הקודמים עבור כל פיקסל.

בהתחשב בתת-אזור מקומי, אנו משווים שתי השערות, או של רעש בלבד או של אות. עם פונקציית פיזור הנקודות, ל-ModuLite יש שיא הין. אנו משתמשים בסף המבטיח אזעקות שווא נמוכות מספיק עם פחות מזיהוי עיון אחד לכל מסגרת עבור כל מטרה שזוהתה.

לאחר מכן אנו מבצעים רגלי תזונה מרובעות לפחות כדי להעריך את המיקום, הרוחב והגובה של הגושן שזוהה. זה מספק במיוחד את מיקום התא הספיק של הצבע, בדרך כלל דיוק של 10 עד 20 ננומטר עבור יחסי אות לרעש טיפוסיים בשיאים בצפיפות גבוהה יכול לעתים קרובות להיות סגור מדי ופסגות חזקות עלולות להפריע לחלשים ביותר להתמודד עם זה. אנו מרוקנים את הפסגות שזוהו מהתמונה הראשונית הפועלת.

שוב, זיהוי על השאריות יכול בדרך כלל להטות מחדש 10% מהפסגות. הגעה לגילוי כמעט ממצה היא פורייה מאוד לחיבור מחדש מדויק. לאחר מכן קבוצת המטרות החדשות מותאמת לקבוצת העקבות הקודמות עבור תלמיד זה.

על מנת להקצות כל עקבה למטרה במידת האפשר, ולטפל בהבהוב אפשרי, אנו משתמשים בכל המידע הסטטיסטי הזמין המתקבל משלב הזיהוי. לפיכך, מטרות אינן מוקצות רק לעקיבה הקרובה ביותר. במקרה של התנגשויות, כאשר עקבות עשויות לחצות, כלומר אזורי המחקר הרלוונטיים בהתאמה חופפים, נשקול את הערך הסטטיסטי של עוצמה, מהירות, רוחב ומצמוץ הן עבור העקבות והן עבור המטרות.

זה מספק את ציון החיבור מחדש האופטימלי מבחינה סטטיסטית. האסטרטגיה מאפשרת להימנע במידת האפשר, הטיית החיבור מחדש לכיוון השכנים הקרובים ביותר, כלומר התנועה האיטית ביותר. לאחר מכן אנו משתמשים בפונקציה כדי להעריך כליאה חולפת אפשרית בתוך המסלולים.

פונקציה זו קשורה באופן הפוך לדיפוזיה המקומית כפי שנקבעה על ידי סקסטון סימפסון ומשתפי פעולה. החלת סף מאפשרת להגדיר אפיזודות מוגבלות או לא. על ידי חזרה על עקבות כלליים אלה, אנו יכולים סוף סוף למפות את הדינמיקה של הממברנה במונחים של כליאה חולפת, ראיות האטה, וניתן לייצג זאת.

לחלופין, באמצעות הערכים הבינאריים או הבדידים של אינדקס כליאה זה, כברירת מחדל, MTT תבצע את המשימות הללו באופן אוטומטי, ותשמור עבור כל סרטון, את פרמטרי השורה עבור כל שיא בקובץ eski, ועבור חקירות מתקדמות נוספות. תוצאות אופייניות כגון מפת העקבות על כל תא ומתווה היסטוגרמות לפרמטרים מעניינים, עוצמות שיא, יחס אות לרעש, ערכי חסר מקומיים, ולכן ניתן להתאים היבט זה בקלות לכל חקירה ייעודית. סרטון זה יסכם כעת תוצאות טיפוסיות שהושגו על ידי MTT.

חלק ניכר מהעבודה מתמקד בפיתוח האלגוריתם, שייתכן שיהיה צורך להתאים אותו לחקירות ייעודיות כמו אופני התנועה או האינטראקציות הסובלות. אבל הפעלת MTT היא מאוד פשוטה. על המשתמשים לבצע אופטימיזציה של כמה פרמטרים בלבד כגון מגבלות השטח והזמן.

כאשר פירטנו את MTT, כיוונו לשקול מחדש לחלוטין את האפשרויות האנליטיות המשמשות לכל משימה. אנו מייעלים את התהליך בשני צירים מאתגרים. ראשית, התמודדות עם צפיפויות גבוהות כדי לקבל את המידע המיוחד הטוב ביותר על פני השטח, ושנית, טיפול ב-SNR חלש, המאפשר בדרך כלל עבודה בסילוק נמוך וכליאה במהירות גבוהה יכול להתפרש כחתימה של אינטראקציה בסיסית.

קולטני ממברנה עשויים לקיים אינטראקציה עם השלד הציטולוגי התת-ממברני או תחומי השומנים הפרו-ליפידיים, למשל. ניתן לחקור אירועים כאלה באמצעות וריאציות כליאה במרחב ובזמן. ניתן להשוות מדדים דינמיים לגישות משלימות כגון FRA, F, Cs או משא.

קוד הקוד הפתוח זמין למחקר אקדמי. ניתן להוריד אותו מדף האינטרנט שלנו בכתובת CML dot univ אם S fr בדף הצוותים שלנו, המספק קישור להורדה. גם תעשיות מעוניינות מוזמנות לפנות אלינו.

ברצוננו להודות במיוחד לחברי הצוות שלנו ולמתקנים המשותפים על התמיכה והדיונים הפוריים. פרויקט זה נתמך על ידי מימון מה-CNRS ב-c MAA University Pac Region National de La, ו-Foundation Medical נתמך על ידי בקר הליגה. תודה שצפית.