Spettrometria di massa tandem

La spettrometria di massa tandem collega più fasi della spettrometria di massa per isolare prima una biomolecola e quindi determinare gli aspetti della sua composizione chimica. Le biomolecole hanno strutture grandi e complesse, il che rende difficile determinare la loro composizione molecolare. La spettrometria di massa tandem seleziona una molecola di interesse che viene successivamente frammentata in più subunità, il che può aiutare a chiarirne l'identificazione e la sequenza. Questo video mostrerà i concetti della spettrometria di massa tandem, una procedura generale e alcuni dei suoi usi in biochimica.

La spettrometria di massa tandem inizia come un tipico strumento di spettrometria di massa: con una sorgente ionica, che converte il campione in ioni, e un analizzatore di massa, che separa gli ioni in base al loro rapporto massa-carica. Un comune analizzatore di massa, il quadrupolo, lascia passare solo gli ioni con un rapporto specifico, mentre gli altri si schiantano contro le aste dell'apparato. La specie ammessa, chiamata ione precursore, è la biomolecola di interesse. Lo ione si sposta in una cella di collisione, tipicamente un altro quadrupolo, dove viene applicata energia per frammentare lo ione in uno schema prevedibile.

Questi frammenti si spostano in un altro analizzatore di massa, come un time-of-flight, che separa questi "ioni prodotto". Gli ioni prodotti vengono quindi inviati al rivelatore, come in un normale strumento MS. Nel caso di una proteina sconosciuta, lo spettro risultante contiene numerosi frammenti sovrapposti, rendendo difficile la generazione di una sequenza completa definitiva della biomolecola. Tuttavia, il modello spettrale è unico per una data proteina. Il software di analisi confronta lo spettro con un database di sequenze peptidiche note, delucidando la proteina sconosciuta dai frammenti sovrapposti.

A seconda del campione e del grado di frammentazione desiderato, sono possibili più metodi di frammentazione. I modelli di frammentazione dipendono da come l'energia viene trasferita, dalla sua quantità e da come viene distribuita attraverso lo ione precursore. L'energia può essere trasferita tramite particelle neutre, radiazioni o elettroni. Utilizzando atomi neutri, un processo chiamato dissociazione indotta da collisione o CID, si staglia principalmente il legame peptidico tra gli amminoacidi, ideale per la loro identificazione.

Ora che le basi della tecnica sono state coperte, diamo un'occhiata alla spettrometria di massa tandem CID utilizzata per studiare un componente degli involucri cellulari batterici.

Come per tutti gli esperimenti di spettrometria di massa, il primo passo è ionizzare il campione. Per le biomolecole, questo viene tipicamente fatto con il desorbimento laser assistito da matrice o la ionizzazione elettrospray. Il segnale ionico precursore viene quindi ottimizzato mediante la regolazione dell'ottica ionica. Una volta fatto, il bersaglio viene isolato e viene scelto il metodo di frammentazione, come il CID.

L'intensità di una tensione applicata, che accelera lo ione precursore nella cella di collisione, influisce sul grado di frammentazione. Questa tensione viene aumentata fino a quando il precursore ha un'abbondanza di circa il 10% rispetto allo ione prodotto più alto. Più spettri vengono acquisiti e mediati fino a raggiungere un rapporto segnale/rumore sufficiente. Il numero di scansioni necessarie dipende dall'intensità del segnale dello ione precursore originale e può variare da 3 a 300.

L'analita in questo esempio, il lipide A di Escherichia coli K-12, aveva 19 frammenti principali dopo CID. La struttura generale del lipide A è ben nota, consentendo al software di ricostruire la composizione specifica dal campione.

Ora che abbiamo esaminato la procedura, diamo un'occhiata ad alcuni dei modi in cui la spettrometria di massa tandem viene utilizzata in biochimica.

Una modalità di scansione comune nella spettrometria di massa tandem è il monitoraggio della reazione selezionata, o SRM. Nell'SRM, entrambi gli analizzatori di massa sono fissati su un rapporto massa/carica selezionato, concentrandosi su specifici precursori e ioni prodotto. A causa dell'elevato grado di sensibilità dell'SRM, gli spettri degli standard peptidici di concentrazione nota possono essere utilizzati e confrontati con quelli dei campioni sconosciuti, consentendo di quantificare le proteine di interesse.

Le proteine sono comunemente modificate dopo la traduzione, in genere mediante l'aggiunta di gruppi funzionali come gruppi metilici, gruppi fosfato o zuccheri, noti come glicani. Questi sono importanti nei processi di segnalazione cellulare, chiarendo il modo in cui le cellule comunicano tra loro. Poiché la spettrometria di massa tandem frammenta le proteine in componenti più piccoli, è possibile determinare la posizione del PTM rispetto al frammento specifico o anche a un amminoacido. Alcune modifiche, come l'acetilazione e la trimetilazione, sono difficili da differenziare in base alla sola massa, quindi la separazione cromatografica viene eseguita prima della spettrometria di massa.

Molti analiti nel sangue dei pazienti si trovano a concentrazioni inferiori al limite di rilevabilità per la spettrometria di massa tipica. Un altro vantaggio dell'SRM è che scarta tutti gli ioni prodotto tranne uno, aumentando la sensibilità e migliorando il limite di rilevamento inferiore fino a 100 volte. In questo esempio, il farmaco immunosoppressore, tacrolimus, potrebbe essere rilevato a livelli di 1 ng/mL.

Hai appena visto il video di JoVE sulla spettrometria di massa tandem. Questo video ha descritto la teoria dello strumento, ha esaminato una procedura generale e ha spiegato alcuni dei modi in cui la tecnica viene attualmente utilizzata. Grazie per l'attenzione!