Summary
نحن في هذه المقالة تصف كيف يمكننا الحصول على الحنق من آثار جزيئات الحمض النووي الفردية ثبتوا على السطح باستخدام المجهر الآلي مبائر المسح.
Abstract
مضان نقل الطاقة الرنين (الحنق) تم المجهري تستخدم على نطاق واسع لدراسة بنية وديناميكية الجزيئات البيولوجية ذات الاهتمام ، مثل الأحماض النووية والبروتينات. جزيء واحد الحنق (SM - الحنق) القياسات على جزيئات يجمد تصريح طويلة من الملاحظات من قبل النظام على نحو فعال على حد سواء حتى photobleach الأصباغ ، مما يؤدي إلى آثار في الوقت الذي يقدم تقريرا عن الديناميات الجزيئية البيولوجية مع طائفة واسعة من الجداول الزمنية من الألف إلى دقائق. لتسهيل اقتناء عدد كبير من التحليلات الإحصائية للآثار ، لا بد من آلية عملية وينبغي أن تكون البيئة عينة رقابة مشددة على مدار الزمن القياس بأكمله (~ 12 ساعة). ويتم إنجاز هذا باستخدام مجهر المسح الآلي مبائر التي تسمح للاستجواب الآلاف من الجزيئات واحدة بين عشية وضحاها ، وخلية ميكروفلويديك الذي يسمح للسيطرة على تبادل العازلة ، مع تقييد محتوى الاكسجين ويحافظ على درجة حرارة ثابتة طوال فترة القياس بأكملها. هنا نبين كيفية تجميع الجهاز ميكروفلويديك وكيفية تفعيل سطحه لتجميد الحمض النووي. ثم كيف لنا أن نفسر لإعداد عازلة لتحقيق أقصى قدر من صمود للضوء وعمرها fluorophores. أخيرا ، وتبين لنا الخطوات المتبعة في إعداد برنامج الإعداد لاقتناء الآلي من الوقت حل جزيء واحد من آثار الحنق جزيئات الحمض النووي.
Protocol
1 -- تركيب الخلية ميكروفلويديك
يرصد الخلية ميكروفلويديك بواسطة التفجير a منقوشة ، 2 مم ، polydimethylsiloxane (PDMS) القرص لزلة تغطية الكوارتز تنظيفها حديثا. PDMS القرص يحتوي على أربع غرف مستطيلة 30 ميكرولتر التي يتم الوصول إليها من خلال مدخل ومخرج الشعيرات الدموية مرنة متصلة العازلة خزان ومضخة الحقن ، على التوالي ، لتدفق تسيطر عليها العازلة. ويدعم خلية تدفق على الجانب الخلفي من خلال نافذة زجاجية وضعت على حامل الخلية مخصصة الصنع تحتوي على عنصر المياه المبردة الحرارية لتنظيم درجة الحرارة.
- لجعل PDMS منقوشة القرص ، مزيج 10 الاستومر سيليكون أجزاء القاعدة مع 1 جزء عامل علاج ، تخلط جيدا وتترك لمدة 1 ساعة التفريغ في فراغ.
- صب المزيج بلطف على الاستومر القالب الخلية ميكروفلويديك. في حالتنا ، فإن هذا هو 1 رقاقة السيليكون "مع أربعة شرائط (1x10 1x10 4 × 3 × 300 ميكرون) مصنوعة من مقاومة للضوء سلبية. اترك هذا لعلاج على طبق ساخن في 70 درجة مئوية لمدة ساعتين.
- قشر بعناية القرص PDMS شفي من العفن باستخدام شفرة حلاقة. فتيل القرص على زجاج نافذة 1 ''(التي تحتوي على 8 × 2 ملم القطر قبل حفر ثقوب في كلا طرفي القنوات) بواسطة البلازما المؤكسدة كلا السطوح لمدة 30 ثانية. صهر زجاج النوافذ على الجانب المسطح من القرص PDMS (الجانب لا يحتوي على قنوات).
- إدراج 2 بوصة طويلة أنابيب مرنة السيليكا تنصهر الشعرية من خلال ثقب في كل نافذة من الزجاج حتى يصل إلى القناة. قد ادخال ابرة أولا ثم التالية مع الشعرية تسهيل هذه العملية. اغلاق النافذة الزجاجية الثقوب باستخدام علاج سريع الصب السيليكون مركب مثل كويك الصب.
- شطف القنوات مع الايثانول والمياه ، والبلازما تنشيط الخلايا جنبا إلى جنب مع تنظيفها حديثا ، 1 بوصة دائرية زلة تغطية الكوارتز لمدة 30 ثانية. نقترح التنظيف باستخدام هذه زلة تغطية البيرانا *. فتيل زلة تغطية إلى جانب الخلية التي تحتوي على القنوات ، وختم الغرف.
- ترك الخلية تجميعها لعلاج بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
* سمكة البيرانا هو حل من H 2 O 2 و H 2 SO 4 في 1:2.5 النسب. زلات لتنظيف الغطاء ، تزج بهم في هجوم اسماك الضاري في 90 دقيقة لمدة 20 درجة مئوية.
2 -- تفعيل السطح لاستيقاف جزيء
لدراسات الحمض النووي ، وتجميد سطح أبسط نظام يتكون من طلاء الزجاج لأول مرة أو زلة تغطية الكوارتز مع ألبومين المصل البقري biotinylated (BSA) ، ثم مع streptavidin. هذا يسمح يجمد العينة biotinylated مع خصوصية عالية لعدة أيام في درجة حرارة الغرفة.
- توصيل أنابيب مرنة إلى الشعيرات الدموية للحقن العازلة من السهل استخدام المحاقن والإبر.
- حقن محلول 0.1 ملغ / مل من جيش صرب البوسنة في biotinylated العازلة A (10 ملي TRIS ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 8.0 ، 50 ملي كلوريد الصوديوم وتصفيتها باستخدام مرشحات 0.02 ميكرون) في القناة واحتضان ما لا يقل عن 30 دقيقة.
- تدفق ميكرولتر من 300-500 ألف العازلة لإزالة أي BSA مجانا biotinylated من القناة ، والحرص على عدم اعتراض أي فقاعات الهواء داخل الغرفة.
- حقن محلول 0.1 ملغ / مل من streptavidin العازلة في ألف واحتضان لمدة 15 دقيقة. ثم كرر الخطوة 3.
- التدفق من خلال حل 3-5 مساء من العينة biotinylated. إجراء فحص سطحي للتأكد من التغطية من الجزيئات الفلورسنت. إذا لزم الأمر ، وزيادة تركيز العينة للحصول على تغطية أفضل. احتضان لمدة 10 دقيقة ثم كرر الخطوة 3.
هي التي شنت على الخلية ميكروفلويديك مرحلة XY بمحركات السماح الخشنة (تصل إلى 25 ملم) الحركة باستخدام ترميز بصريا العاصمة المحركات ، وغرامة (1 نانومتر) الحركة باستخدام اثنين من حلقة مغلقة المحركات بيزو (Physik الرفيعة Instrumente طراز M - 014 أو ما شابه ذلك). ويمكن القيام بذلك إما قبل أو بعد تفعيل السطح لتجميد العينة.
3 -- اعداد الاحتياطي التصوير (IB)
وباء يتكون من نظام الأكسجين الأنزيمية نظافتها وفاكهه تقضي الثلاثي ، مثل Trolox. منذ يتم مسح IB بين عشية وضحاها من خلال باستمرار ، ينبغي إعداد ما لا يقل عن 10 مل مقدما.
- تحضير 10 مل من 0.8 ٪ ث / ت مد الجلوكوز ، على الأقل 35 مم TRIS - 8.0 درجة الحموضة حمض الهيدروكلوريك و 50 ملي مول كلوريد الصوديوم في الماء منزوع الأيونات. ارتفاع تركيز العازلة مهم لسببين : Trolox حل سوف يحمض الحل ، وردود الفعل الأنزيمية وأيضا انخفاض الرقم الهيدروجيني من الحل مع مرور الوقت. ويمكن هذا الحل منذ مدة صلاحية طويلة يمكن تخزينها كحل الأسهم.
- 5 ملغ من حل Trolox في المنطقة العازلة على استعداد في الخطوة 1 من vortexing لبضع دقائق ثم 10 دقيقة ليهز>. Trolox غير قابلة للذوبان في الماء جدا عند pH> 7 ، لذلك لا تتعجل هذه الخطوة. مرشح الحل باستخدام ميكرومتر 0.2 التصفية وترك فراغ في التفريغ لمدة 10 دقيقة.
- إعداد "gloxy" حل عن طريق خلط الأنزيمية 60 ميكرولتر wateص ، 20 ميكرولتر من العازلة 5X A ، 20 ميكرولتر من الكاتلاز ، 1 أوكسيديز الجلوكوز ملغ و 100 ميكرولتر من 10 ملغ / مل جيش صرب البوسنة. تصفية الحل باستخدام جهاز للطرد المركزي 0.22 ميكرون التصفية.
- المزيج برفق العازلة من الخطوة 2 مع الحل "gloxy" من الخطوة 3 تجنب تشكيل فقاعات الهواء.
- تدفق IB عبر القناة بمعدل ثابت من 5 ميكرولتر / دقيقة باستخدام مضخة الحقن الميكانيكية للسيطرة على معدل التدفق. فقاعة غاز الأرجون في المكمن IB لمنع الأكسجين في الغلاف الجوي من إعادة حل في المنطقة العازلة.
يتم التحكم في مسح السطح ، وتوطين جزيء واقتناء واحدة يتتبع كثافة الجزيء بواسطة برنامج LABVIEW التي تسمح الآلي جمع البيانات 1. البرنامج بمسح 20x20 2 ميكرومتر في المناطق القرار ميكرومتر 0.2 ، وذلك بنسبة 0.1 ميكرون / مللي. تتم معالجة البيانات على الفور إلى العائد كثافة المرجحة لجميع المواقع بكسل فوق التهم الخلفية. حالما يتم العثور على جزيئات يجمد ، فهي انتقلت تسجل واحدا تلو الآخر في حجم وكثافة مبائر من الجهات المانحة وfluorophore متقبل بوصفها وظيفة من الوقت حتى كلا photobleach fluorophores. مبرمجة ثم مرحلة للانتقال إلى أصل 100 ميكرون الجديدة بعيدا ، ويتم تكرار عملية المسح.
4 -- نتائج الممثل
وفيما يلي بعض الصور التي تبين الخلية ميكروفلويديك تجميعها قبل التنشيط السطحية وبعد أن شنت على استعداد لتجميد المجهر الجزيء. إذا تم تنشيط قناة بنجاح ، يجب أن تفحص السطح تكون مشابهة لتفحص يصور أدناه تبين انبعاث الصبغة المانحة (الخضراء) ومتقبل (الأحمر) بعد الإثارة مباشرة من الجهات المانحة. يتم نقل هذه الجزيئات واحدا تلو الآخر في حجم التحقيق وسجلت مضان بمرور الوقت حتى كلا photobleach الأصباغ ، كما هو موضح في آثار جزيء واحد. ويمكن من آثار مثل هذه واحدة الحصول على الكفاءة التي يبلغ الحنق على الفصل المانحين متقبل لحظية ، والذي بدوره يستخدم لاستكشاف هيكل وديناميكية الجزيئات البيولوجية ذات الاهتمام.
الشكل 1 : الخلية ميكروفلويديك مع أربع قنوات ، ولكل منها مدخل / مخرج الشعيرات الدموية. الرجاء انقر هنا لرؤية نسخة أكبر من الرقم 1.
الشكل 2 : الخلية التي شنت على استعداد لإجراء قياسات المجهر. الرجاء انقر هنا لرؤية نسخة أكبر من الشكل 2.
الشكل 3 : الإعداد لSM - الحنق القياسات. الرجاء انقر هنا لرؤية نسخة أكبر من الرقم 3.
أرقام 4 و 5 : قناة الأحمر والأخضر لمسح سطح جزيئات يجمد الحنق متحمس مع ليزر خضراء. الرجاء انقر هنا لرؤية نسخة أكبر من الرقم 4 ، أو الشكل 5 .
ارقام 6 و 7 و 8 و 9 : مسارات كثافة المانحة (الخضراء) ومتقبل (الحمراء) fluorophores المسمى لجزيء DNA 8 و 10 و 16 و 18 basepairs إربا. الرجاء انقر هنا لرؤية نسخة أكبر من الرقم 6 ، 7 الشكل ، الرقم 8 ، أو الشكل 9 .
Discussion
على الرغم من أنه تم تحسين البروتوكول أعلاه لنظامنا معينة ومحددة لاختيار من الأصباغ (TMR وATTO647N) ، فإنه ليست بأي حال ثبت الأسلوب فقط. في الآونة الأخيرة ، وظهر نظام بديل الأكسجين الكسح التي تتكون من حمض protocatechuic (PCA) / protocatechuate 3 ،4 - دي أكسيجيناز (PCD) لزيادة صمود للضوء من الأصباغ معينة 4. وبالمثل ، يمكن استخدام الثلاثي دولة أخرى مثل quenchers المركابتويثانول - β (BME) بدلا من Trolox ، رغم أن هذه قد لا تدوم طويلا قمع وامض بعض الأصباغ ، في 5 Cy5 معينة.
على الرغم من الشلل عبر ألبومين البيوتين streptavidin - biotinylated المصل البقري (BSA) هو الخيار المفضل للدراسات الأحماض النووية ، هي مناسبة أفضل البولي ايثيلين جلايكول (PEG) المغلفة السطحية للدراسات من البروتينات لأنها غير محددة يمنع التصاق 1. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام الفرعي حيود محدودة الحجم إلى الحويصلات تغليف جزيء حيوي من الاهتمام في الحالات التي يمكن أن تتأثر بها التفاعلات السطحية 6.
في هذه المقالة قد اعتدنا على إعداد مبائر مجهزة photodiodes الانهيار السيليكون للحصول على آثار كثافة مضان. هذا البروتوكول يعمل بشكل جيد على قدم المساواة مع توتال الداخلية المجاهر الإسفار التأمل (TIRF) مجهزة بكاميرات CCD. بغض النظر عن استخدام المجهر ، SM - الحنق يمكن الابلاغ عن القرارات المكانية يقترب من انجستروم عندما يتم تصحيحها بشكل صحيح إشارة المانحة ومتقبل 7.
Acknowledgments
نشكر تشاندران Sabanayagam لمساعدته في تطوير النظام ، جوشوا إيديل للحصول على المشورة بشأن تصميم الجهاز ميكروفلويديك والموظفين في معهد رولاند في جامعة هارفارد لقطع الآلات من الإعداد. نعترف مناقشات مفيدة مع أعضاء مجموعة ميلر في معهد رولاند وفي جامعة بوسطن ، وأعضاء فريق T. ها 's في UIUC للحصول على معلومات مفيدة. أخيرا ، ونحن نقدر الدعم المالي من مؤسسة العلوم الوطنية (PHY - 0701207) والمعهد الوطني للصحة (GM075893).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fused silica capillary tubing | Polymicro Technologies | TSP150375 | |
| Fused silica cover slip | Esco Products | R425000 | |
| Tubing | Diba Industries | ||
| Biotinylated BSA | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9085 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 0021122 | |
| Sylgard 184 Elastomer Kit | Dow Corning | 3097366-1004 | Silicone Elastomer Kit |
| Trolox | Aldrich | 238813 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C3155 | |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Kwik-Cast Sealant | World Precision Instruments, Inc. | Kwik-Cast | Silicone Casting Compound |
References
- Selvin, P. R., Ha, T. Single-Molecule Techniques, a Laboratory Manual. CSHL Press. , (2008).
- Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. High-throughput scanning confocal microscope for single molecule analysis. Applied Pys. Letters. , 84-87 (2004).
- Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. Using Fluorescence resonance energy transfer to measure distances along individual DNA molecules: Corrections due to nonideal transfer. J. Chem. Phys. 122, 61103-61105 (2004).
- Echeverra, A., Aitken, C., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments. Biophysical Journal. 94, 1826-1835 (2008).
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
- Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G., Puglisi, J. D. Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy. J. Phys. Chem. 105, 12165-12170 (2001).
- Di Fiori, N., Meller, A. Article in preparation. , Forthcoming.
