Summary
हम इस लेख में वर्णन है कि हम कैसे प्राप्त व्यक्ति के डीएनए एक स्वचालित स्कैनिंग confocal खुर्दबीन का उपयोग सतह पर स्थिर अणुओं से निशान झल्लाहट.
Abstract
प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) माइक्रोस्कोपी व्यापक रूप से किया गया है करने के लिए संरचना और nucleic एसिड और प्रोटीन के रूप में, ब्याज की जैविक अणुओं की गतिशीलता का अध्ययन किया. एकल अणु माप (एस.एम. झल्लाहट -) immobilized अणुओं पर झल्लाहट की लंबी टिप्पणियों परमिट प्रणाली प्रभावी ढंग से दोनों रंजक समय निशान में photobleach के परिणामस्वरूप जब तक कि biomolecular गतिशीलता पर मिनट मिसे से timescales के एक व्यापक रेंज के साथ रिपोर्ट. सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए निशान की बड़ी संख्या के अधिग्रहण को सुविधाजनक बनाने के लिए, प्रक्रिया और स्वचालित किया जाना चाहिए नमूना पर्यावरण कसकर पूरे माप समय (~ 12 घंटे) पर नियंत्रित किया जाना चाहिए. यह एक स्वचालित स्कैनिंग confocal खुर्दबीन है कि एकल अणुओं के हजारों की पूछताछ रातोंरात की अनुमति देता है, और एक microfluidic सेल है कि बफर के नियंत्रित विनिमय परमिट सीमित ऑक्सीजन सामग्री के साथ और पूरे मापने की अवधि भर में एक निरंतर तापमान बनाए रखता है है का उपयोग कर निपुण है. यहां हम बताते हैं कैसे microfluidic युक्ति इकट्ठा करने के लिए और कैसे डीएनए स्थिरीकरण के लिए इसकी सतह को सक्रिय करने के लिए. फिर हम की व्याख्या कैसे एक बफर तैयार photostability और fluorophores के जीवनकाल को अधिकतम करने के लिए. अंत में, हम दिखाने के लिए समय हल एकल अणु के स्वचालित अधिग्रहण के लिए सेटअप तैयार करने में शामिल कदम डीएनए अणु के निशान झल्लाहट.
Protocol
1 - microfluidic सेल कोडांतरण
microfluidic सेल fusing के द्वारा किया जाता है एक नमूनों, 2 मिमी मोटी, एक हौसले से साफ क्वार्ट्ज कवर पर्ची polydimethylsiloxane डिस्क (PDMS). PDMS डिस्क चार 30 μl आयताकार कि कक्षों Inlet और आउटलेट लचीला capillaries के एक बफर जलाशय और एक सिरिंज पंप से जुड़ा है, क्रमशः बफर नियंत्रित प्रवाह के लिए, के द्वारा पहुँचा रहे हैं शामिल हैं. प्रवाह सेल अपने पीछे की ओर एक खिड़की के कांच से समर्थित है और कस्टम निर्मित एक सेल धारक thermoelectric तत्व के तापमान को विनियमित करने के लिए ठंडा पानी युक्त पर रखा है.
- नमूनों PDMS डिस्क बनाने के लिए, भाग 1 इलाज एजेंट के साथ 10 भागों सिलिकॉन elastomer आधार मिश्रण, मिश्रण अच्छी तरह से और छोड़ निर्वात में 1 घंटे के लिए degassing.
- धीरे microfluidic सेल ढालना पर elastomer मिश्रण डालना. हमारे मामले में, यह एक 1 "चार (1x10 4 एक्स 3 1x10 x 300 सुक्ष्ममापी) स्ट्रिप्स नकारात्मक photoresist से बनाया के साथ सिलिकॉन वफ़र है इस छोड़ दो 70 में एक गर्म थाली पर इलाज डिग्री सेल्सियस दो घंटे के लिए..
- ध्यान से ठीक एक उस्तरा ब्लेड का उपयोग मोल्ड से PDMS डिस्क छील. 1''प्लाज्मा द्वारा कांच (चैनलों के दोनों सिरों पर 8 x 2 मिमी व्यास पूर्व drilled छेद युक्त) खिड़की के 30 सेकंड के लिए दोनों सतहों ऑक्सीकरण पर डिस्क फ्यूज. PDMS डिस्क के फ्लैट पक्ष पर शीशे की खिड़कियां (युक्त चैनल नहीं पक्ष) फ्यूज.
- प्रत्येक गिलास खिड़की के छेद के माध्यम से एक 2 इंच लंबी लचीला जुड़े सिलिका केशिका टयूबिंग डालें जब तक यह चैनल तक पहुँचता है. पहले एक सुई डालने तब और केशिका के साथ निम्नलिखित इस प्रक्रिया को सुविधाजनक हो सकता है. कांच की खिड़की एक तेजी से इलाज सिलिकॉन कास्टिंग Kwik-कास्ट और क्रू के रूप में ऐसे यौगिक का उपयोग छेद सील.
- इथेनॉल और पानी के साथ चैनलों कुल्ला, और एक हौसले से साफ, 1 इंच परिपत्र 30 सेकंड के लिए क्वार्ट्ज कवर पर्ची के साथ सेल के साथ प्लाज्मा सक्रिय. हम इस कवर पर्ची सफाई सुझाव है कि पिरान्हा का उपयोग *. चैनल वाले कक्ष के पक्ष को कवर पर्ची फ्यूज, कक्षों सील.
- कमरे के तापमान पर रातोंरात इलाज इकट्ठे सेल छोड़ो.
* पिरान्हा एच 2 2 हे और एच 2 अतः 1:2.5 अनुपात में 4 की एक समाधान है. कवर फिसल जाता है साफ करने के लिए, उन्हें पिरान्हा में 90 ° 20 मिनट के लिए सी विसर्जित.
2 - अणु स्थिरीकरण के लिए सतह को सक्रिय करें
न्यूक्लिक एसिड के अध्ययन के लिए, सरल सतह स्थिरीकरण योजना कोटिंग के पहले एक गिलास या biotinylated गोजातीय सीरम (BSA) streptavidin साथ albumin और तब के साथ क्वार्ट्ज कवर पर्ची होते हैं. यह biotinylated नमूना दिनों के लिए कमरे के तापमान पर उच्च विशिष्टता के साथ स्थिर करने की अनुमति देता है.
- Capillaries को आसान बफर इंजेक्शन के लिए एक सिरिंज और सुई का उपयोग लचीला टयूबिंग कनेक्ट.
- 0.1 मिलीग्राम / बफर में biotinylated BSA के मिलीलीटर की एक समाधान इंजेक्षन एक (10 Tris - एचसीएल मिमी, 8.0 पीएच, 50 मिमी NaCl, 0.02 सुक्ष्ममापी फिल्टर का उपयोग करने के लिए फ़िल्टर) और कम से कम 30 मिनट के लिए चैनल सेते में.
- फ्लो बफर 300-500 μl एक चैनल से किसी भी मुक्त biotinylated BSA को हटाने के लिए, कक्ष के अंदर किसी भी हवाई बुलबुले नहीं जाल सावधान जा रहा है.
- 0.1 के समाधान इंजेक्षन मिलीग्राम / बफर में streptavidin मिली एक और 15 मिनट के लिए सेते हैं. फिर चरण 3 दोहराएँ.
- Biotinylated नमूना के 3-5 बजे समाधान के माध्यम से प्रवाह. फ्लोरोसेंट अणु के कवरेज की जाँच करने के लिए एक सतह स्कैन प्रदर्शन. यदि आवश्यक हो, नमूना एकाग्रता बढ़ाने के लिए बेहतर कवरेज प्राप्त. 10 मिनट के लिए सेते हैं और चरण 3 दोहराएँ.
microfluidic सेल एक motorized xy मोटे (25 मिमी) ऑप्टिकली इनकोडिंग डीसी मोटर्स का उपयोग गति की अनुमति मंच पर मुहिम शुरू की है, और ठीक गति (एनएम 1) दो बंद लूप piezo actuators का उपयोग (फ्य्सिक Instrumente मॉडल एम 014 या समान). यह या तो पहले या नमूना स्थिरीकरण के लिए सतह को सक्रिय करने के बाद किया जा सकता है है.
3 - इमेजिंग बफर (आईबी) की तैयारी
आईबी एक enzymatic ऑक्सीजन सफाई प्रणाली और जैसे Trolox triplet पेय, के होते हैं. चूंकि आईबी के माध्यम से लगातार रातोंरात प्लावित है, कम से कम 10 मिलीलीटर अग्रिम में तैयार किया जाना चाहिए.
- 0.8% की 10 मिलीलीटर w / ध् डी - ग्लूकोज, कम से कम 35 मिमी Tris - एचसीएल पीएच 8.0 और 50 मिमी विआयनीकृत पानी में NaCl तैयार. बफर के उच्च एकाग्रता दो कारणों के लिए महत्वपूर्ण है: भंग Trolox समाधान अम्ल करना, और enzymatic प्रतिक्रिया भी समय पर समाधान के पीएच कम होगी. चूंकि यह समाधान एक लंबी शैल्फ जीवन है यह एक शेयर समाधान के रूप में संग्रहीत किया जा सकता है.
- मिनट की एक जोड़ी के लिए vortexing और फिर> 10 मिनट के लिए मिलाते द्वारा चरण 1 में तैयार बफर में Trolox के 5 मिलीग्राम भंग. Trolox> 7 पीएच पर बहुत से पानी में घुलनशील नहीं है, तो इस कदम को भीड़ नहीं है. का उपयोग एक 0.2 सुक्ष्ममापी फिल्टर और 10 मिनट के लिए शून्य में degassing छोड़ समाधान फ़िल्टर.
- 60 μl wate मिश्रण द्वारा "gloxy" एंजाइमी समाधान तैयारr, 5X बफर ए, catalase के 20 μl 1 मिलीग्राम, ग्लूकोज oxidase और 10 के 100 μl BSA मिलीग्राम / एमएल के 20 μl. 0.22 सुक्ष्ममापी अपकेंद्रित्र फिल्टर का उपयोग कर समाधान फ़िल्टर.
- धीरे चरण 2 से चरण 3 हवाई बुलबुले के गठन से बचने से gloxy "समाधान के साथ बफर मिश्रण.
- आईबी में 5 μl / मिनट के एक निरंतर दर एक यांत्रिक सिरिंज पंप का उपयोग कर प्रवाह दर को नियंत्रित करने के लिए चैनल के माध्यम से प्रवाह. बुलबुला आईबी जलाशय में आर्गन गैस बफर में फिर - भंग से वायुमंडलीय ऑक्सीजन को रोकने.
सतह स्कैनिंग, अणु और एकल अणु तीव्रता निशान का स्थानीयकरण अधिग्रहण एक LabVIEW प्रोग्राम है कि स्वचालित डेटा संग्रह 1 परमिट द्वारा नियंत्रित किया जाता है. कार्यक्रम 0.1 सुक्ष्ममापी / एमएस की दर के साथ 0.2 सुक्ष्ममापी संकल्प 20x20 सुक्ष्ममापी 2 क्षेत्रों, स्कैन . डेटा तुरंत तीव्रता भारित पृष्ठभूमि मायने रखता है ऊपर के सभी पिक्सल के स्थानों उपज संसाधित है. एक बार स्थिर अणुओं पाए जाते हैं, वे चले गए हैं एक confocal मात्रा और दाता और स्वीकर्ता fluorophore की तीव्रता में दोनों fluorophores photobleach जब तक समय के एक समारोह के रूप में दर्ज कर रहे हैं. मंच के लिए एक नया 100 सुक्ष्ममापी दूर मूल के लिए कदम तो क्रमादेशित है, और स्कैनिंग की प्रक्रिया को दोहराया है.
4 - प्रतिनिधि परिणाम
नीचे कुछ सतह सक्रियण से पहले और अणु स्थिरीकरण के लिए तैयार खुर्दबीन पर घुड़सवार के बाद इकट्ठे microfluidic सेल दिखा छवियाँ हैं. यदि चैनल को सफलतापूर्वक सक्रिय है, सतह स्कैन प्रत्यक्ष दाता उत्तेजना के बाद दाता (हरा) डाई और स्वीकर्ता (लाल) के उत्सर्जन दिखा नीचे दर्शाया स्कैन के समान होना चाहिए. इन अणुओं जांच मात्रा में स्थानांतरित कर रहे हैं और प्रतिदीप्ति दोनों रंजक photobleach जब तक समय पर दर्ज है, के रूप में एक अणु निशान में दिखाया गया है. इन तरह एक निशान से दक्षता झल्लाहट जो तात्कालिक दाता स्वीकर्ता जुदाई, जो बारी में और जैविक हित के अणुओं की संरचना और गतिशीलता का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है पर जानकारी प्राप्त कर सकते हैं.
चित्रा 1: चार चैनलों के साथ Microfluidic सेल, इनलेट / आउटलेट capillaries के साथ प्रत्येक . कृपया यहाँ क्लिक करें संख्या 1 के एक बड़ा संस्करण देख.
चित्रा 2: माप के लिए तैयार खुर्दबीन पर मुहिम शुरू की सेल. कृपया यहाँ क्लिक करें आंकड़ा 2 का एक बड़ा संस्करण देख.
चित्रा 3: माप के लिए सेटअप एस.एम. - झल्लाहट. कृपया यहाँ क्लिक करें आंकड़ा 3 का एक बड़ा संस्करण देख.
4 आंकड़े और 5: immobilized की सतह स्कैन के लाल और हरे चैनल हरे रंग की लेजर के साथ उत्तेजित अणुओं झल्लाहट . का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें कृपया आंकड़ा 4 या 5 आंकड़ा .
आंकड़े 6, 7, 8, और 9: दाता की तीव्रता trajectories (हरा) और (लाल) स्वीकर्ता एक डीएनए अणु 8, 10, 16 और 18 basepairs अलग लेबल fluorophores. का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें कृपया आंकड़ा 6 , 7 आंकड़ा आंकड़ा 8 , या 9 आंकड़ा .
Discussion
हालांकि ऊपर प्रोटोकॉल हमारे विशेष प्रणाली के लिए और रंजक (TMR और ATTO647N) का एक विशिष्ट पसंद के लिए ऑप्टिमाइज़ किया गया है, यह ही साबित विधि का मतलब है. हाल ही में, एक वैकल्पिक ऑक्सीजन सफाई protocatechuic एसिड (पीसीए) / protocatechuate 3 ,4-dioxygenase (PCD) से मिलकर प्रणाली निश्चित 4 रंगों के photostability वृद्धि दिखाया गया था. इसी तरह, β mercaptoethanol (BME) जैसे अन्य triplet राज्य quenchers Trolox के बजाय इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि इन Cy5 विशेष 5 में लंबे समय तक चलने वाले कुछ रंगों के निमिष, दबा नहीं सकता.
हालांकि बायोटिन-streptavidin biotinylated गोजातीय सीरम albumin (BSA) के माध्यम से स्थिरीकरण nucleic एसिड के अध्ययन के लिए पसंदीदा विकल्प है, एक polyethylene (खूंटी) glycol लेपित सतह बेहतर प्रोटीन के अध्ययन के लिए अनुकूल है क्योंकि यह गैर विशिष्ट आसंजन एक रोकता है. इसके अतिरिक्त, उप विवर्तन सीमित आकार vesicles के मामलों में जहां यह सतह 6 बातचीत द्वारा प्रभावित किया जा सकता है है में रुचि के biomolecule encapsulate करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
इस अनुच्छेद में हम एक confocal सिलिकॉन हिमस्खलन photodiodes के साथ सुसज्जित प्रतिदीप्ति तीव्रता निशान अधिग्रहण सेटअप इस्तेमाल किया है. इस प्रोटोकॉल कुल आंतरिक परावर्तन (TIRF) प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी सीसीडी कैमरों के साथ सुसज्जित के साथ समान रूप से अच्छी तरह से काम करता है. माइक्रोस्कोपी के बावजूद इस्तेमाल किया है, स्थानिक संकल्प Angstrom आ जब दाता और स्वीकर्ता संकेत ठीक 7 सही हैं पर सूचित कर सकते हैं एस.एम. - झल्लाहट.
Acknowledgments
हम चंद्रन Sabanayagam प्रणाली, microfluidic युक्ति डिजाइन और सेटअप की मशीनिंग भागों के लिए हार्वर्ड विश्वविद्यालय में Rowland संस्थान में कर्मचारियों पर सलाह के लिए यहोशू Edel विकसित करने में उनकी मदद के लिए धन्यवाद. हम Rowland संस्थान और बोस्टन विश्वविद्यालय में Meller समूह के सदस्यों के साथ उपयोगी विचार - विमर्श, और टी. हा 'समूह के सदस्यों UIUC में उपयोगी जानकारी के लिए स्वीकार करते हैं. अंत में, हम राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (बनावट 0,701,207) और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (GM075893) से वित्तीय सहायता की सराहना करते हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fused silica capillary tubing | Polymicro Technologies | TSP150375 | |
| Fused silica cover slip | Esco Products | R425000 | |
| Tubing | Diba Industries | ||
| Biotinylated BSA | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9085 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 0021122 | |
| Sylgard 184 Elastomer Kit | Dow Corning | 3097366-1004 | Silicone Elastomer Kit |
| Trolox | Aldrich | 238813 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C3155 | |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Kwik-Cast Sealant | World Precision Instruments, Inc. | Kwik-Cast | Silicone Casting Compound |
References
- Selvin, P. R., Ha, T. Single-Molecule Techniques, a Laboratory Manual. CSHL Press. , (2008).
- Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. High-throughput scanning confocal microscope for single molecule analysis. Applied Pys. Letters. , 84-87 (2004).
- Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. Using Fluorescence resonance energy transfer to measure distances along individual DNA molecules: Corrections due to nonideal transfer. J. Chem. Phys. 122, 61103-61105 (2004).
- Echeverra, A., Aitken, C., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments. Biophysical Journal. 94, 1826-1835 (2008).
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
- Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G., Puglisi, J. D. Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy. J. Phys. Chem. 105, 12165-12170 (2001).
- Di Fiori, N., Meller, A. Article in preparation. , Forthcoming.
