Summary
Dans cet article, nous décrivons comment nous obtenons FRET traces de molécules individuelles d'ADN immobilisés sur une surface en utilisant un microscope confocal à balayage automatisé.
Abstract
Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopie a été largement utilisée pour étudier la structure et la dynamique des molécules d'intérêt biologique, tels que les acides nucléiques et des protéines. Seule molécule de FRET (sm-FRET) des mesures sur molécules immobilisées permettent des observations à long du système de manière efficace tant que les deux colorants photobleach-résultant en temps des traces de ce rapport sur la dynamique biomoléculaire avec un large éventail d'échelles de temps allant de quelques millisecondes à quelques minutes. Pour faciliter l'acquisition d'un grand nombre de traces pour les analyses statistiques, le processus doit être automatisé et l'environnement de l'échantillon doit être étroitement contrôlé sur le temps de mesure entière (~ 12 heures). Ceci est accompli en utilisant un microscope confocal à balayage automatisé qui permet à l'interrogatoire de milliers de molécules uniques pendant la nuit, et une cellule microfluidique qui permet l'échange contrôlé de tampon, avec la teneur en oxygène limité et maintient une température constante pendant toute la période de mesure. Ici, nous montrons comment assembler le dispositif microfluidique et comment activer sa surface pour l'immobilisation d'ADN. Ensuite, nous expliquent comment préparer un tampon pour maximiser la durée de vie et de photostabilité des fluorophores. Enfin, nous montrons les étapes impliquées dans la préparation de l'installation pour l'acquisition automatisée de résolution dans le temps seule molécule FRET traces de molécules d'ADN.
Protocol
1 - Assemblage de la cellule microfluidique
La cellule microfluidique est fait par fusion d'un motif, 2 mm d'épaisseur, polydiméthylsiloxane (PDMS) de disque à une lamelle de quartz fraîchement nettoyée. Le disque contient quatre PDMS 30 pl chambres rectangulaires qui sont accessibles par entrée et de sortie flexibles capillaires relié à un réservoir tampon et une pompe seringue, respectivement, pour les flux contrôlé de tampon. La cellule d'écoulement est pris en charge sur sa face arrière par une fenêtre en verre et placé sur un support de cuve sur-mesure contenant une eau refroidie élément thermoélectrique pour réguler la température.
- Pour rendre le modelé PDMS disque, mélange de base 10 pièces en élastomère silicone avec une partie de durcisseur, bien mélanger et laisser le dégazage pendant 1 heure dans le vide.
- Verser délicatement le mélange sur le moule en élastomère cellulaire microfluidique. Dans notre cas, il s'agit d'une plaquette de silicium 1 "avec quatre bandes (1x10 1x10 4 x 3 x 300 um) fabriqués à partir de résine photosensible négative. Laissez ce pour guérir sur une plaque chaude à 70 ° C pendant deux heures.
- Retirer délicatement le disque guéri PDMS à partir du moule en utilisant une lame de rasoir. Fusible du disque sur une fenêtre 1 verre''(contenant 8 x 2 mm de diamètre trous pré-percés aux deux extrémités des canaux) par plasma oxydant deux surfaces pendant 30 secondes. Fusible les fenêtres de verre sur le côté plat du disque PDMS (le côté ne contenant pas les canaux).
- Insérez un 2-pouce de long tube flexible capillaire en silice fondue à travers le trou de chaque fenêtre en verre jusqu'à ce qu'il atteigne le canal. Insertion d'une aiguille d'abord, puis la suite avec le capillaire peut faciliter ce processus. Scellez les trous fenêtre en verre en utilisant un moyen rapide de cure coulée de silicone comme les Kwik-Cast.
- Rincez les canaux avec de l'éthanol et d'eau, et le plasma-activer la cellule avec un fraîchement nettoyée, 1 pouce lamelle circulaire de quartz pendant 30 secondes. Nous vous suggérons de nettoyer ce lamelle en utilisant piranha *. Fusible la lamelle sur le côté de la cellule contenant les canaux, étanchéité des chambres.
- Laisser la cellule assemblée pour guérir une nuit à température ambiante.
* Piranha est une solution de H 2 O 2 et H 2 SO 4 dans des proportions 1:2.5. Pour nettoyer les lamelles, les plonger dans le piranha à 90 ° C pendant 20 min.
2 - Activer la surface pour l'immobilisation molécule
Pour les études d'acides nucléiques, le schéma simple de surface immobilisation consiste à enduire d'abord un verre ou lamelle de quartz avec biotinylé albumine sérique bovine (BSA), puis avec streptavidine. Cela permet à l'échantillon biotinylé à être immobilisé avec une haute spécificité pour les jours à température ambiante.
- Relier les tubes flexibles pour les capillaires pour l'injection de tampon facile en utilisant une seringue et une aiguille.
- Injecter une solution de 0,1 mg / ml de BSA biotinylé dans le tampon A (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 50 mM, filtrés en utilisant des filtres 0,02 um) dans le canal et incuber pendant au moins 30 min.
- Débit de 300 à 500 pi de tampon A à enlever toute la BSA biotinylé libre à partir du canal, en faisant attention à ne pas coincer les bulles d'air dans la chambre.
- Injecter une solution de 0,1 mg / ml de streptavidine dans le tampon A et incuber pendant 15 min. Ensuite, répétez l'étape 3.
- L'écoulement à travers une solution 3-5 pM de l'échantillon biotinylé. Effectuer une analyse de surface pour vérifier la couverture des molécules fluorescentes. Si nécessaire, augmenter la concentration de l'échantillon afin d'obtenir une meilleure couverture. Incuber pendant 10 min et répétez l'étape 3.
La cellule microfluidique est monté sur une platine motorisée xy permettant grossier (jusqu'à 25 mm) en utilisant le mouvement optiquement encodée moteurs à courant continu, et de fin (1 nm) en utilisant deux mouvements en boucle fermée actionneurs piézoélectriques (Physik Instrumente modèle M-014 ou similaire). Cela peut être fait avant ou après l'activation de la surface pour l'immobilisation de l'échantillon.
3 - Préparer le tampon d'imagerie (IB)
L'IB est constitué d'un système d'oxygène enzymatique balayage et un extincteur triplet, comme Trolox. Depuis l'IB est rincé en permanence grâce à la nuit, au moins 10 ml doit être préparé à l'avance.
- Préparer 10 ml de 0,8% p / v de D-glucose, au moins 35 mM Tris-HCl pH 8,0 et NaCl 50 mM dans de l'eau déminéralisée. La plus forte concentration de tampon est important pour deux raisons: Trolox dissolution sera acidifier la solution, et la réaction enzymatique va aussi abaisser le pH de la solution au fil du temps. Depuis cette solution a une longue durée de vie peut être stocké sous forme de solution stock.
- Dissolvez 5 mg de Trolox dans le tampon préparé à l'étape 1 par vortex pendant quelques minutes puis agiter pendant> 10 min. Trolox n'est pas très soluble dans l'eau à pH> 7, donc ne vous précipitez pas cette étape. Filtrer la solution en utilisant un filtre de 0,2 um et de laisser le dégazage sous vide pendant 10 minutes.
- Préparer le «gloxy" solution enzymatique en mélangeant 60 ul water, 20 pl de tampon 5X A, 20 pl de la catalase, glucose oxydase 1 mg et 100 ul de 10 mg / ml de BSA. Filtrer la solution en utilisant un filtre de 0,22 um centrifugeuse.
- Mélanger délicatement le tampon de l'étape 2 avec le "gloxy« solution de l'étape 3 en évitant la formation de bulles d'air.
- Débit de l'IB à travers le canal à un taux constant de 5 pl / min en utilisant une pompe seringue mécanique pour contrôler le débit. Bubble gaz argon dans le réservoir pour empêcher IB oxygène atmosphérique de re-dissoudre dans la mémoire tampon.
Le balayage de surface, la localisation et l'acquisition de molécules simples traces d'intensité molécule est contrôlé par un programme LabVIEW qui permet la collecte automatisée de données 1. Le programme scanne 20x20 um deux zones à une résolution de 0,2 um, avec un taux de 0,1 um / ms. Les données sont immédiatement traitées pour produire l'intensité pondéré emplacements de tous les pixels au-dessus des comptages de fond. Une fois les molécules immobilisées sont trouvés, ils sont déplacés un par un dans le volume confocal et les intensités des donateurs et fluorophore accepteur sont enregistrés en fonction du temps jusqu'à deux photobleach fluorophores. La scène est alors programmé pour passer à une nouvelle origine 100 um loin, et le processus de numérisation est répété.
4 - Les résultats représentatifs
Voici quelques images montrant la cellule microfluidique assemblés avant l'activation de surface et après être monté sur le microscope prêt pour l'immobilisation molécule. Si le canal est activé avec succès, balaye la surface devrait être similaire à l'analyse décrite ci-dessous montrant d'émission du donneur (vert) de teinture et de l'accepteur (rouge) après l'excitation directe des bailleurs de fonds. Ces molécules sont déplacés un par un dans le volume de sondage et la fluorescence est enregistrée au cours du temps jusqu'à ce que les colorants photobleach, comme le montre les traces molécule unique. De traces comme celles-ci on peut obtenir l'efficacité de FRET qui informe sur les instantanés donneur-accepteur de séparation, qui à son tour, est utilisé pour explorer la structure et la dynamique des molécules d'intérêt biologique.
Figure 1: cellule microfluidique avec quatre canaux, chacun avec entrée / sortie des capillaires. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version agrandie de la figure 1.
Figure 2: Cellule montée sur le microscope prêt pour les mesures. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version agrandie de la figure 2.
Figure 3: Configuration pour SM-mesures de FRET. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version agrandie de la figure 3.
Figures 4 et 5: canal rouge et vert d'une analyse de surface des molécules excitées immobilisé FRET avec le laser vert. S'il vous plaît cliquer pour voir une version agrandie de la figure 4 , ou la figure 5 .
Les figures 6, 7, 8 et 9: Intensité des trajectoires des bailleurs de fonds (en vert) et accepteur (rouge) fluorophores étiqueté à une molécule d'ADN 8, 10, 16 et 18 paires de bases d'intervalle. S'il vous plaît cliquer pour voir une version agrandie de la figure 6 , figure 7 , figure 8 , ou 9 chiffres .
Discussion
Bien que le protocole ci-dessus a été optimisé pour notre système particulier et pour un choix spécifique de teintures (TMR et ATTO647N), il n'est en aucun cas la seule méthode prouvée. Récemment, un système d'oxygène alternatives balayage constitué d'acide protocatéchique (PCA) / protocatéchuate-3 ,4-dioxygénase (PCD) a été montré pour augmenter la photostabilité de certains colorants 4. De même, les autres triplet-état quenchers tels que β-mercaptoéthanol (BME) peut être utilisé à la place de Trolox, bien que ceux-ci pourraient ne pas supprimer la longue durée de clignoter de certains colorants, en particulier Cy5 5.
Bien immobilisation par biotine-streptavidine biotinylé albumine sérique bovine (BSA) est le choix préféré pour les études des acides nucléiques, un polyéthylène glycol (PEG) à revêtement de surface est mieux adapté pour les études des protéines car elle empêche les non-adhérence spécifique 1. En outre, les sous-diffraction limitée vésicules taille peut être utilisé pour encapsuler des biomolécules d'intérêt dans les cas où elle peut être affectée par les interactions de surface 6.
Dans cet article, nous avons utilisé une configuration confocale équipé photodiodes à avalanche en silicone pour acquérir les traces d'intensité de fluorescence. Ce protocole fonctionne aussi bien avec Total Internal Reflection Fluorescence microscopes (FRBR) équipé de caméras CCD. Indépendamment de la microscopie à utiliser, sm-FRET peut informer sur les résolutions spatiales approcher l'angström lorsque le donateur et le signal de l'accepteur sont correctement corrigés 7.
Acknowledgments
Nous remercions Chandran Sabanayagam pour son aide dans le développement du système, Joshua Edel pour des conseils sur la conception du dispositif microfluidique et le personnel de l'Institut de Rowland à l'Université Harvard pour l'usinage de pièces de l'installation. Nous reconnaissons les discussions utiles avec les membres du groupe de Meller à l'Institut Rowland et l'Université de Boston, et les membres du groupe T. Ha 's à l'UIUC pour des renseignements utiles. Enfin, nous apprécions le soutien financier de la National Science Foundation (PHY-0701207) et l'Institut national de la santé (GM075893).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fused silica capillary tubing | Polymicro Technologies | TSP150375 | |
| Fused silica cover slip | Esco Products | R425000 | |
| Tubing | Diba Industries | ||
| Biotinylated BSA | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9085 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 0021122 | |
| Sylgard 184 Elastomer Kit | Dow Corning | 3097366-1004 | Silicone Elastomer Kit |
| Trolox | Aldrich | 238813 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C3155 | |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Kwik-Cast Sealant | World Precision Instruments, Inc. | Kwik-Cast | Silicone Casting Compound |
References
- Selvin, P. R., Ha, T. Single-Molecule Techniques, a Laboratory Manual. CSHL Press. , (2008).
- Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. High-throughput scanning confocal microscope for single molecule analysis. Applied Pys. Letters. , 84-87 (2004).
- Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. Using Fluorescence resonance energy transfer to measure distances along individual DNA molecules: Corrections due to nonideal transfer. J. Chem. Phys. 122, 61103-61105 (2004).
- Echeverra, A., Aitken, C., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments. Biophysical Journal. 94, 1826-1835 (2008).
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
- Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G., Puglisi, J. D. Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy. J. Phys. Chem. 105, 12165-12170 (2001).
- Di Fiori, N., Meller, A. Article in preparation. , Forthcoming.
