Larvale ringklierdissectie: isolatie van ontwikkelingsedocriene organen van Drosophila

Overview

Deze video beschrijft de Drosophila ringklier, een complexe endocriene structuur die belangrijk is voor biosynthese en afscheiding van ecdysteroïden en andere hormonen. Het aanbevolen protocol demonstreert de dissectie, fixatie en immunostaining.

Protocol

Dit protocol is een fragment uit Imura et al., Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2017).

OPMERKING: Het algemene schema van protocollen is weergegeven in figuur 1.

1. De dissectie van de larvale ringklier (RG)

OPMERKING: In D. melanogaster, dat behoort tot cyclorrhaphous Diptera, bevindt de PG zich in een samengesteld endocriene orgaan dat de ringklier wordt genoemd (RG, figuur 2D). Omdat het onhaalbaar is dat de PG chirurgisch wordt gescheiden van andere soorten cellen (later besproken), is een praktisch doel om een intacte, onbeschadigde RG te isoleren door dissectie.

1. Bereiding van larven in de juiste ontwikkelingsstadia
   OPMERKING: Om de ontwikkelingsstadia van D. melanogaster-larven te synchroniseren, is het noodzakelijk om eieren binnen een smal tijdvenster te verzamelen en larven op de juiste tijdstippen te verzamelen.
   1. Verzamel eieren gedurende 2 uur op een agarplaat met druivensap bij 25 °C.
   2. Verzamel nieuw uitgekomen^1e instar larven onder een ontledende microscoop met tang en breng ze over naar een kleine flacon met gepureerd standaard gist / maïsmeel vliegvoer.
      OPMERKING: De leeftijd van larven wordt vertegenwoordigd door "uren na het leggen van eieren (hAEL)", "uren na het uitkomen (hAH)", of "uren na L3 ecdysis (hAL3E)".
   3. Verzamel op het juiste moment de geënsceneerde larven met een plastic wegwerplus om ongewenst letsel te voorkomen. Om een verschil in ontwikkelingsprogressie van de 3^rd instar-larven te minimaliseren, verzamelt u de^2e instar-larven bij 70 hAEL (48 hAH) en laat u ze in intervallen van 2 uur vervellen. Verzamel vervolgens de 3^rd instar-larven binnen 2 uur na de L3-ecdysis; deze procedure geeft 0-2 hAL3E larven.
   4. Breng de geënsceneerde larven over in een schaal gevuld met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
   5. Spoel de larven af met PBS om restvoedsel uit het lichaam te verwijderen.
2. Grove dissectie van larven onder een ontledende microscoop
   1. Houd de mondhaak van een larve met een tang vast. Snijd het larvale lichaam aan de voorste een derde van de lichaamslengte met behulp van een microschaar.
   2. Houd het gesneden uiteinde van het voorste larvale lichaam vast met één paar tangen. Duw met behulp van het andere paar tangen de punt van het hoofd voorzichtig naar de binnenkant van het lichaam; deze procedure draait het larvale lichaam binnenstebuiten.
      OPMERKING: Deze stap kan worden overgeslagen voor de dissectie van 1^st instar larven.
   3. Herhaal stap 1.2.1-1.2.2 met extra larven gedurende 5-10 min.
      OPMERKING: Het aantal larven moet gelijk zijn aan of kleiner zijn dan 20 om tijd te besparen voor dissectie.
3. Fixatie en kleuring van weefsel met immunohistochie
   1. Doe de voorste een derde van de larvale lichamen (stap 1.2.2) in een 1,5 ml microbuis gevuld met 500 μL de fix-oplossing (4% paraformaldehyde in PBS). Bevestig minder dan 20 monsters tegelijk, anders kan PBS dat aan de vaste monsters is bevestigd, een ongunstige verdunning van het fixatief veroorzaken. Verwijder voor filetdissectie een druppel PBS en voeg vervolgens een druppel fix-oplossing toe.
      OPMERKING: Voor fixoplossing mag 3,7% formaldehyde of 4% paraformaldehyde worden gebruikt.
   2. Incubeer de ontlede weefsels in de fixoplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT) of als alternatief gedurende 2 uur bij 4 °C.
   3. Vervang de fixoplossing door 500 μL PBS en spoel de monsters snel 3 keer af. Was de monsters met 500 μL 0,3% PBT (PBS + 0,3% octylfenol ethoxylaat) gedurende 15 minuten op een rocker bij RT. Verwijder voor filetdissectie de insectenpennen en breng de monsters over in een microtube van 1,5 ml.
      OPMERKING: Om de doorlaatbaarheid van antilichamen in weefsels te verhogen, worden de monsters behandeld met 500 μL 2,0% PBT gedurende 1-2 uur op een rocker bij RT.
   4. Vervang PBT door 500 μL blokkeeroplossing (2% runderserumalbumine in PBT). Incubeer de monsters gedurende 1,5 uur op een rocker bij RT.
   5. Vervang de blokkeringsoplossing door 50 μL de primaire antilichaamoplossing, d.w.z. antilichamen verdund in de blokkeringsoplossing.
   6. Incubeer de monsters 's nachts op een schommel bij 4 °C.
   7. Vervang de primaire antilichaamoplossing door 500 μL 0,3% PBT en spoel de monsters snel 5 keer af. Was de monsters 3 keer met 500 μL 0,3% PBT gedurende elk 15 minuten op een rocker bij RT.
   8. Vervang 0,3% PBT door 50 μL de secundaire antilichaamoplossing (met kleurstof geconjugeerde antilichamen verdund in de blokkerende oplossing). Voor nucleaire kleuring wordt 0,5 μL 4',6-diamidino-2-fenylindole (DAPI, 0,1 mg/ml stamoplossing) toegevoegd aan 50 μL oplossing. Incubeer de monsters gedurende 2 uur op een rocker bij RT of als alternatief bij 4 °C 's nachts.
      OPMERKING: Bewaar de monsters in het donker.
   9. Vervang de antilichaamoplossing door 500 μL 0,3% PBT en spoel 5 keer. Was de monsters 3 keer met 500 μL 0,3% PBT gedurende elk 15 minuten bij RT.
4. Fijne dissectie van het hersen-RG-complex met de PG en montage
   1. Gebruik een wegwerppipet om de immunostained monsters over te brengen naar een schaal gevuld met 0,3% PBT.
      OPMERKING: Om onhandige bellen tijdens dissectie en montage te voorkomen, kan 0,3% PBT worden vervangen door PBS.
   2. Houd onder een ontleedmicroscoop de nagelriem of mondhaak vast met één tang. Snijd met behulp van een 27 G-naald die als "mes" aan een spuit van 1 ml is bevestigd, de voorste punt van de slokdarm en oogschijven om het hersen-RG-oogschijfcomplex van de lichaamssparel te verwijderen.
   3. Scheid de slokdarm en darm van het hersen-RG-oogschijfcomplex met een tang. Aangezien de slokdarm door de hersenen boven het ventrale zenuwkoord (VNC) gaat, trekt u de darm naar de achterste kant.
      OPMERKING: Om extra fantasierijke schijven uit de monsters te verwijderen, snijdt u de verbindingen tussen de hersenen, oogschijven en beenschijven met een naaldmes.
   4. Herhaal de stappen 1.4.1-1.4.4 voor andere monsters.
      OPMERKING: Om te voorkomen dat weefselresten aan de monsters blijven plakken, breng elk voltooid monster over naar een andere schone schaal gevuld met 0,3% PBT of PBS.
   5. Breng de monsters over naar het midden van een schone glazen glijbaan met een micropipet.
      OPMERKING: Voor 2^e of 3^rd instar larven moet het uiteinde van een micropipet tip worden afgekapt met een scheermesje.
   6. Onder een ontleedmicroscoop, lijn individuele monsters uit met hun dorsale kant naar boven met behulp van een tang.
      OPMERKING: De RG bevindt zich aan de dorsale kant van de hersenen (Figuur 2A). Deze uitlijning vergemakkelijkt de specificatie van individuele monsters tijdens beeldvorming.
   7. Kantel een glazen schuif en veeg zoveel mogelijk overtollige PBT af. Plaats een druppel montagereagens op een kant van de glijbaan. Plaats de rand van een afdekslip aan de andere kant van de druppel en plaats de afdekslip langzaam met een tang op de monsters.
      OPMERKING: Deze procedure voorkomt dat de monsters zich buiten de afdekstrook bewegen.
   8. Bewaar de monsters bij 4 °C. Bewaar de monsters in het donker.

Representative Results

Figuur 1: Het algemene schema van protocollen. Twee verschillende dissectiemethoden zijn van toepassing op larven en volwassen vrouwtjes, afhankelijk van het doel van de experimenten. De montagemethoden worden ook ontworpen op basis van monsteromstandigheden. Fixatie-, kleurings- en beeldvormingstechnieken zijn in principe gebruikelijk voor alle monsters. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2: Visualisatie van de PG en de PG-projecterende Neuronen. (A en B) Het hersenringkliercomplex (RG) van de wild-type 3^rd instar larve. In (B) wordt de PG omlijnd door stippellijnen. De filamenteuze structuur tussen de hersenen en de RG is de luchtpijp. (C-E) De innervatie van de PG werd gevisualiseerd met mCD8::GFP aangedreven door GMR45C06-GAL4 in FlyLight collectie. De PG- en GFP-positieve neuronen werden geëtiketteerd met respectievelijk anti-Sro-antilichamen (magenta) en anti-GFP-antilichamen (groen). Het fluorescerende beeld wordt samengevoegd met het beeld van het verzonden licht om de omtrek van weefsels op te geven. In (D) worden de PG, de corpora allata (CA) en de corpora cardiaca (CC) geïllustreerd. De PG-projecterende neuronen zijn prominenter aanwezig in het high-power beeld met 40X objectieve lens (pijlen in E) dan het low-power beeld met 10X objectieve lens (C). Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Egg collection
tissue culture dish (55 mm)	AS ONE	1-8549-02	for grape-juice agar plates
collection cup	HIKARI KAGAKU
yeast paste	Oriental dry yeast, Tokyo
100% grape juice	Welch Food Inc.
rearing larvae
small vials (12ml, 40×23.5 mm, PS)	SARSTEDT	58.487
disposable loop	AS ONE	6-488-01
standard fly food			The recipe is on the website of Bloomington stock center.
Dissection
dissecting microscope	Carl Zeiss	Stemi 2000-C
dissecting microscope	Leica	S8 AP0
tissue culture dish (35 x 10 mm, non-treated)	IWAKI	1000-035
Sylgard	TORAY		coarting silicon inside dishes
Terumo needle (27G, 0.40 x 19 mm)	TERUMO	NN-2719S	A "knife" to cut the tissue
forceps, Inox, #5	Dumont, Switzerland
insect pin (0.18 mm in diameter)	Shiga Brand		for fillet dissection
micro scissors	NATSUME SEISAKUSHO CO LTD.	MB-50-10
Fixation
ultrapure water	Merck Millipore
phosphate buffered saline (PBS)
Formaldehyde	Nacalai tesque	16222-65
Paraformaldehyde	Nacalai tesque	02890-45
Triton-X100	Nacalai tesque	35501-15
microtubes (1.5 ml)	INA OPTIKA	CF-0150
Incubation
As one swist mixer TM-300 (rocker)	As one	TM-300	rocker
Bovine Serum Albumin	SIGMA	9048-46-8
Primary antibody
anti-Sro (guinea pig), 1:1000
anti-GFP (rabbit), 1:1000	Molecular Probes	A6455	Shimada-Niwa ans Niwa, 2014
anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100	Nakarai tesque	04363-66
anti-5HT (rabbit), 1:500	SIGMA	S5545
anti-Hts 1B1 (mouse)	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	1B1
anti-DE-cadherin (rat), 1:20	DSHB	DCAD2
anti-nc82 (mouse), 1:50	DSHB	nc82
Secondary antibody
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A-11008
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A-11001
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate	Life Technologies	A-11081
Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate	Life Technologies	A-21435
Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidin	Life Technologies	A-22283
Mounting reagents
Micro slide glass	Matsunami Glass Ind.,Ltd.	SS7213
Square microscope cover glass	Matsunami Glass Ind.,Ltd.	C218181
FluorSave reagent (Mounting reagent)	Calbiochem	345789
Transfer pipette 1 ml (Disposable dropper)	WATSON	5660-222-1S
Fly stocks
w; GMR45C06-GAL4			from Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260)
UAS–GFP; UAS–mCD8::GFP			gifts from K. Ito, The University of Tokyo.
w[1118]
w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP
w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4			Li, H. H. (2014) and Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A. (2010)
w; UAS-mCD8::GFP			from Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188)
yw;; nSyb-GAL4			from Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941)