लार्वा रिंग ग्रंथि विच्छेदन: ड्रोसोफिला से विकासात्मक एंडोक्राइन अंगों का अलगाव

Overview

यह वीडियो ड्रोसोफिला रिंग ग्रंथि का वर्णन करता है, जो बायोसिंथेसिस और ईसीडीिस्टेरॉयड और अन्य हार्मोन के स्राव के लिए महत्वपूर्ण एक जटिल एंडोक्राइन संरचना है। विशेष रुप से प्रदर्शित प्रोटोकॉल इसके विच्छेदन, निर्धारण और इम्यूनोस्टेपिंग को दर्शाता है।

Protocol

यह प्रोटोकॉल इमरा एट अलसे एक अंश है, स्टेरॉयड के अंगों और उनके इंटरैक्टिव अंगों को फ्रूट फ्लाई ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर, जे विस एक्सप्रेस(2017) में इम्यूनोस्टेटिंग के साथ उनके इंटरैक्टिव अंगों की कल्पना करने के लिए प्रोटोकॉल है।

नोट: प्रोटोकॉल की समग्र योजना चित्र 1में दिखाई गई है ।

1. लार्वा रिंग ग्रंथि (आरजी) का विच्छेदन

नोट: डी मेलनोगेस्टरमें, जो साइक्लोरहफस डिप्टेरा से संबंधित है, पीजी एक समग्र एंडोक्राइन अंग के भीतर है जिसे रिंग ग्रंथि (आरजी, चित्रा 2डी)कहा जाता है। चूंकि यह अव्यवहार्य है कि पीजी शल्य चिकित्सा कोशिकाओं के अन्य प्रकार से अलग है (बाद में चर्चा), एक व्यावहारिक लक्ष्य विच्छेदन द्वारा एक बरकरार, अक्षतिग्रस्त आरजी को अलग करने के लिए है।

1. उचित विकास के चरणों में लार्वा तैयार करना
   नोट: डी मेलनोगास्टर लार्वा के विकास के चरणों को सिंक्रोनाइज करने के लिए, एक संकीर्ण समय खिड़की के भीतर अंडे एकत्र करना और उचित समय पर लार्वा एकत्र करना आवश्यक है।
   1. 25 डिग्री सेल्सियस पर अंगूर-रस आगर प्लेट पर 2 घंटे के लिए अंडे ले लीजिए।
   2. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत नए रची 1^सेंट इंस्टार लार्वा को संदंश के साथ इकट्ठा करें और उन्हें मैश किए हुए मानक खमीर/कॉर्नमील फ्लाई फूड युक्त एक छोटी शीशी में स्थानांतरित करें।
      नोट: लार्वा की उम्र का प्रतिनिधित्व "अंडे बिछाने के बाद के घंटे (एचईएल)", "हैच (एचएचएएच) के बाद के घंटे", या "एल 3 ईसीडीसिस (एचएएल 3ईई) के बाद के घंटे" द्वारा दर्शाया जाता है।
   3. उचित समय बिंदु पर, अवांछनीय चोट से बचने के लिए एक डिस्पोजेबल प्लास्टिक लूप के साथ मंचन लार्वा एकत्र करें। 3^वें इंस्टार लार्वा की विकासात्मक प्रगति में अंतर को कम करने के लिए, 70 एचईएल⁽⁴⁸ एचएचएच) पर 2 nd इंस्टार लार्वा एकत्र करें और उन्हें 2 घंटे के अंतराल में मोल्ट करने की अनुमति दें। फिर, एल 3 ईसीडीसिस के बाद 2 घंटे के भीतर 3^आरडी इंस्टार लार्वा एकत्र करें; यह प्रक्रिया 0-2 hAL3E लार्वा देती है।
   4. मंचन लार्वा को फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) से भरे पकवान में स्थानांतरित करें।
   5. शरीर से अवशिष्ट भोजन को हटाने के लिए पीबीएस के साथ लार्वा कुल्ला।
2. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत लार्वा का मोटा विच्छेदन
   1. संदंश के साथ एक लार्वा के मुंह हुक पकड़ो। सूक्ष्म कैंची का उपयोग कर शरीर की लंबाई के एक तिहाई पूर्वकाल में लार्वा शरीर को तोड़ें।
   2. एक जोड़ी संदंश के साथ पूर्वकाल लार्वा शरीर के कट एंड को पकड़ो। संदंश की अन्य जोड़ी का उपयोग करके, धीरे-धीरे सिर की नोक को शरीर के अंदर की ओर धकेलें; यह प्रक्रिया लार्वा शरीर को अंदर ले जाती है।
      नोट: इस चरण को 1 सेंट इंस्टार लार्वा के विच्छेदन के लिए छोड़ दिया जा^सकता है।
   3. 5-10 मिनट के लिए अतिरिक्त लार्वा के साथ 1.2.1-1.2.2 दोहराएं।
      नोट: विच्छेदन के लिए समय बचाने के लिए लार्वा की संख्या 20 के बराबर या उससे कम होनी चाहिए।
3. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के साथ ऊतक का निर्धारण और धुंधला
   1. पूर्वकाल को लार्वा निकायों (चरण 1.2.2) में 500 μL फिक्स समाधान (पीबीएस में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड) से भरे 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब में रखें। एक बार में 20 से कम नमूनों को ठीक करें, अन्यथा निश्चित नमूनों से जुड़े पीबीएस फिक्सेटिव के प्रतिकूल कमजोर पड़ने का कारण बन सकते हैं। पट्टिका विच्छेदन के लिए, पीबीएस की एक बूंद निकालें और फिर फिक्स समाधान की एक बूंद जोड़ें।
      नोट: समाधान तय करने के लिए, या तो 3.7% फॉर्मलडिहाइड या 4% पैराफॉर्मलडिहाइड का उपयोग किया जा सकता है।
   2. कमरे के तापमान (आरटी) पर 30 मिनट के लिए या वैकल्पिक रूप से 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए फिक्स समाधान में विच्छेदित ऊतकों को इनक्यूबेट करें।
   3. फिक्स समाधान को 500 माइक्रोन पीबीएस के साथ बदलें और 3 बार नमूनों को जल्दी से कुल्लाएं। आरटी में एक रॉकर पर 15 मिनट के लिए 500 माइक्रोन 0.3% पीबीटी (पीबीएस + 0.3% ऑक्टाइलफेनॉल एथॉक्सीलेट) के साथ नमूनों को धोएं। पट्टिका विच्छेदन के लिए, कीट पिन निकालें और नमूनों को 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब में स्थानांतरित करें।
      नोट: ऊतकों में एंटीबॉडी की पारिम्यता बढ़ाने के लिए, नमूनों को आरटी में एक घुमाव पर 1-2 घंटे के लिए 500 माइक्रोन 2.0% पीबीटी के साथ इलाज किया जाता है।
   4. पीबीटी को 500 माइक्रोन ब्लॉकिंग सॉल्यूशन (पीबीटी में 2% गोजातीय सीरम एल्बुमिन) से बदलें। आरटी में एक घुमाव पर १.५ घंटे के लिए नमूनों को इनक्यूबेट ।
   5. अवरुद्ध समाधान को 50 माइक्रोन प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के साथ बदलें, यानी अवरुद्ध समाधान में पतला एंटीबॉडी।
   6. 4 डिग्री सेल्सियस पर एक घुमाव पर रात भर नमूनों को इनक्यूबेट करें।
   7. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान को 500 माइक्रोन 0.3% पीबीटी से बदलें और 5 बार नमूनों को जल्दी से कुल्लाएं। आरटी में एक झूली कुरसी पर 15 मिनट प्रत्येक के लिए 500 माइक्रोल 0.3% पीबीटी के साथ 3 बार नमूनों को धोएं।
   8. 0.3% पीबीटी को 50 माइक्रोन के साथ बदलें माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान (अवरुद्ध समाधान में पतला डाई-संयुग्मित एंटीबॉडी)। परमाणु धुंधला करने के लिए, 0.5 माइक्रोन 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनीलिंडल (DAPI, 0.1 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक समाधान) 50 माइक्रोन समाधान में जोड़ा जाता है। आरटी में 2 घंटे के लिए एक घुमाव पर या वैकल्पिक रूप से रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को इनक्यूबेट करें।
      नोट: नमूनों को अंधेरे में रखें।
   9. एंटीबॉडी समाधान को 500 माइक्रोन 0.3% पीबीटी से बदलें और 5 बार कुल्ला करें। आरटी में प्रत्येक 15 मिनट के लिए 500 माइक्रोल 0.3% पीबीटी के साथ 3 बार नमूनों को धोएं।
4. मस्तिष्क-आरजी परिसर के ठीक विच्छेदन स्नातकोत्तर और बढ़ते युक्त
   1. इम्यूनो दाग नमूनों को 0.3% पीबीटी से भरे पकवान में स्थानांतरित करने के लिए डिस्पोजेबल पिपेट का उपयोग करें।
      नोट: विच्छेदन और बढ़ते के दौरान असुविधाजनक बुलबुले से बचने के लिए, 0.3% पीबीटी को पीबीएस के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
   2. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, एक जोड़ी संदंश के साथ क्यूटिकल या मुंह हुक पकड़ें। एक "चाकू" के रूप में एक 1 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ी 27 जी सुई का उपयोग करना, शरीर छीती से मस्तिष्क-आरजी-आई डिस्क परिसर को हटाने के लिए घेघा और आंख डिस्क के पूर्वकाल टिप काटें।
   3. घेघा और आंत को ब्रेन-आरजी-आई डिस्क कॉम्प्लेक्स से संदंश के साथ अलग करें। चूंकि घेघा वेंट्रल तंत्रिका कॉर्ड (वीएनसी) के ऊपर मस्तिष्क से गुजरता है, इसलिए पेट को पीछे की ओर खींचें।
      नोट: नमूनों से अतिरिक्त कल्पनाशील डिस्क को हटाने के लिए, एक सुई चाकू के साथ मस्तिष्क, आंख डिस्क, और पैर डिस्क के बीच कनेक्शन काटें।
   4. अन्य नमूनों के लिए चरण 1.4.1-1.4.4 दोहराएं।
      नोट: ऊतक मलबे को नमूनों से चिपके रहने से रोकने के लिए, प्रत्येक पूर्ण नमूने को 0.3% पीबीटी या पीबीएस से भरे एक अलग साफ पकवान में स्थानांतरित करें।
   5. नमूनों को माइक्रोपिपेट के साथ एक साफ ग्लास स्लाइड के केंद्र में स्थानांतरित करें।
      नोट: 2^{या 3 स्टार} लार्वा के लिए, माइक्रोपिपेट टिप के अंत को रेजर ब्लेड के साथ काटा जाना चाहिए।
   6. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, संदंश का उपयोग करके अपने पृष्ठीय पक्ष के साथ व्यक्तिगत नमूनों को संरेखित करें।
      नोट: आरजी मस्तिष्क के पृष्ठीय पक्ष(चित्रा 2ए)पर स्थित है। यह संरेखण इमेजिंग के दौरान अलग-अलग नमूनों के विनिर्देश की सुविधा प्रदान करता है।
   7. एक गिलास स्लाइड झुकाएं और जितना संभव हो उतना अतिरिक्त पीबीटी मिटा दें। स्लाइड के एक तरफ बढ़ते अभिकर्ण की एक बूंद रखो। ड्रॉप के दूसरी तरफ से कवर स्लिप का किनारा रखें और सीप के साथ धीरे-धीरे नमूनों पर कवर स्लिप डाल दें।
      नोट: यह प्रक्रिया नमूनों को कवर स्लिप के बाहर जाने से रोकती है।
   8. नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। नमूनों को अंधेरे में रखें।

Representative Results

चित्रा 1: प्रोटोकॉल की समग्र योजना। प्रयोगों के उद्देश्य के आधार पर लार्वा और वयस्क महिलाओं पर दो अलग-अलग विच्छेदन विधियां लागू होती हैं। बढ़ते तरीकों को भी नमूना शर्तों के अनुसार तैयार किया जाता है। फिक्सेशन, धुंधला, और इमेजिंग तकनीक मूल रूप से सभी नमूनों के लिए आम हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 2: स्नातकोत्तर और स्नातकोत्तर के दृश्य-न्यूरॉन्स पेश । (ए और बी)वाइल्ड टाइप 3^{इंस्टार} लार्वा का ब्रेन-रिंग ग्लैंड (आरजी) कॉम्प्लेक्स । (ख)में, पीजी बिंदीदार लाइनों द्वारा उल्लिखित है । मस्तिष्क और आरजी के बीच तंतु संरचना श्वासनली है। (C-E) पीजी के इनरवेशन को फ्लाईलाइट संग्रह में जीएमआर 45सी06-GAL4 द्वारा संचालित mCD8::GFP के साथ कल्पना की गई थी। पीजी और जीएफपी पॉजिटिव न्यूरॉन्स को क्रमशः एंटी-एसरो एंटीबॉडी (मैजेंटा) और एंटी-जीएफपी एंटीबॉडी (ग्रीन) के साथ लेबल किया गया था । फ्लोरोसेंट छवि ऊतकों की रूपरेखा निर्दिष्ट करने के लिए संचारित प्रकाश छवि के साथ विलय कर दिया है। (डी)में पीजी, निगमायुक्त एलेटा (सीए) और निगमायुक्त कार्डिका (सीसी) सचित्र हैं। पीजी-प्रोजेक्टिंग न्यूरॉन्स 10X ऑब्जेक्टिव लेंस (सी) के साथ कम शक्ति वाली छवि की तुलना में 40X ऑब्जेक्टिव लेंस (ई में तीर) के साथ उच्च शक्ति वाली छवि में अधिक प्रमुख हैं। स्केल बार = 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Egg collection
tissue culture dish (55 mm)	AS ONE	1-8549-02	for grape-juice agar plates
collection cup	HIKARI KAGAKU
yeast paste	Oriental dry yeast, Tokyo
100% grape juice	Welch Food Inc.
rearing larvae
small vials (12ml, 40×23.5 mm, PS)	SARSTEDT	58.487
disposable loop	AS ONE	6-488-01
standard fly food			The recipe is on the website of Bloomington stock center.
Dissection
dissecting microscope	Carl Zeiss	Stemi 2000-C
dissecting microscope	Leica	S8 AP0
tissue culture dish (35 x 10 mm, non-treated)	IWAKI	1000-035
Sylgard	TORAY		coarting silicon inside dishes
Terumo needle (27G, 0.40 x 19 mm)	TERUMO	NN-2719S	A "knife" to cut the tissue
forceps, Inox, #5	Dumont, Switzerland
insect pin (0.18 mm in diameter)	Shiga Brand		for fillet dissection
micro scissors	NATSUME SEISAKUSHO CO LTD.	MB-50-10
Fixation
ultrapure water	Merck Millipore
phosphate buffered saline (PBS)
Formaldehyde	Nacalai tesque	16222-65
Paraformaldehyde	Nacalai tesque	02890-45
Triton-X100	Nacalai tesque	35501-15
microtubes (1.5 ml)	INA OPTIKA	CF-0150
Incubation
As one swist mixer TM-300 (rocker)	As one	TM-300	rocker
Bovine Serum Albumin	SIGMA	9048-46-8
Primary antibody
anti-Sro (guinea pig), 1:1000
anti-GFP (rabbit), 1:1000	Molecular Probes	A6455	Shimada-Niwa ans Niwa, 2014
anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100	Nakarai tesque	04363-66
anti-5HT (rabbit), 1:500	SIGMA	S5545
anti-Hts 1B1 (mouse)	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	1B1
anti-DE-cadherin (rat), 1:20	DSHB	DCAD2
anti-nc82 (mouse), 1:50	DSHB	nc82
Secondary antibody
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A-11008
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A-11001
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate	Life Technologies	A-11081
Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate	Life Technologies	A-21435
Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidin	Life Technologies	A-22283
Mounting reagents
Micro slide glass	Matsunami Glass Ind.,Ltd.	SS7213
Square microscope cover glass	Matsunami Glass Ind.,Ltd.	C218181
FluorSave reagent (Mounting reagent)	Calbiochem	345789
Transfer pipette 1 ml (Disposable dropper)	WATSON	5660-222-1S
Fly stocks
w; GMR45C06-GAL4			from Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260)
UAS–GFP; UAS–mCD8::GFP			gifts from K. Ito, The University of Tokyo.
w[1118]
w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP
w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4			Li, H. H. (2014) and Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A. (2010)
w; UAS-mCD8::GFP			from Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188)
yw;; nSyb-GAL4			from Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941)