تشريح الغدة الحلقية اليرقات: عزل أجهزة الغدد الصماء التنموية من Drosophila

Overview

يصف هذا الفيديو الغدة الحلقية Drosophila ، وهي بنية معقدة للغدد الصماء مهمة لعملية التمثيل الحيوي وإفراز ecdysteroids والهرمونات الأخرى. يوضح البروتوكول المميز تشريحه وتثبيته وتشبعه بالمناعة.

Protocol

هذا البروتوكول هو مقتطف من Imura وآخرون., بروتوكولات لتصور أجهزة Steroidogenic وأعضائهم التفاعلية مع المناعة في ذبابة الفاكهة Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2017).

ملاحظة: يظهر المخطط العام للبروتوكولات في الشكل 1.

1. تشريح الغدة الحلقية اليرقات (RG)

ملاحظة: في D. melanogaster, الذي ينتمي إلى ديبتيرا سيكلورهافوس, PG داخل جهاز الغدد الصماء مركب يسمى الغدة الحلقية (RG, الشكل 2D). نظرا لأنه من غير المجدي فصل PG جراحيا عن أنواع أخرى من الخلايا (تمت مناقشته لاحقا) ، فإن الهدف العملي هو عزل RG سليم وغير تالف عن طريق التشريح.

1. إعداد اليرقات في مراحل النمو المناسبة
   ملاحظة: لمزامنة المراحل التنموية ليرقات D. melanogaster ، من الضروري جمع البيض في غضون فترة زمنية ضيقة وجمع اليرقات في الأوقات المناسبة.
   1. جمع البيض لمدة 2 ساعة على طبق أجار عصير العنب في 25 درجة مئوية.
   2. جمع حديثا فقست 1^st instar اليرقات تحت المجهر تشريح مع ملقط ونقلها إلى قارورة صغيرة تحتوي على الخميرة القياسية المهروسة / الذرة يطير الغذاء.
      ملاحظة: يتم تمثيل عمر اليرقات من خلال "ساعات بعد وضع البيض (hAEL)" أو "بعد ساعات من الفتحة (hAH)" أو "بعد ساعات من ال ecdysis L3 (hAL3E)".
   3. عند النقطة الزمنية المناسبة ، اجمع اليرقات المرحلية بحلقة بلاستيكية يمكن التخلص منها لتجنب الإصابة غير المرغوب فيها. لتقليل الفرق في التقدم التنموي ليرقات النجوم^{الثالثة الثالثة} ، اجمع^يرقات النجم الثاني عند 70 hAEL (48 hAH) والسماح لها بالملط على فترات 2 ساعة. ثم، جمع 3^rd يرقات نجمة في غضون 2 ساعة بعد ecdysis L3؛ يعطي هذا الإجراء يرقات hAL3E 0-2.
   4. نقل اليرقات المرحلية إلى طبق مليء بالمحلول الملحي العازل للفوسفات (PBS).
   5. شطف اليرقات مع برنامج تلفزيوني لإزالة المواد الغذائية المتبقية من الجسم.
2. تشريح خشن لليرقات تحت مجهر تشريح
   1. عقد هوك الفم من يرقة مع ملقط. قطع الجسم اليرقات في الجزء الأمامي ثلث طول الجسم باستخدام مقص صغير.
   2. عقد نهاية قطع الجسم اليرقات الأمامية مع زوج واحد من ملقط. باستخدام الزوج الآخر من ملقط, دفع بلطف غيض من الرأس نحو داخل الجسم; هذا الإجراء يحول جسم اليرقات من الداخل إلى الخارج.
      ملاحظة: يمكن تخطي هذه الخطوة لتشريح يرقات^{1 st} instar.
   3. كرر الخطوات 1.2.1-1.2.2 مع يرقات إضافية لمدة 5-10 دقائق.
      ملاحظة: يجب أن يكون عدد اليرقات مساويا أو أقل من 20 لتوفير الوقت للتشريح.
3. تثبيت وتلطيخ الأنسجة مع الكيمياء المناعية
   1. ضع الثلث الأمامي من أجسام اليرقات (الخطوة 1.2.2) في 1.5 مل من الأنابيب الدقيقة المملوءة ب 500 ميكرولتر من محلول الإصلاح (4٪ بارافورمالديهايد في PBS). إصلاح أقل من 20 عينات في وقت واحد، وإلا برنامج تلفزيوني تعلق على عينات ثابتة قد يسبب تخفيف غير مواتية من المثبتة. لتشريح فيليه، وإزالة قطرة من برنامج تلفزيوني ومن ثم إضافة قطرة من حل الإصلاح.
      ملاحظة: لحل الإصلاح، إما 3.7٪ الفورمالديهايد أو 4٪ بارافورمالديهايد يمكن استخدامها.
   2. احتضان الأنسجة تشريح في حل الإصلاح لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) أو بدلا من ذلك لمدة 2 ساعة في 4 درجة مئوية.
   3. استبدال حل الإصلاح مع برنامج تلفزيوني 500 ميكرولتر وشطف بسرعة العينات 3 مرات. غسل العينات مع 500 ميكرولتر 0.3٪ PBT (PBS + 0.3٪ أوكتيلفينول إيثوكسيلات) لمدة 15 دقيقة على الروك في RT. لتشريح فيليه، وإزالة دبابيس الحشرات ونقل العينات إلى 1.5 مل الأنابيب الدقيقة.
      ملاحظة: لزيادة نفاذية الأجسام المضادة في الأنسجة ، يتم التعامل مع العينات مع 500 ميكرولتر 2.0 ٪ PBT لمدة 1-2 ساعة على الروك في RT.
   4. استبدال PBT مع 500 ميكرولتر حل حجب (2٪ ألبوم مصل البقر في PBT). احتضان العينات لمدة 1.5 ساعة على الروك في RT.
   5. استبدل محلول الحجب ب 50 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأساسي، أي الأجسام المضادة المخففة في محلول الحجب.
   6. احتضان العينات بين عشية وضحاها على الروك في 4 درجة مئوية.
   7. استبدال الحل الأساسي للأجسام المضادة مع 500 ميكرولتر 0.3٪ PBT وشطف العينات بسرعة 5 مرات. غسل العينات 3 مرات مع 500 ميكرولتر 0.3٪ PBT لمدة 15 دقيقة لكل منهما على الروك في RT.
   8. استبدال 0.3٪ PBT مع 50 ميكرولتر حل الأجسام المضادة الثانوية (الأجسام المضادة المترافقة صبغ المخفف في حل حجب). بالنسبة للتلطيخ النووي ، يتم إضافة 0.5 ميكرولتر 4'، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI، 0.1 ملغم / مل محلول الأسهم) إلى محلول 50 ميكرولتر. احتضان العينات على الروك لمدة 2 ساعة في RT أو بدلا من ذلك في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
      ملاحظة: أبقي العينات في الظلام
   9. استبدال حل الأجسام المضادة مع 500 ميكرولتر 0.3٪ PBT وشطف 5 مرات. غسل العينات 3 مرات مع 500 ميكرولتر 0.3٪ PBT لمدة 15 دقيقة لكل منهما في RT.
4. تشريح غرامة من مجمع الدماغ RG التي تحتوي على PG وتصاعد
   1. استخدم ماصة يمكن التخلص منها لنقل العينات الملطخة بالمناعة إلى طبق مليء ب PBT بنسبة 0.3٪.
      ملاحظة: لتجنب فقاعات غير مريح أثناء تشريح وتصاعد, 0.3٪ يمكن استبدال PBT مع برنامج تلفزيوني.
   2. تحت مجهر تشريح، عقد ربط لطيف أو الفم مع زوج واحد من ملقط. باستخدام إبرة 27 G تعلق على حقنة 1 مل ك "سكين" ، وقطع الطرف الأمامي من المريء وأقراص العين لإزالة مجمع أقراص الدماغ RG العين من كتيكل الجسم.
   3. فصل المريء والأمعاء من مجمع أقراص الدماغ-RG-العين مع ملقط. منذ المريء يمر عبر الدماغ فوق الحبل العصبي البطني (VNC), سحب القناة الهضمية إلى الجانب الخلفي.
      ملاحظة: لإزالة أقراص تصويرية إضافية من العينات، اقطع الاتصالات بين الدماغ وأقراص العين وأقراص الساق بسكين إبرة.
   4. كرر الخطوات 1.4.1-1.4.4 لعينات أخرى.
      ملاحظة: لمنع حطام الأنسجة من الالتصاق بالعينات، قم بنقل كل عينة مكتملة إلى طبق نظيف مختلف مليء ب PBT أو PBS بنسبة 0.3٪.
   5. نقل العينات إلى وسط شريحة زجاجية نظيفة مع micropipette.
      ملاحظة: بالنسبة ليرقات^{النجمة الثانية} أو^{الثالثة} ، يجب اقتطاع نهاية طرف micropipette بشفرة حلاقة.
   6. تحت المجهر تشريح، محاذاة العينات الفردية مع الجانب الظهري حتى باستخدام ملقط.
      ملاحظة: يقع RG على الجانب الظهري من الدماغ (الشكل 2A). تسهل هذه المحاذاة مواصفات العينات الفردية أثناء التصوير.
   7. إمالة شريحة زجاجية ومسح أكبر قدر ممكن من PBT الزائدة. ضع قطرة من الكاشف المتصاعد على جانب من الشريحة. ضع حافة زلة غطاء من الجانب الآخر من قطرة ووضع الغطاء زلة على عينات ببطء مع ملقط.
      ملاحظة: يمنع هذا الإجراء العينات من التحرك خارج قسيمة الغطاء.
   8. تخزين العينات في 4 درجة مئوية. أبقي العينات في الظلام

Representative Results

الشكل 1: المخطط العام للبروتوكولات. تنطبق طريقتان متميزتان للتشريح على اليرقات والإناث البالغات ، اعتمادا على الغرض من التجارب. كما يتم تصميم أساليب التركيب وفقا لظروف العينة. التثبيت، تلطيخ، وتقنيات التصوير هي في الأساس شائعة لجميع العينات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: تصور PG والخلايا العصبية PG-إسقاط. (A و B) مجمع الغدة الحلقية الدماغية (RG) من النوع البري 3^rd instar larva. في (B)، يتم تحديد PG بواسطة خطوط منقطة. البنية الخيطية بين الدماغ وRG هي القصبة الهوائية. (C-E) تم تصور غمر PG مع mCD8::GFP مدفوعا GMR45C06-GAL4 في مجموعة FlyLight. وصفت الخلايا العصبية PG وGFP إيجابية مع الأجسام المضادة Sro (أرجواني) والأجسام المضادة لGFP المضادة (الأخضر)، على التوالي. يتم دمج الصورة الفلورية مع صورة الضوء المرسلة لتحديد مخطط الأنسجة. في (D)، وPG، و allata كوربورا (كاليفورنيا) وcorpora القلب (CC) ويتضح. الخلايا العصبية PG-إسقاط هي أكثر بروزا في صورة عالية الطاقة مع عدسة الهدف 40X (السهام في E) من صورة منخفضة الطاقة مع عدسة الهدف 10X (C). شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Egg collection
tissue culture dish (55 mm)	AS ONE	1-8549-02	for grape-juice agar plates
collection cup	HIKARI KAGAKU
yeast paste	Oriental dry yeast, Tokyo
100% grape juice	Welch Food Inc.
rearing larvae
small vials (12ml, 40×23.5 mm, PS)	SARSTEDT	58.487
disposable loop	AS ONE	6-488-01
standard fly food			The recipe is on the website of Bloomington stock center.
Dissection
dissecting microscope	Carl Zeiss	Stemi 2000-C
dissecting microscope	Leica	S8 AP0
tissue culture dish (35 x 10 mm, non-treated)	IWAKI	1000-035
Sylgard	TORAY		coarting silicon inside dishes
Terumo needle (27G, 0.40 x 19 mm)	TERUMO	NN-2719S	A "knife" to cut the tissue
forceps, Inox, #5	Dumont, Switzerland
insect pin (0.18 mm in diameter)	Shiga Brand		for fillet dissection
micro scissors	NATSUME SEISAKUSHO CO LTD.	MB-50-10
Fixation
ultrapure water	Merck Millipore
phosphate buffered saline (PBS)
Formaldehyde	Nacalai tesque	16222-65
Paraformaldehyde	Nacalai tesque	02890-45
Triton-X100	Nacalai tesque	35501-15
microtubes (1.5 ml)	INA OPTIKA	CF-0150
Incubation
As one swist mixer TM-300 (rocker)	As one	TM-300	rocker
Bovine Serum Albumin	SIGMA	9048-46-8
Primary antibody
anti-Sro (guinea pig), 1:1000
anti-GFP (rabbit), 1:1000	Molecular Probes	A6455	Shimada-Niwa ans Niwa, 2014
anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100	Nakarai tesque	04363-66
anti-5HT (rabbit), 1:500	SIGMA	S5545
anti-Hts 1B1 (mouse)	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	1B1
anti-DE-cadherin (rat), 1:20	DSHB	DCAD2
anti-nc82 (mouse), 1:50	DSHB	nc82
Secondary antibody
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A-11008
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A-11001
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate	Life Technologies	A-11081
Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate	Life Technologies	A-21435
Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidin	Life Technologies	A-22283
Mounting reagents
Micro slide glass	Matsunami Glass Ind.,Ltd.	SS7213
Square microscope cover glass	Matsunami Glass Ind.,Ltd.	C218181
FluorSave reagent (Mounting reagent)	Calbiochem	345789
Transfer pipette 1 ml (Disposable dropper)	WATSON	5660-222-1S
Fly stocks
w; GMR45C06-GAL4			from Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260)
UAS–GFP; UAS–mCD8::GFP			gifts from K. Ito, The University of Tokyo.
w[1118]
w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP
w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4			Li, H. H. (2014) and Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A. (2010)
w; UAS-mCD8::GFP			from Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188)
yw;; nSyb-GAL4			from Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941)