Summary
Er zijn technische obstakels voor het meten van de huidige flux via meerdere ion kanalen tegelijk, en later onderscheiden welk deel van de transmembraan huidige is te wijten aan elk kanaal type. Om aan deze behoefte, deze methode biedt een manier om de IV curve van een kanaal typen met behulp van specifieke frequentie componenten te genereren.
Abstract
INLEIDING: Momenteel zijn er geen algemeen geaccepteerde methoden om gelijktijdig meten van verschillende ion channel soorten en ontleden de gemeten stroom in porties toe te schrijven aan elk kanaal type. Deze studie toont aan hoe impedantie spectroscopie kan worden gebruikt om specifieke frequenties die sterk correleren met de steady state stroom amplitude gemeten tijdens voltage clamp experimenten te identificeren. Bij deze methode wordt het invoegen van een geluid-functie met specifieke frequenties in de spanning stap protocol. In presenteerde het werk, is een model cel gebruikt om aan te tonen dat er geen hoge correlaties worden ingevoerd door de spanning klem circuit, en ook dat het geluid functie zelf geen hoge correlaties te introduceren als er geen ionenkanalen aanwezig zijn. Deze validatie is noodzakelijk voordat de techniek kan worden toegepast op preparaten met ion-kanalen. Het doel van de gepresenteerde protocol is om te demonstreren hoe de frequentierespons van een enkel ion channel type om een geluid functie te karakteriseren. Zodra specifieke frequenties zijn geïdentificeerd in een individueel kanaal het type, kunnen ze worden gebruikt om de steady state stroom voltage (IV) curve te reproduceren. De frequenties die sterk correleren met een kanaal type en minimaal correleren met andere kanaal types kan vervolgens worden gebruikt om de huidige bijdrage van meerdere kanalen types gelijktijdig gemeten te schatten.
METHODEN: Voltage clamp metingen werden uitgevoerd op een model cel met behulp van een standaard voltage stap protocol (-150 tot 50 mV, 5mV stappen). Ruisfuncties die gelijke grootheden van 1-15 kHz frequenties (nul tot piek amplitude: 50 of 100mV) zijn ingebracht in elke spanning stap. De reële component van de Fast Fourier transformatie (FFT) van het uitgangssignaal is berekend met en zonder geluid voor elke stap potentieel. De grootte van elke frequentie als functie van de spanning stap was gecorreleerd met de huidige amplitude op de overeenkomstige spanningen.
RESULTATEN EN CONCLUSIES: In de afwezigheid van geluid (controle), magnitudes van alle frequenties behalve de DC-component gecorreleerd slecht (| R | <0,5) met de IV curve, terwijl de DC-component had een correlatiecoëfficiënt van meer dan 0.999 in alle afmetingen. De kwaliteit van de correlatie tussen de individuele frequenties en de IV curve veranderde niet toen een geluid-functie werd toegevoegd om de spanning stap protocol. Ook het verhogen van de amplitude van het geluid functie deed ook geen toename van de correlatie. Controlemetingen te tonen dat de spanning klem circuit op zichzelf niet veroorzaakt geen frequenties boven de 0 Hz tot zeer correleren met de steady-state IV curve. Ook metingen in het bijzijn van het lawaai-functie aan te tonen dat het geluid functie niet veroorzaakt geen frequenties boven de 0 Hz te correleren met de steady-state IV curve als er geen ion-kanalen aanwezig zijn. Op basis van deze verificatie kan de methode nu worden toegepast op preparaten met een enkel ion type kanaal met de bedoeling het identificeren van frequenties waarvan het amplitudes correleren specifiek met dat kanaal type.
Protocol
1. Bereid Noise Functie en Input Signal
- Maak een geluid functie met de gewenste frequentie componenten. Dit kan worden gedaan door het beschrijven van de gewenste frequentie componenten in de frequentie-domein en vervolgens de berekening van de inverse snelle Fourier transformatie. In deze studie, 1 - 15 kHz werd gebruikt. Alle Fourier transformaties en inverse Fourier transformaties beschreven in deze studie werden berekend met behulp van Matlab van de FFT en ifft functies.
- De juiste schaal van de amplitude van de ruis functie. In deze studie het lawaai functie was geschaald zodanig dat de nul tot amplitude van de ruis functie piek was 50 of 100 mV.
- Maak een stimulus bestand met behulp van methoden geschikt zijn voor de aanschaf software wordt gebruikt. Voor Clampex 8, maakt u eerst een tekstbestand met de juiste header. Onder de header, plaatst u de tijd stappen van een beweging in de eerste kolom. De tijd die stappen moeten dezelfde tijdelijke afstand als de sampling interval wordt gebruikt in de metingen. Voor elke vegen in de spanning stap protocol plaats de exacte gewenste spanningen op elk tijdstip stap. Dit moet onder meer het geluid functie.
2. Voer Voltage Clamp Afmetingen
- Maak een meetprotocol binnen de acquisitie software die compatibel is met de stimulus bestand eerder gegenereerd. In Clampex is er een menu waarmee de gebruiker te associëren een stimulus-bestand met het huidige protocol.
- Bevestig een model (of biologische) cel naar de meetapparatuur.
- Voer het experiment zoals gepland. Het oog op controle, zorg ervoor om periodieke metingen die niet behoren geen lawaai functies.
3. Bericht Experiment Analyse
- Bereken de IV curve voor een individuele opname. Als de opname is bij steady state bij het geluid functie wordt toegepast, kan de IV-curve worden gemaakt met behulp van een steady state gedeelte van de opname tijdelijk buiten het bereik van het geluid functie. Als de opname was niet bij steady state, het lawaai functie kunnen interfereren met de berekening van de IV curve, zodat een tweede opname moet worden gemaakt zonder het lawaai-functie aanwezig.
- Voor elke spanning stap in een opname te berekenen de snelle Fourier-transformatie van het deel van de opname waar het geluid functie werd ingebracht. Combineer de Fourier-transformatie voor elke spanning stap in amxn matrix, waarbij m is het aantal frequenties in de FFT, en n is het aantal van de spanning stappen. In deze configuratie, elke rij van de matrix is de amplitude van een enkele frequentie bij alle spanning stappen in het experiment.
- Voor elke frequentie (dat wil zeggen elke rij in de bovenstaande matrix) correleren de rij met de IV curve gegenereerd in 3.1 en noteer de correlatie coëfficiënt.
- Plot de correlatiecoëfficiënt vs frequentie frequenties die sterk correleren met de IV curve te visualiseren. Omdat de DC-component is opgenomen in de eerste frequentie van de FFT, moet de correlatie coëfficiënt voor deze frequentie altijd> 0,99.
4. Representatieve resultaten:
Representatieve voltage clamp metingen worden getoond voor een model cel zonder (Figuur 1A) en met (figuur 1B) een geluid functie ingevoegd in de spanning stap protocol. De IV curve werd ook berekend voor het model cel (figuur 1C). Voor elke vegen, in de opnamen van figuur 1, was de FFT berekend over het tijdsbestek waar het lawaai functie was geplaatst (zie rood vak in de figuren 1A, 1B). Figuren 2A en 2B tonen de FFT's berekend voor de opnames in figuur 1A en 1B, respectievelijk. Bij de visuele inspectie, de DC-component (rood gemarkeerd) lijkt na te bootsen de vorm van de IV curve. Zonder het lawaai functie, alle frequenties boven DC lijkt amplitudes hebben bijna nul (Figuur 2A). Wanneer het lawaai functie wordt ingevoegd, frequenties tussen 1 en 15 kHz visueel waarneembaar amplitudes (Figuur 2B). Figuur 3 toont het resultaat van de correlerende individuele frequentie amplitudes over het bereik van de spanning stappen tegen de IV curve. Figuur 3A-C toont de correlatiecoëfficiënten toen het experiment werd gedaan onder controle omstandigheden (geen geluid functie) en met geluid amplitudes van 50 en 100 mV, respectievelijk. Merk op dat in alle gevallen, de DC-component lijkt bijna perfect correleren met de IV curve. Inderdaad, voor alle opnamen, de correlatie coëfficiënt voor deze frequentie was groter dan 0,99 (R = 0,9996 ± 1E-5, gemiddelde ± standaarddeviatie). Als we kijken naar figuur 3A (controle condities), zijn er geen frequenties naast de DC-component waarvan de amplitude sterk correleert met de IV curve. In het bijzonder, geen van deze frequenties correlatiecoëfficiënten groter is dan 0,5. Na het inbrengen van de laagste amplitude ruis-functie (50 mV), deze zelfde frequenties nog correlatiecoëfficiënten minder dan 0,5. De correlatie coëfficiënten voor dese frequenties ook niet groter worden dan 0,5 wanneer het geluid amplitude werd verhoogd tot 100 mV.
. Figuur 1 Model Cell Recordings: Voltage clamp opnames worden getoond voor een model cel zonder (1A) en met (1B) een geluid-functie in de spanning stap protocol. Voor de eerste en laatste 20 ms van elk vegen, was de potentiële gehouden op het bedrijf potentiële (0 mV). Elke spanning stap was 80 ms lang, en het lawaai functie werd ingebracht 40 ms na het begin van de stap. Het lawaai functie hadden een duur van 30 ms en bevatte frequenties tussen 1 en 15 kHz. Spanning was weer stapte, -150 tot 50 mV in 5 mV stappen. Een IV-curve voor het model cel wordt ook getoond (1C). Om de opnames makkelijker te lezen, was slechts een op de vijf vegen opgenomen in 1A en 1B, maar alle veegt werden opgenomen in 1C.
Figuur 2 FFT van Recordings:. De FFT is berekend voor de 30 ms gedeelte van elk vegen waar het geluid-functie moet worden ingevoegd (het gebied begrensd door de rode doos in de figuren 1A, 1B). Figuren 2A en 2B tonen de FFT's berekend zonder en met het lawaai functie respectievelijk. Nogmaals, voor de duidelijkheid, is alleen de FFT van elke vijfde vegen opgenomen in de figuur, maar alle veegt werden gebruikt in toekomstige berekeningen.
. Figuur 3 IV Frequentie Correlaties: De resultaten van correlaties tussen de IV curve van een opname en de amplitude van de individuele frequenties over het bereik van de spanning stappen wordt weergegeven. Figuren 1A - 1C tonen de correlatie coëfficiënt voor frequenties van 0 tot 20 kHz onder controle omstandigheden, en in aanwezigheid van 50 of 100 mV ruis functies, respectievelijk.
Figuur 4 Re-Creatie van de IV Curve:. De IV curve voor het model cel (dezelfde als figuur 1C) en de omvang van twee frequenties waren bedekt. De eerste frequentie werd de DC-component (R = 0,995), en de tweede was een willekeurig gekozen frequentie met een lage correlatie (R = 0,3212). De frequentie amplitudes werden geschaald op ongeveer dezelfde amplitude als de IV curve.
Discussion
Er zijn technische obstakels die op dit moment onderzoekers beletten het meten van verschillende ion channel types tegelijk met de bedoeling later bepalen hoeveel stroom moet worden toegeschreven aan elk kanaal type. Vanwege deze beperking, zijn ionkanalen meestal afzonderlijk bestudeerd met behulp van technieken zoals spanning, stroom, en actie potentiële klem. 1 Om individueel kanaal types, heterologe expressie systemen worden vaak gebruikt studie. 2 Bij het werken met cellen geïsoleerd uit weefsel, zoals cardiomyocyten , moeten andere middelen worden gebruikt om verschillende ionkanalen blokkeren. Bijvoorbeeld, natrium-kanalen kunnen worden geïnactiveerd door een langzame depolariseren spanning ramp, kan binnen 3 tot rectificatie van kalium kanalen worden geblokkeerd met extracellulaire BaCl2, 4 en calcium kanalen kunnen worden geblokkeerd met behulp van verapamil 5.
Gebruikt een methode die gedeeltelijk overwint deze beperking is om de huidige flux te meten door middel van twee kanalen tegelijk typen, dan is de meting te herhalen na selectief blokkeren van een type kanaal met een geschikt middel. Aftrekken van de twee metingen kan dan worden gebruikt om de hoeveelheid stroom die toe te schrijven aan het kanaal type dat werd geblokkeerd schatten. 6 Er zijn echter twee belangrijke beperkingen aan deze techniek. De eerste, chemische stoffen nog niet zijn geïdentificeerd die selectief kan elk ion kanaal te blokkeren, en een aantal veel gebruikte geneesmiddelen zijn niet-specifieke interacties met andere kanaal types. 5,7 Ten tweede, kan niet worden bepaald op basis van deze techniek, of het ene kanaal wordt gemoduleerd door een andere kanaal. Zo heeft heterogene expressie van NAV 1.5 en Kir 2.1 is aangetoond in cavia ventrikels, en er is gesuggereerd dat er een synergetische relatie bestaat tussen de twee kanalen, zodat een hogere Kir 2,1 tot uitdrukking in de rechter ventrikel geleidingssnelheid onderdrukt. 8 Momenteel , dit kan niet worden geverifieerd.
In deze studie hebben we suggereren dat impedantie spectroscopie kan een nuttig instrument voor het bestuderen van verschillende ion channel types gelijktijdig gemeten worden. Hoewel de gepresenteerde methode is nog nooit gebruikt om de stromen van twee kanalen gelijktijdig gemeten types te onderscheiden, is impedantie spectroscopie is gebruikt om een aantal andere aspecten van het ionkanaal functie te bestuderen. Goodman en Kunst toonde met behulp van schildpad auditieve haarcellen dat de huidige klem protocollen kunnen worden aangepast om een cel af te stemmen op verschillende frequenties, en de trillingen in de transmembraan potentieel is te wijten aan een samenspel tussen een innerlijke herstellen van K + kanaal en een Ca 2 + kanaal. 9 Han en Frazier aangetoond dat de impedantie gemeten kan worden in een enkele cel over een breed bereik van frequenties (100 Hz tot 5 MHz), en de toename van de impedantie waargenomen wanneer K + en Ca 2 +-kanalen werden geblokkeerd kan een eenvoudig middel zijn om detecteren kanaal blok in high throughput drug-schermen. 10 Hayashi en Fishman hebben gebruikt complexe geleiding om kinetische eigenschappen van een innerlijke herstellen van K +-kanaal. 11 Andere groepen hebt een enkele frequentie in de spanning klem protocol van verschillende kanalen soorten en studie toonde aan dat de waargenomen frequentie response is overeengekomen met de verwachte respons voor een aantal frequenties, maar andere niet. 12,13 Millonas en Hanck stelde de reden waarom sommige frequenties niet de verwachte respons is de aanwezigheid van een meervoudige rentevoet constanten in het Markov-model. 12 Studies als deze, en anderen, hebben aangetoond dat er gevallen waarin ionische stromen gemeten van ionenkanalen tijdens het gebruik van impedantie spectroscopie het niet eens met de theoretische frequentierespons. Dit is geen probleem in dit onderzoek omdat het doel van de methode in deze studie is het identificeren van frequenties die correleren met de huidige amplitude onafhankelijk van de onderliggende veronderstellingen van het membraan elektrisch circuit. Furtheremore, is de huidige amplitude berekend op basis van delen van de opnames die geen enkele ruisfuncties ingevoegd in hen. Een aantal andere studies ook aanwezig modellen van verschillende ionenkanalen vertonen tal van geleidende en niet-geleiding staten met ieder hun eigen snelheidsconstanten. 14,15,16 Thompson et al. toonden aan dat de selectiviteit van het filter KcsA kanaal verschillende bindingsplaatsen voor Na is +, Li + en K +, en de energetische kosten van het verplaatsen van de ene binding site naar de andere als een ion beweegt door de selectiviteit filter is wat maakt het kanaal bij voorkeur K +-ionen te voeren via de porie. 17 In dit artikel wordt ingevoegd een reeks van frequenties (lawaai-functie) in een spanning stap protocol en zocht voor frequenties waarvan de amplitude sterk correleren met de totale huidige amplitude. Sinds een sterk bewijs is gepresenteerd suggereren een meervoudige rentevoet constanten spelen een rol in geleiding van ionen door differenT-kanalen, de introductie van de frequenties in verband met deze snelheidsconstanten kunnen bepaalde frequenties te resoneren of sterk correleren met de huidige amplitude, die anders niet zouden hebben. De techniek aangetoond in deze studie is uitgevoerd op een model cel, die is een parallel RC circuit dat meestal wordt gebruikt om de spanning klem circuits en acquisitie apparatuur te testen. Het is niet te verwachten dat alle frequenties behalve DC zou correleren met de huidige omvang, en dit is te zien in onze gegevens. We tonen ook aan dat de toevoeging van het geluid functie gaf geen frequenties tot zeer correleren met de huidige amplitude. Deze twee bevindingen zijn kritisch omdat ze laten zien dat de meetapparatuur en het lawaai functie niet zelf veroorzaken geen frequenties te correleren met de huidige amplitude. Bij het toekomstige studies metingen met behulp van membranen die ionenkanalen te maken, is de verwachting dat, afhankelijk van de gebruikte kanaal, frequenties die overeenkomen met snelheidsconstanten in de selectiviteit filter of eventueel de porie zal de frequentie response van het kanaal invloed en invloed hebben op welke frequenties hoog zijn of een lage correlatie met de huidige amplitude.
Omdat deze methode is een nieuwe techniek voor het bestuderen van ion-kanalen, zijn er een aantal richtingen toekomstige studies zouden kunnen volgen. Eerst moet de techniek worden gebruikt om de frequentie response van specifieke geïsoleerde kanalen te karakteriseren. Extra werk moet ook worden gedaan om de frequentie amplitudes te kalibreren aan de huidige amplitudes. Zodra meerdere kanalen worden individueel gekarakteriseerd, moeten meerdere kanalen types tegelijk worden gemeten. De techniek kan ook worden aangepast voor gebruik in actiepotentiaal klem, stroomtang, en in het veld stimulatie studies. Hoewel dit is een nieuwe techniek, het laat zien wat kan een krachtige manier om elektrofysiologische metingen die voorheen niet mogelijk te maken en waardevolle nieuwe inzichten in de fysiologische rol van ionenkanalen.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health te verlenen aantal R21-HL094828-01 toegekend aan Dr Poelzing.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matlab | Mathworks | n/a | Natick, MA |
| Clampex 8 | Molecular Devices | Clampex 8 | Sunnyvale, CA |
| Integrating Patch Clamp Amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200 | Sunnyvale, CA |
| Headstage | Molecular Devices | CV202 | Sunnyvale, CA |
| 16-Bit Data Acquisition System | Molecular Devices | Digidata 1322A | Sunnyvale, CA |
| Model Cell | Molecular Devices | Patch 1 Model Cell | Sunnyvale, CA |
References
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).
- Ukomadu, C., Zhou, J., Sigworth, F. J., Agnew, W. S. mu]l Na+ channels expressed transiently in human embryonic kidney cells: Biochemical and biophysical properties. Neuron. 8, 663-676 (1992).
- Abriel, H. Novel Arrhythmogenic Mechanism Revealed by a Long-QT Syndrome Mutation in the Cardiac Na+ Channel. Circ Res. 88, 740-745 (2001).
- Giles, W. R., Imaizumi, Y. Comparison of potassium currents in rabbit atrial and ventricular cells. J Physiol. 405, 123-145 (1988).
- Lee, K. S., Tsien, R. W. Mechanism of calcium channel blockade by verapamil, D600, diltiazem and nitrendipine in single dialysed heart cells. Nature. 302, 790-794 (1983).
- Ozdemir, S. Pharmacological Inhibition of Na/Ca Exchange Results in Increased Cellular Ca2+ Load Attributable to the Predominance of Forward Mode Block. Circ Res. 102, 1398-1405 (2008).
- Zhang, S., Zhou, Z., Gong, Q., Makielski, J. C., January, C. T. Mechanism of Block and Identification of the Verapamil Binding Domain to HERG Potassium Channels. Circ Res. 84, 989-998 (1999).
- Veeraraghavan, R., Poelzing, S. Mechanisms underlying increased right ventricular conduction sensitivity to flecainide challenge. Cardiovasc. Res. 77, 749-756 (2008).
- Goodman, M., Art, J. Positive feedback by a potassium-selective inward rectifier enhances tuning in vertebrate hair cells. Biophysical Journal. 71, 430-442 (1996).
- Han, A., Frazier, A. B. Ion channel characterization using single cell impedance spectroscopy. Lab Chip. 6, 1412-1414 (2006).
- Hayashi, H., Fishman, H. Inward rectifier K+-channel kinetics from analysis of the complex conductance of Aplysia neuronal membrane. Biophysical Journal. 53, 747-757 (1988).
- Millonas, M. M., Hanck, D. A. Nonequilibrium response spectroscopy of voltage-sensitive ion channel gating. Biophys. J. 74, 210-229 (1998).
- Misakian, M., Kasianowicz, J., Robertson, B., Petersons, O. Frequency response of alternating currents through the Staphylococcus aureus alpha-hemolysin ion channel. Bioelectromagnetics. 22, 487-493 (2001).
- Sale, H. Physiological Properties of hERG 1a/1b Heteromeric Currents and a hERG 1b-Specific Mutation Associated With Long-QT Syndrome. Circ Res. 103, 81-95 (2008).
- Blatz, A. L., Magleby, K. L. Quantitative description of three modes of activity of fast chloride channels from rat skeletal muscle. J Physiol. 378, 141-174 (1986).
- Kuo, J. J., Lee, R. H., Zhang, L., Heckman, C. J. Essential role of the persistent sodium current in spike initiation during slowly rising inputs in mouse spinal neurones. The Journal of Physiology. 574, 819-834 (2006).
- Thompson, A. N. Mechanism of potassium-channel selectivity revealed by Na(+) and Li(+) binding sites within the KcsA pore. Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 1317-1324 (2009).
