Summary
Hay obstáculos técnicos para la medición de flujo de corriente a través de los canales iónicos de forma simultánea, y luego discernir qué parte de la corriente transmembrana se debe a que cada tipo de canal. Para satisfacer esta necesidad, este método presenta una forma de generar la curva IV de los tipos de canal individual utilizando componentes de frecuencias específicas.
Abstract
INTRODUCCIÓN: En la actualidad, no existen métodos establecidos para medir varios tipos de canales iónicos y se descomponen al mismo tiempo la corriente medida en porciones atribuibles a cada tipo de canal. Este estudio demuestra cómo espectroscopía de impedancia puede ser utilizado para identificar frecuencias específicas que se correlaciona altamente con la amplitud de la corriente de estado estacionario medida durante los experimentos de fijación de voltaje. El método consiste en insertar una función de ruido contiene frecuencias específicas en el protocolo de paso de tensión. En el trabajo presentado, una célula modelo se utiliza para demostrar que no hay una alta correlación son introducidos por los circuitos de fijación de voltaje, y también que la función de ruido en sí no presenta ninguna correlación alta cuando no hay canales de iones están presentes. Esta validación es necesaria antes de que la técnica puede aplicarse a los preparados que contienen los canales de iones. El objetivo del protocolo que se presenta es para demostrar la forma de caracterizar la respuesta en frecuencia de un tipo de canales iónicos individuales a una función de ruido. Una vez que las frecuencias se han identificado en un tipo de canal individual, que puede ser usado para reproducir el estado de equilibrio actual de tensión (IV) la curva. Las frecuencias que se correlacionan con gran tipo de canal y una mínima correlación con los tipos de otro canal se puede utilizar para estimar la contribución actual de los tipos de canales múltiples medidas simultáneamente.
MÉTODOS: Las mediciones de voltaje clamp se realizaron en un modelo de células utilizando un protocolo estándar de tensión de paso (-150 a +50 mV, 5mV pasos). Funciones de ruido que contienen magnitudes iguales de 15.1 kHz frecuencia (de cero a amplitudes de pico: 50 o 100 mV) se inserta en cada escalón de tensión. El componente real de la Transformada Rápida de Fourier (FFT) de la señal de salida se ha calculado con y sin ruido para cada posible paso. La magnitud de cada frecuencia en función de la tensión de paso se correlaciona con la amplitud de la corriente en los voltajes correspondientes.
Resultados y conclusiones: En la ausencia de ruido (control), las magnitudes de todas las frecuencias excepto el componente DC débil correlación (| R | <0,5) con la curva IV, mientras que el componente de CC tuvo un coeficiente de correlación superior a 0,999 en todas las mediciones. La calidad de la correlación entre las frecuencias individuales y la curva IV no cambió cuando una función de ruido fue introducido en el protocolo de paso de tensión. Del mismo modo, el aumento de la amplitud de la función de ruido tampoco aumentar la correlación. Medidas de control demuestra que el circuito de fijación de voltaje por sí misma no causa ningún frecuencias por encima de 0 Hz a correlacionan altamente con la curva en estado estacionario IV. Del mismo modo, las mediciones de la presencia de la función de ruido demostrar que la función de ruido no causa ningún frecuencias por encima de 0 Hz a correlacionarse con la curva en estado estacionario IV cuando no hay canales de iones están presentes. En base a esta verificación, el método puede aplicarse ahora a los preparados que contienen un tipo de iones de un solo canal con la intención de identificar las frecuencias cuyas amplitudes se correlaciona específicamente con ese tipo de canal.
Protocol
1. Prepare la función del ruido y la señal de entrada
- Crear una función de ruido que contiene los componentes de la frecuencia deseada. Esto se puede hacer mediante la descripción de los componentes de frecuencia deseada en el dominio de la frecuencia y el cálculo de la inversa de la transformada rápida de Fourier. En este estudio, 1 - 15 kHz se utiliza. Todas las transformadas de Fourier y la transformada de Fourier inversa se describe en este estudio se calcularon utilizando FFT de Matlab y funciones IFFT.
- Escala de la amplitud de la función de ruido adecuado. En este estudio la función de ruido se redujo de tal manera que el cero a la máxima amplitud de la función de ruido es de 50 o 100 mV.
- Crear un archivo de estímulo con los métodos apropiados para la adquisición de software que se utiliza. Para Clampex 8, primero debe crear un archivo de texto con el encabezado correspondiente. Debajo de la cabecera, inserte los incrementos de tiempo de un solo barrido en la primera columna. Los incrementos de tiempo debe tener el mismo espacio temporal como el intervalo de muestreo utilizados en las mediciones. Para cada barrido en el protocolo de paso de tensión insertar las tensiones exacta deseada en cada paso de tiempo. Esto debe incluir la función de ruido.
2. Realizar mediciones de tensión Clamp
- Crear un protocolo de medición en el software de adquisición que sea compatible con el archivo de estímulo generado previamente. En Clampex, hay un menú que permite al usuario asociar un archivo de estímulo con el protocolo actual.
- Adjuntar un modelo (o biológicas) de células de los equipos de medición.
- Realizar el experimento en la fecha prevista. A efectos de control, asegúrese de incluir mediciones periódicas que no incluyen ningún tipo de funciones de ruido.
3. El análisis post-Experimento
- Se calcula la curva IV para un registro individual. Si la grabación está en estado estacionario cuando la función de ruido se aplica, la curva IV pueden ser creados usando una parte el estado de equilibrio de la grabación temporalmente fuera del rango de la función de ruido. Si la grabación no se encontraba en estado estacionario, la función de ruido puede interferir con el cálculo de la curva IV, por lo que una segunda grabación se debe hacer sin la función de ruido presente.
- Para cada escalón de tensión en una grabación de calcular la transformada rápida de Fourier de la parte de la grabación donde se introdujo la función de ruido. Combine la transformada de Fourier para cada escalón de tensión en amxn matriz, donde m es el número de frecuencias en la FFT, y n es el número de pasos de voltaje. En esta configuración, cada fila de la matriz representa la amplitud de una sola frecuencia en todas las etapas de tensión en el experimento.
- Para cada frecuencia (es decir, cada fila de la matriz anterior) se correlacionan con la fila de la curva IV generada en 3.1 y registrar el coeficiente de correlación.
- Parcela el coeficiente de correlación de frecuencia vs visualizar las frecuencias que se correlacionan altamente con la curva IV. Dado que el componente de CC está contenida dentro de la primera frecuencia de la FFT, el coeficiente de correlación para esta frecuencia siempre debe ser> 0,99.
4. Los resultados representativos:
Representante de medidas con la pinza de voltaje se muestran en una celda sin modelo (Figura 1) y con (fig. 1B) una función de ruido se inserta en el protocolo de paso de tensión. La curva IV también se calculó para el modelo de células (fig. 1C). Para cada uno de barrido, en las grabaciones de la Figura 1, la FFT se calcula sobre el marco de tiempo donde se introdujo la función de ruido (véase el recuadro rojo en las figuras 1A, 1B). Las figuras 2A y 2B muestran la FFT calculada para las grabaciones se muestra en la Figura 1A y 1B, respectivamente. Tras la inspección visual, el componente de CC (en rojo) parece imitar la forma de la curva IV. Sin la función de ruido, todas las frecuencias por encima de DC parecen tener amplitudes cercanas a cero (Figura 2). Cuando la función de ruido se inserta, las frecuencias entre 1 y 15 kHz tienen amplitudes visualmente apreciable (Figura 2B). La Figura 3 muestra el resultado de la correlación de amplitudes de frecuencia individuales en el rango de medidas de tensión en la curva IV. Figura 3A-C muestra los coeficientes de correlación cuando el experimento se llevó a cabo bajo condiciones de control (sin función de ruido) y con una amplitud de ruido de 50 y 100 mV, respectivamente. Aviso en todos los casos, el componente de CC parece correlacionarse casi a la perfección con la curva IV. De hecho, para todas las grabaciones, el coeficiente de correlación para esta frecuencia fue mayor que 0,99 (R = 0,9996 ± 1E-5, media ± desviación estándar). Cuando nos fijamos en la Figura 3A (las condiciones de control), no hay frecuencias, además de la componente de CC, cuya amplitud se correlaciona significativamente con la curva IV. En concreto, ninguna de estas frecuencias tienen coeficientes de correlación superior a 0,5. Tras la inserción de la función de la amplitud de ruido más bajo (50 mV), estas mismas frecuencias todavía tenían coeficientes de correlación inferior a 0,5. Los coeficientes de correlación para lafrecuencias se también no llegó a ser superior a 0,5 cuando la amplitud del ruido se incrementó a 100 mV.
. Figura 1 grabaciones modelo de celular: Las grabaciones de pinza de voltaje se muestran en una celda sin modelo (1A) y (1B) una función de ruido incluido en el protocolo de paso de tensión. Para el primero y el último 20 ms de cada pasada, el potencial se mantuvo en el potencial de mantenimiento (0 mV). Cada escalón de tensión fue de 80 ms de largo, y la función de ruido se insertó 40 ms después del comienzo de la etapa. La función de ruido tuvo una duración de 30 ms y contenía frecuencias entre 1 y 15 kHz. Tensión se intensificó lado a otro, -150 a 50 mV en incrementos de 5 mV. Una curva IV para el modelo de células también se muestra (1C). Para realizar las grabaciones más fácil de leer, sólo uno de cada barrido quinto fue incluido en 1A y 1B, pero todos los barridos se incluyeron en 1C.
Figura 2 FFT de las grabaciones:. La FFT se calcula para la parte de 30 ms de cada pasada, donde la función de ruido se va a insertar (el área delimitada por el cuadro rojo en las figuras 1A, 1B). Las figuras 2A y 2B muestran la FFT calculada con y sin la función de ruido, respectivamente. Una vez más, para mayor claridad, sólo la FFT de cada barrido quinto se incluye en la figura, pero todos los barridos se utilizaron en los cálculos futuros.
. Figura 3 Correlación de frecuencias IV: Los resultados de las correlaciones entre la curva IV de la grabación y la amplitud de las frecuencias individuales en el rango de medidas de tensión se muestra. Figuras 1A - 1C muestran el coeficiente de correlación de frecuencias entre 0 y 20 kHz en condiciones de control, y en presencia de 50 o 100 funciones de ruido mV, respectivamente.
Figura 4 Re-Creación de la curva IV:. La curva IV para el modelo de células (como en la figura 1C) y la magnitud de las dos frecuencias se superponen. La primera frecuencia fue el componente DC (R = 0,995), y la segunda fue una frecuencia elegida al azar, con baja correlación (r = 0.3212). Las amplitudes de frecuencia fueron reducidas a aproximadamente la misma amplitud que la curva IV.
Discussion
Hay obstáculos técnicos que actualmente impiden a los investigadores de la medición de múltiples tipos de canales iónicos de forma simultánea con la intención de posteriormente determinar la cantidad de corriente se debe atribuir a cada tipo de canal. Debido a esta limitación, los canales iónicos se estudian individualmente usando técnicas tales como tensión, corriente, y la acción pinza potencial. 1 Para el estudio de los distintos tipos de canales, sistemas de expresión heteróloga se utilizan con frecuencia. 2 Cuando se trabaja con células aisladas de tejido, como los cardiomiocitos , otros medios deben ser usados para bloquear varios canales de iones. Por ejemplo, los canales de sodio puede ser inactivado por una rampa de tensión lenta despolarización, 3 hacia adentro rectificar los canales de potasio puede ser bloqueado con BaCl2 extracelular, 4 canales de calcio y pueden ser bloqueados con verapamilo 5.
Una de las prácticas que en parte supera esta limitación es para medir el flujo de corriente a través de dos tipos de canales de forma simultánea, y luego repetir la medición después de bloquear selectivamente un tipo de canal con un agente apropiado. La resta de las dos mediciones se pueden utilizar para estimar la cantidad de corriente atribuible al tipo de canal que fue bloqueado. 6 Sin embargo, hay dos grandes limitaciones de esta técnica. En primer lugar, los agentes químicos no han sido identificados que pueden bloquear de forma selectiva cada uno de los canales iónicos, y algunas drogas utilizadas son interacciones no específicas con los tipos de canal. 5,7 segundo lugar, no puede determinarse a partir de esta técnica si un canal está modulada por otra canal. Por ejemplo, la expresión heterogénea de NAV 1.5 y Kir 2.1 ha demostrado en Guinea ventrículos cerdo, y se ha sugerido que existe una relación sinérgica entre los dos canales, de tal manera que Kir 2,1 mayor expresión en el ventrículo derecho deprime la velocidad de conducción. Actualmente 8 , esto no puede ser verificada.
En este estudio, sugieren que la espectroscopía de impedancia puede ser una herramienta útil para el estudio de múltiples tipos de canales de iones medidos de forma simultánea. Aunque el método presentado no ha sido utilizado para discernir las corrientes a partir de dos tipos de canales miden simultáneamente, espectroscopía de impedancia se ha utilizado para estudiar una serie de otros aspectos de la función del canal iónico. Goodman y el arte con la tortuga mostró células ciliadas auditivas que los protocolos de corriente con la pinza se puede modificar para ajustar una celda a diferentes frecuencias, y las oscilaciones en el potencial de membrana se debe a una interacción entre un adentro rectificar canal de K + y un canal de Ca 2 +. 9 Han y Frazier demostrado que la impedancia se puede medir en una sola célula en un amplio rango de frecuencias (100 Hz a 5 MHz), y el aumento de la impedancia observada en K + o Ca 2 + canales estaban bloqueados podría ser un simple medio para detectar un bloqueo en el canal de pantallas de alta rendimiento de drogas. 10 Hayashi y Fishman ha utilizado la conductancia complejas para estudiar las propiedades cinéticas de una rectificación de K + hacia el interior del canal 11. Otros grupos han insertado una sola frecuencia en el protocolo de fijación de voltaje de los tipos de canales diferentes y demostró que la respuesta en frecuencia observada de acuerdo con la respuesta esperada para algunas frecuencias, pero otras no. 12,13 Millonas y Hanck sugiere la razón algunas frecuencias no se produce la respuesta esperada es la presencia de constantes de tipo de interés múltiple en el modelo de Markov. 12 Estudios como estos, así como otros, han demostrado que hay casos en que las corrientes iónicas medidas de los canales iónicos durante el uso de espectroscopía de impedancia no está de acuerdo con la respuesta de frecuencia teórica. Esto no es una preocupación en este estudio debido a que el objetivo del método en este estudio es identificar las frecuencias que se corresponden con la amplitud de la corriente independiente de los supuestos del circuito eléctrico de membrana. Furtheremore, la amplitud de la corriente se calcula a partir de porciones de las grabaciones que no tienen funciones de ruido inserta en ellos. Un número de otros estudios también los modelos actuales de los canales iónicos exhiben numerosos numerosos estados la realización de la conducción y no a todos con sus constantes de velocidad propia. 14,15,16 Thompson et al demostraron que el filtro de selectividad del canal KcsA tiene diferentes sitios de unión de Na +, Li + y K +, y los costes energéticos de moverse de un sitio de unión a los otros como se mueve un ion a través del filtro de selectividad es lo que hace el canal de preferencia realizar iones K + a través de sus poros. 17 En el presente trabajo se inserta una amplia de frecuencias (función de ruido) en un protocolo de paso de tensión y buscó las frecuencias, cuya amplitud altamente correlaciona con la amplitud de la corriente general. Desde una fuerte evidencia ha sido presentada sugiere varias constantes tasa de desempeñar un papel en la conducción de iones a través de difet los canales, la introducción de las frecuencias asociadas a estas constantes de velocidad pueden causar ciertas frecuencias de resonancia o altamente correlaciona con la amplitud de la corriente, que no habría otra manera. La técnica demostrada en este estudio se realiza sobre un modelo de células, que es un circuito paralelo RC que normalmente se utiliza para probar el circuito de fijación de voltaje y el equipo de adquisición. No se espera que las frecuencias, además de CC se correlaciona con la magnitud actual, y esto se muestra en nuestros datos. También muestran que la adición de la función de ruido no causa ningún frecuencias para correlacionar altamente con la amplitud de la corriente. Estos dos hallazgos son muy importantes porque demuestran que el equipo de medición y la función del ruido de por sí no causa ningún frecuencias que se correlaciona con la amplitud de la corriente. Cuando los estudios futuros efectúe las mediciones con las membranas que contienen los canales de iones, se espera que, en función del canal utilizado, las frecuencias que corresponden a las constantes de velocidad en el filtro de selectividad o, posiblemente, de los poros de la influirán en la respuesta de frecuencia del canal y afectan a las frecuencias que tienen un alto o una baja correlación con la amplitud de la corriente.
Dado que este método es una nueva técnica para el estudio de los canales iónicos, hay una serie de direcciones futuros estudios podrían seguir. En primer lugar, la técnica debe ser utilizado para caracterizar la respuesta de frecuencia de determinados canales aislados. El trabajo adicional también hay que hacer para calibrar la amplitud de la frecuencia de las amplitudes de corriente. Una vez que los canales múltiples se caracterizan individualmente, varios tipos de canal se debe medir de forma simultánea. La técnica también podría ser adaptado para su uso en la abrazadera del potencial de acción, pinzas de corriente, y los estudios de campo de estimulación. Si bien esta es una nueva técnica, que muestra lo que puede ser una poderosa manera de hacer las mediciones electrofisiológicas que anteriormente no eran posibles y proporcionar valiosos nuevos conocimientos sobre el papel fisiológico de los canales iónicos.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud de la subvención número R21-HL094828-01 otorgado al Dr. Poelzing.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matlab | Mathworks | n/a | Natick, MA |
| Clampex 8 | Molecular Devices | Clampex 8 | Sunnyvale, CA |
| Integrating Patch Clamp Amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200 | Sunnyvale, CA |
| Headstage | Molecular Devices | CV202 | Sunnyvale, CA |
| 16-Bit Data Acquisition System | Molecular Devices | Digidata 1322A | Sunnyvale, CA |
| Model Cell | Molecular Devices | Patch 1 Model Cell | Sunnyvale, CA |
References
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).
- Ukomadu, C., Zhou, J., Sigworth, F. J., Agnew, W. S. mu]l Na+ channels expressed transiently in human embryonic kidney cells: Biochemical and biophysical properties. Neuron. 8, 663-676 (1992).
- Abriel, H. Novel Arrhythmogenic Mechanism Revealed by a Long-QT Syndrome Mutation in the Cardiac Na+ Channel. Circ Res. 88, 740-745 (2001).
- Giles, W. R., Imaizumi, Y. Comparison of potassium currents in rabbit atrial and ventricular cells. J Physiol. 405, 123-145 (1988).
- Lee, K. S., Tsien, R. W. Mechanism of calcium channel blockade by verapamil, D600, diltiazem and nitrendipine in single dialysed heart cells. Nature. 302, 790-794 (1983).
- Ozdemir, S. Pharmacological Inhibition of Na/Ca Exchange Results in Increased Cellular Ca2+ Load Attributable to the Predominance of Forward Mode Block. Circ Res. 102, 1398-1405 (2008).
- Zhang, S., Zhou, Z., Gong, Q., Makielski, J. C., January, C. T. Mechanism of Block and Identification of the Verapamil Binding Domain to HERG Potassium Channels. Circ Res. 84, 989-998 (1999).
- Veeraraghavan, R., Poelzing, S. Mechanisms underlying increased right ventricular conduction sensitivity to flecainide challenge. Cardiovasc. Res. 77, 749-756 (2008).
- Goodman, M., Art, J. Positive feedback by a potassium-selective inward rectifier enhances tuning in vertebrate hair cells. Biophysical Journal. 71, 430-442 (1996).
- Han, A., Frazier, A. B. Ion channel characterization using single cell impedance spectroscopy. Lab Chip. 6, 1412-1414 (2006).
- Hayashi, H., Fishman, H. Inward rectifier K+-channel kinetics from analysis of the complex conductance of Aplysia neuronal membrane. Biophysical Journal. 53, 747-757 (1988).
- Millonas, M. M., Hanck, D. A. Nonequilibrium response spectroscopy of voltage-sensitive ion channel gating. Biophys. J. 74, 210-229 (1998).
- Misakian, M., Kasianowicz, J., Robertson, B., Petersons, O. Frequency response of alternating currents through the Staphylococcus aureus alpha-hemolysin ion channel. Bioelectromagnetics. 22, 487-493 (2001).
- Sale, H. Physiological Properties of hERG 1a/1b Heteromeric Currents and a hERG 1b-Specific Mutation Associated With Long-QT Syndrome. Circ Res. 103, 81-95 (2008).
- Blatz, A. L., Magleby, K. L. Quantitative description of three modes of activity of fast chloride channels from rat skeletal muscle. J Physiol. 378, 141-174 (1986).
- Kuo, J. J., Lee, R. H., Zhang, L., Heckman, C. J. Essential role of the persistent sodium current in spike initiation during slowly rising inputs in mouse spinal neurones. The Journal of Physiology. 574, 819-834 (2006).
- Thompson, A. N. Mechanism of potassium-channel selectivity revealed by Na(+) and Li(+) binding sites within the KcsA pore. Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 1317-1324 (2009).
