Summary
가 동시에 여러 이온 채널을 통해 전류 흐름을 측정하는 기술적인 장애가되며, transmembrane 전류 이후 안목 어떤 부분은 각 채널의 종류에 의한 것입니다. 이 필요를 해결하기 위해,이 방법은 특정 주파수 구성 요소를 사용하여 개별 채널 유형의 IV 곡선을 생성하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
소개 : 현재, 동시에 여러 이온 채널 유형을 측정하고 각 채널 유형에 기인 일부로 측정된 전류를 분해 할 정해진 방법이 없습니다. 이 연구는 임피던스 분광가 높은 전압 클램프 실험 기간 동안 측정된 정상 상태 전류 진폭와 연관 특정 주파수를 식별하는 데 사용될 수 있습니다 방법을 보여줍니다. 방법은 전압 단계 프로토콜에 특정 주파수를 포함하는 노이즈 함수를 삽입이 포함됩니다. 제출 작품에서 모델 세포는 더 높은 상관 관계가 더 이온 채널이 존재없는 경우 소음이 기능 자체가 높은 상관 관계를 소개하지 않습니다 또한 전압 클램프 회로에 의해 도입하지 않으며는 것을 입증하는 데 사용됩니다. 기술은 이온 채널을 포함하는 준비를 적용하기 전에이 유효성 검사가 필요합니다. 제출 프로토콜의 목적은 노이즈 함수에 단일 이온 채널 형식의 주파수 응답을 특성화하는 방법을 보여줍니다하는 것입니다. 특정 주파수가 개별 채널 유형 확인되고 나면, 그들은 정상 상태 전류 전압 (IV) 곡선을 재현하는 데 사용할 수 있습니다. 높은 하나의 채널 유형 상관 관계와 최소한 다른 채널 유형과 상관 관계 주파수는 다음 동시에 측정 다중 채널 형식의 현재의 기여를 평가하는 데 사용할 수 있습니다.
방법 : 전압 클램프 측정은 표준 전압 단계 프로토콜 (-150에 50 뮤직 비디오, 5mV 단계)을 사용하여 모델의 세포에서 수행되었다. 1-15 kHz에서 주파수 (최대 amplitudes에 제로 : 50 또는 100mV)의 동등 magnitudes를 포함하는 노이즈 함수는 각 전압 단계에 삽입되었다. 출력 신호의 고속 푸리에 변환 (FFT)의 실제 구성 요소와 각 단계에 잠재력에 대한 잡음없이 계산했다. 전압 단계의 함수로 각 주파수의 크기는 해당 전압에서 전류 진폭과 상관했다.
결과 및 결론 : 소음이없는 (제어), DC 구성 요소를 제외한 모든 주파수의 magnitudes 상관이 저조한 (| R | <0.5) IV 곡선과 DC 구성 요소가 모든 측정에서 0.999 이상의 상관 계수를했다 반면. 노이즈 기능이 전압 단계 프로토콜에 추가되었을 때 각각의 주파수와 IV 곡선 사이의 상관 관계의 품질은 변경되지 않았다. 마찬가지로, 노이즈 함수의 진폭을 증가하면 상관을 증가하지 않았다. 제어 측정 자체적으로 전압 클램프 회로가 0 Hz에서 위의 모든 주파수가 높은 정상 상태 IV 곡선와 연관시키는 원인이되지 않는다는 것을 보여줍니다. 마찬가지로, 노이즈 함수의 존재에 측정 노이즈 기능이 더 이온 채널이 존재없는 경우 0 Hz에서 위의 모든 주파수가 정상 상태 IV 곡선와 연관시키는 원인이되지 않는다는 것을 보여줍니다. 이 검증을 바탕으로, 방법은 지금 amplitudes 해당 채널의 유형과 특별히 상관 관계 식별 주파수의 목적으로 단일 이온 채널 유형을 포함하는 준비를 적용할 수 있습니다.
Protocol
1. 소음 기능 및 입력 신호를 준비
- 원하는 주파수 구성 요소를 포함하는 노이즈 함수를 만듭니다. 이것은 주파수 영역에서 원하는 주파수 구성 요소를 설명하는 다음 역 고속 푸리에 변환을 계산하여 수행할 수 있습니다. 본 연구에서는 1 - 15 kHz에서 사용되었다. 모든 푸리에 변환이 연구에서 설명하는 역 푸리에 변환은 Matlab의 FFT 및 IFFT 함수를 사용하여 계산되었다.
- 적절하게 노이즈 함수의 진폭을 크기. 본 연구에서는 노이즈 함수는 노이즈 함수의 진폭을 최대로 제로가 50 또는 100 MV 것을 같은 크기를 조정했습니다.
- 사용중인 수집 소프트웨어에 대한 적절한 방법을 사용하여 자극 파일을 만듭니다. Clampex 8, 먼저 적당한 헤더와 텍스트 파일을 만듭니다. 머리글 아래의 첫 번째 열에 하나의 청소를위한 시간 증가를 삽입합니다. 시간 단위는 측정에 사용되는 샘플링 간격과 같은 시간적 간격이 있어야합니다. 전압 단계 프로토콜의 각 스위프 각 시간 단계에서 원하는 정확한 전압을 삽입합니다. 이것은 노이즈 함수를 포함해야합니다.
2. 전압 클램프 측정을 수행
- 이전에 생성된 자극 파일과 호환됩니다 수집 소프트웨어 내에서 측정 프로토콜을 만듭니다. Clampex에서는 사용자가 현재 프로토콜 자극 파일을 연결할 수있는 메뉴가 있습니다.
- 측정 장비에 세포 모델 (또는 생물학) 연결합니다.
- 예정대로 실험을 수행합니다. 제어 목적을 위해, 모든 노이즈 함수를 포함하지 정기적인 측정을 포함해야합니다.
3. 포스트 실험 분석
- 개인 기록에 대한 IV 곡선을 계산합니다. 녹음이 노이즈 기능이 적용되어 안정적인 상태에있는 경우, IV 곡선은 temporally 노이즈 함수의 범위 밖 녹음의 안정 상태 부분을 사용하여 만들 수 있습니다. 녹음이 안정 상태에 있지 않은 경우, 소음 기능이 IV 곡선의 계산을 방해할 수있는 두 번째 녹음이 존재하는 노이즈 기능없이해야한다.
- 녹음의 각 전압 단계에 대한 고속 푸리에 노이즈 함수를 삽입했던 녹음 부분의 변환을 계산합니다. amxn m는 FFT의 주파수의 숫자 매트릭스, 그리고 N으로 각 전압 단계에 대한 푸리에 변환을 결합하는 것은 전압 단계의 번호입니다. 이 구성에서는 행렬의 각 행이 실험의 모든 전압 단계에서 단일 주파수의 진폭을 나타냅니다.
- 각 주파수 (위의 행렬의 각 행이 IE) 3.1에서 생성된 IV 곡선으로 행을 상관 관계 및 상관 계수를 기록합니다.
- 높은 IV 커브와 연관 주파수를 시각화하기 위해 상관 계수 대 주파수를 플롯. DC 구성 요소는 FFT의 첫 번째 주파수에 포함된이므로이 주파수에 대한 상관 계수는 항상> 0.99되어야합니다.
4. 대표 결과 :
대표 전압 클램프 측정은하지 않고 (그림 1A) 및 전압 단계 프로토콜에 삽입 (그림 1B) 노이즈 기능 모델 셀에 표시됩니다. IV 곡선도 모델 세포 (그림 1C)를 계산했습니다. 각 스위프 들어, 그림 1에서 기록에서 FFT는 노이즈 함수를 삽입했던 시간 프레임 (그림 1A, 1B에 빨간색 상자 참조)를 통해 계산되었다. 그림 2A와 2B는 각각 그림 1A와 1B에 표시된 레코딩 계산 FFTs를 보여줍니다. 육안 검사시 DC 구성 요소 (빨간색으로 강조) IV 곡선의 모양을 모방하기 위해 나타납니다. 소음없는 함수, DC 위의 모든 주파수가 제로 (그림 2A) 근처 amplitudes을 가지고 나타납니다. 노이즈 함수가 삽입되면, 1 kHz에서 15 사이의 주파수는 시각적으로 눈에 띄는 amplitudes (그림 2B)를했습니다. 그림 3은 IV 곡선에 대한 전압 단계의 범위 개별 주파수 amplitudes을 연관의 결과를 보여줍니다. 그림 3A - C는 실험이 제어 조건 (없음 소음 기능)에 따라 각각 50과 100 뮤직 비디오의 노이즈 amplitudes와 함께 끝났다고 상관 계수를 보여줍니다. 모든 경우에 공지 사항, DC 구성 요소는 IV 곡선과 거의 완벽하게 연관시키는가 나타납니다. 사실, 모든 레코딩을 위해,이 주파수에 대한 상관 계수는 0.99 (R = 0.9996 ± 1E - 5, 말은 ± 표준 편차)보다되었습니다. 우리가 그림 3A (제어 조건)에 보면, 진폭 크게 IV 커브와 상호 DC 구성 요소 이외에는 주파수가 없습니다. 특히,이 주파수의 아무도는 0.5 이상의 상관 계수가 없습니다. 가장 낮은 진폭 노이즈 기능 (50 뮤직 비디오) 삽입시이 같은 주파수는 아직 0.5 이상의 상관 계수가 덜했다. 에 대한 상관 계수노이즈 진폭 100 뮤직 비디오로 증가되었을 때 SE 주파수는 0.5보다 큰이 없어요.
. 그림 1 모델 셀 레코딩 : 전압 클램프 레코딩을하지 않고 (1A) 및 전압 단계 프로토콜에 포함 (1B) 노이즈 기능 모델 셀에 표시됩니다. 각 스위프의 첫 번째와 지난 20 MS에 대한, 가능성이 개최 가능성 (0 MV)에서 유지되었다. 각 전압 단계 80 MS 길이었고, 소음 기능 단계의 시작 후 40 MS를 삽입했습니다. 노이즈 함수는 30 MS의 기간을했다 1 15 kHz에서 사이의 주파수가 포함되어 있습니다. 전압이 서있는 다섯 MV 단위 -150에 50 MV를 강화했다. 모델 세포에 대한 IV 곡선도 (1C) 표시됩니다. 읽기 레코딩을보다 쉽게하기 위해, 오직 모든 다섯째 청소는 1A 및 1B에 포함되었지만, 모든 감시 장치는 1C에 포함되었습니다.
그림 2 레코딩 FFT :. FFT는 노이즈 함수 (그림 1A에 빨간색 상자 1B에 묶여 지역) 삽입하기 위해 각 스위프의 30 MS 부분에 대한 계산했다. 그림 2A와 2B는 FFTs가 각각 소음 기능없이 함께 계산 보여줍니다. 다시 한번, 명확성을 위해, 모든 다섯째 수색에서만 FFT는 그림에 포함되어 있지만, 모든 감시 장치는 앞으로 계산에 사용되었다.
. 그림 3 IV 주파수 상관 관계 : 녹음의 IV 곡선 및 전압 단계의 범위에서 각각의 주파수의 진폭 사이의 상관 관계의 결과가 표시됩니다. 그림 1A - 1C는 각각 제어 조건 하에서 0에서 20 kHz에서하는 주파수에 대한 50 또는 100 MV 노이즈 기능의 존재의 상관 계수를 보여줍니다.
그림 4 IV 곡선의 재 창조 :. 모델 세포 (그림 1C와 같음) 두 주파수의 크기에 대한 IV 곡선이 겹쳐 있었다. 첫 번째 주파수는 DC 성분 (R = 0.995)이었고, 두 번째는 낮은 상관 관계 (R = 0.3212)으로 무작위로 선택된 주파수했다. 주파수 amplitudes는 IV 곡선으로 거의 같은 진폭을 축소했다.
Discussion
현재 나중에 각 채널 유형에 기인한다 얼마나 많은 전류 결정의 의도와 동시에 여러 이온 채널 유형을 측정 연구자 방지 기술 장애가 있습니다. 때문에 이러한 제한의 이온 채널은 일반적으로 같은 전압, 전류 및 행동 잠재력을 클램프로 기술을 사용하여 개별적으로 연구하고 있습니다. 1 개별 채널 유형, heterologous 표현 시스템이 자주 사용하는 연구를합니다. 2 등 cardiomyocytes과 같은 조직에서 분리된 세포와 작업하는 경우 다른 수단은 다양한 이온 채널을 차단하는 데 사용해야합니다. 예를 들어, 나트륨 채널이 느린 depolarizing 전압 램프에 의해 inactivated 수있는 3 내향 정류 칼륨 채널은 세포 BaCl2와 차단할 수, 4, 칼슘 채널 verapamil을 사용하여 차단할 수 5.
부분적으로이 제한을 극복 사용하는 한 가지 방법은 선택적으로 적절한 에이전트 하나의 채널 유형을 차단 후 측정을 반복 동시에 다음 두 채널 유형을 통해 현재의 유량을 측정하는 것입니다. 두 측정 뺄셈 그 다음 차단했습니다 채널 유형에 전류 기인의 양을 추정하는 데 사용할 수 있습니다. 6 단,이 방법을 두 가지 주요 한계가 있습니다. 첫째, 화학 약품이 선택 각각의 이온 채널을 차단할 수 파악, 일부 널리 사용되는 약물은 다른 채널 유형이 아닌 구체적인 상호 작용이되지 않았습니다. 5,7 둘째, 그것은 하나의 채널이 다른가 변조 여부를이 기술에서 결정 수 없습니다 채널. 예를 들어, 우심실에서 상위 Kir 2.1 표현식이 전도 속도를 depresses 이러한, NAV 1.5 Kir 2.1의 이질적인 표현은 실험용 돼지 심실에 표시하고 있으며, 그것은 시너지 관계가 두 채널 사이에 존재하는 것을 제안했습니다. 현재 8 , 이것은 확인할 수 없습니다.
본 연구에서는, 우리는 그 임피던스 분광 동시에 측정한 여러 이온 채널 유형을 공부를위한 유용한 도구가 될 수 있습니다 제안합니다. 제출 방법가 동시에 측정이 채널 유형에서 전류를 분별하는 데 사용되는 적이 있지만, 임피던스 분광은 이온 채널 기능의 다른 측면의 숫자를 연구하는 데 사용되었습니다. 굿맨 예술 현재 클램프 프로토콜이 서로 다른 주파수로 세포를 조정하도록 수정하고, transmembrane 잠재력의 oscillations가 안으로 정류 K + 채널과 칼슘 2 + 채널 사이의 상호 작용에 의한 수있는 거북이 청각 세포를 사용했다. 9 한나라와 프레 이저는 임피던스가 주파수의 넓은 범위 (100 Hz에서 5 MHz의) 이상의 단일 셀에 측정할 수 시연하고, K + 또는 칼슘 2 + 채널 차단되었습니다가 간단한 의미가 있었을 때 임피던스의 증가가 관찰 높은 처리량 약물 화면에서 채널 블록을 감지하면. 10 하야시와 피쉬맨은 내향 정류 K + 채널. 11 다른 그룹은 다른 채널 형식의 전압 클램프 프로토콜에 단일 주파수를 삽입하고 있습니다의 운동 특성을 공부하고 복잡한 도전을 사용한 것은 보여주 그 관찰 주파수 응답은 어떤 주파수 아니라 다른 사람에 대한 예상 응답 하였다. 12,13 Millonas과 Hanck 어떤 주파수는 예상 반응은 마르코프 모델에서 여러 속도 상수의 존재는 생성하지 않은 이유를 제안했습니다. 이러한 12 연구, 뿐만 아니라 다른 사람으로 임피던스 분광법을 사용하면서 이온 채널의 측정 이온 전류가 이론적으로 주파수 응답 동의하지 않는 경우가있다는 것을 증명하고있다. 본 연구에서는 메서드의 목적은 멤브레인 전기 회로의 기본 가정 독립 현재 진폭과 상관 관계 주파수를 식별할 수 있기 때문에 이것은 본 연구에서는 문제가되지 않습니다. Furtheremore는 현재의 진폭은 그들에 삽입된 모든 노이즈 함수를하지 않는 기록의 일부에서 계산됩니다. 다른 연구의 숫자는 또한 수많은 이온 채널의 현재 모델은 모두 자신의 속도 상수와 다수의 실시와 비 전도 상태를 전시. 14,15,16 톰슨 외가 KcsA 채널의 선택도 필터가 나에 대해 다른 바인딩 사이트를 가지고 것으로 나타났다 + 리가 + 및 K +, 그리고 선택도 필터를 통해 이온 이동으로 다른 하나의 구속력이 사이트에서 이동의 활기찬 비용이 채널은 우선적으로 그 구멍을 통해 K + 이온을 실시하는 이유가 무엇입니까합니다. 17 본 논문에서 우리는 범위를 삽입 전압 단계 프로토콜로 주파수 (소음 기능)과 그의 진폭 높은 전반적인 현재의 진폭과 주파수 상관 관계에 대한 보았다. 강력한 증거가 제시 제시되어 있기 때문에 여러 속도 상수는 differen을 통해 이온의 전도에 역할을t 채널, 이러한 속도 상수와 관련된 주파수의 도입은 특정 주파수가 울려 또는 높은 달리하지 않았을 현재의 진폭,와 연관시키는 원인이 될 수 있습니다. 본 연구에서 보여준 기술은 일반적으로 전압 클램프 회로 및 수집 장비를 테스트하는 데 사용되는 병렬 RC 회로는 모델 세포에 수행됩니다. 이것은 DC 이외의 모든 주파수가 현재의 크기와 연관 것이라고 예상하고, 이것은 우리가 데이터에 표시됩니다. 우리는 또한 노이즈 함수의 또한 어떤 주파수가 높은 현재의 진폭와 연관시키는 원인이 아니라고 표시됩니다. 그들은 측정 장비와 소음 기능 어떤 주파수는 현재 진폭와 연관시키는 원인이 스스로하지 표시하기 때문입니다이 두 연구 결과는 중요합니다. 미래 연구 이온 채널을 포함하는 세포막을 사용하여 측정을하면, 그것은 사용하는 채널에 따라 선택도 필터 또는 아마도 구멍에서 속도 상수에 해당하는 주파수는 채널의 주파수 응답에 영향을하고 주파수가 높은 갖고있는 영향을 미칠 것이다 것으로 기대된다 현재 진폭 또는 낮은 상관 관계.
이 방법은 이온 채널을 연구하기위한 새로운 기술이기 때문에, 미래의 연구 방향에 따라 수의 숫자가있다. 첫째, 기술은 특정 격리 채널의 주파수 응답을 특성화하는 데 사용해야합니다. 추가 작업은 또한 현재 amplitudes에 주파수 amplitudes를 보정하기 위해 완료해야합니다. 여러 채널을 개별적 특징되면, 다중 채널 형식은 동시에 측정해야합니다. 이 기술은 또한 잠재적인 행동 클램프, 현재 클램프 및 현장 자극 연구에 사용하기 위해 적응 수 있습니다. 이 새로운 기술이지만, 그것은 이전에 불가능했다 electrophysiological 측정하고 이온 채널의 생리적 역할에 가치있는 새로운 통찰력을 제공하는 강력한 방법이 될 수 있습니다 무엇 보여줍니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 박사 Poelzing에게 수여 보건 부여 번호 R21 - HL094828 - 01의 국립 연구소에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matlab | Mathworks | n/a | Natick, MA |
| Clampex 8 | Molecular Devices | Clampex 8 | Sunnyvale, CA |
| Integrating Patch Clamp Amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200 | Sunnyvale, CA |
| Headstage | Molecular Devices | CV202 | Sunnyvale, CA |
| 16-Bit Data Acquisition System | Molecular Devices | Digidata 1322A | Sunnyvale, CA |
| Model Cell | Molecular Devices | Patch 1 Model Cell | Sunnyvale, CA |
References
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).
- Ukomadu, C., Zhou, J., Sigworth, F. J., Agnew, W. S. mu]l Na+ channels expressed transiently in human embryonic kidney cells: Biochemical and biophysical properties. Neuron. 8, 663-676 (1992).
- Abriel, H. Novel Arrhythmogenic Mechanism Revealed by a Long-QT Syndrome Mutation in the Cardiac Na+ Channel. Circ Res. 88, 740-745 (2001).
- Giles, W. R., Imaizumi, Y. Comparison of potassium currents in rabbit atrial and ventricular cells. J Physiol. 405, 123-145 (1988).
- Lee, K. S., Tsien, R. W. Mechanism of calcium channel blockade by verapamil, D600, diltiazem and nitrendipine in single dialysed heart cells. Nature. 302, 790-794 (1983).
- Ozdemir, S. Pharmacological Inhibition of Na/Ca Exchange Results in Increased Cellular Ca2+ Load Attributable to the Predominance of Forward Mode Block. Circ Res. 102, 1398-1405 (2008).
- Zhang, S., Zhou, Z., Gong, Q., Makielski, J. C., January, C. T. Mechanism of Block and Identification of the Verapamil Binding Domain to HERG Potassium Channels. Circ Res. 84, 989-998 (1999).
- Veeraraghavan, R., Poelzing, S. Mechanisms underlying increased right ventricular conduction sensitivity to flecainide challenge. Cardiovasc. Res. 77, 749-756 (2008).
- Goodman, M., Art, J. Positive feedback by a potassium-selective inward rectifier enhances tuning in vertebrate hair cells. Biophysical Journal. 71, 430-442 (1996).
- Han, A., Frazier, A. B. Ion channel characterization using single cell impedance spectroscopy. Lab Chip. 6, 1412-1414 (2006).
- Hayashi, H., Fishman, H. Inward rectifier K+-channel kinetics from analysis of the complex conductance of Aplysia neuronal membrane. Biophysical Journal. 53, 747-757 (1988).
- Millonas, M. M., Hanck, D. A. Nonequilibrium response spectroscopy of voltage-sensitive ion channel gating. Biophys. J. 74, 210-229 (1998).
- Misakian, M., Kasianowicz, J., Robertson, B., Petersons, O. Frequency response of alternating currents through the Staphylococcus aureus alpha-hemolysin ion channel. Bioelectromagnetics. 22, 487-493 (2001).
- Sale, H. Physiological Properties of hERG 1a/1b Heteromeric Currents and a hERG 1b-Specific Mutation Associated With Long-QT Syndrome. Circ Res. 103, 81-95 (2008).
- Blatz, A. L., Magleby, K. L. Quantitative description of three modes of activity of fast chloride channels from rat skeletal muscle. J Physiol. 378, 141-174 (1986).
- Kuo, J. J., Lee, R. H., Zhang, L., Heckman, C. J. Essential role of the persistent sodium current in spike initiation during slowly rising inputs in mouse spinal neurones. The Journal of Physiology. 574, 819-834 (2006).
- Thompson, A. N. Mechanism of potassium-channel selectivity revealed by Na(+) and Li(+) binding sites within the KcsA pore. Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 1317-1324 (2009).
