Summary
Det finns tekniska hinder för att mäta nuvarande flödet genom flera jon kanaler samtidigt, och senare kräsna hur stor del av transmembrana aktuella beror på att varje kanal typ. För att möta detta behov utgör denna metod ett sätt att generera IV kurvan för enskilda kanaler typer med specifika frekvenser komponenter.
Abstract
INLEDNING: För närvarande finns inga etablerade metoder för att mäta flera typer jonkanal samtidigt och förmultnar den uppmätta strömmen i portioner hänförligt till varje kanal typ. Denna studie visar hur impedans spektroskopi kan användas för att identifiera specifika frekvenser som starkt korrelerar med steady state strömamplituden uppmätts under spänning klämma experiment. Metoden innebär att föra in en ljud-funktionen innehåller specifika frekvenser till spänningen steg protokollet. I de presenterade arbetet är en modell cell som används för att visa att inga höga korrelationer införs av spänningen klämma kretsar, och även att ljudet fungerar i sig inte medför några höga korrelationer när inga jonkanaler är närvarande. Denna validering är nödvändig innan tekniken kan tillämpas på preparat som innehåller jonkanaler. Syftet med den presenterade protokollet är att visa hur man karakterisera frekvensgång av en enda jonkanal typ till ett ljud funktion. När specifika frekvenser har identifierats i en enskild kanal typ, kan de användas för att återge den stationära likström (IV) kurva. Frekvenser som starkt korrelerar med en kanal typ och minimalt korrelerar med andra kanalen typer kan sedan användas för att uppskatta den nuvarande bidrag av flera kanaler typer mäts samtidigt.
METODER: Spänning klämma Mätningarna utfördes på en modell cell med hjälp av ett standardprotokoll spänningen steg (-150 till +50 mV, 5mV steg). Brusfunktioner innehåller lika omfattningen av 1-15 kHz (noll-till-topp amplitud: 50 eller 100mV) sattes in i varje spänningen steg. Den verkliga delen av Fast Fourier Transform (FFT) för utsignalen har beräknats med och utan ljud för varje steg potential. Omfattningen av varje frekvens som en funktion av spänningen steg var korrelerad med den aktuella amplituden på motsvarande spänningar.
Resultat och slutsatser: I avsaknad av buller (kontroll), omfattningen av alla frekvenser utom DC-komponenten korrelerade dåligt (| R | <0,5) med IV-kurvan, medan DC-komponenten hade en korrelationskoefficient större än 0,999 i alla mätningar. Kvaliteten på korrelationen mellan enskilda frekvenser och IV kurvan inte förändras när ett ljud funktion lades till spänningen steg protokollet. Likaså ökar amplituden för buller fungerar inte heller ökad korrelation. Kontrollmätningar visar att spänningen klämma kretsarna i sig inte orsakar några frekvenser över 0 Hz till starkt korrelera med steady-state IV kurva. Likaså mätningar i närvaro av brus funktion visar att bullret fungerar inte orsakar några frekvenser över 0 Hz att korrelera med steady-state IV kurvan när inga jonkanaler är närvarande. Baserat på denna kontroll, kan metoden nu tillämpas på preparat som innehåller en enda typ jonkanal med avsikt att identifiera frekvenser vars amplituder korrelerar specifikt med den kanalen typ.
Protocol
1. Förbered Buller Funktion och insignal
- Skapa en ljud-funktionen innehåller önskad frekvens komponenter. Detta kan göras genom att beskriva den önskade frekvensen komponenterna i frekvensplanet och sedan beräknar den inversa snabba Fouriertransformen. I denna studie, 1 - 15 kHz användes. Alla Fouriertransformer och invers Fouriertransform beskrivs i denna studie har beräknats med hjälp av Matlabs FFT och IFFT funktioner.
- Skala amplituden på ljudet fungerar korrekt. I denna studie ljudet funktionen skalas så att noll-till-topp amplitud av buller funktion var 50 eller 100 mV.
- Skapa ett stimulus fil med hjälp av metoder som är lämpliga för förvärvet programvara som används. För Clampex 8 skapar du först en textfil med lämplig rubrik. Under rubriken sätter tiden steg för en enda svep i den första kolumnen. Tiden steg ska ha samma tidsmässiga avståndet som samplingsintervallet användas vid mätningarna. För varje sopa i spänningen steg protokollet sätter in exakta spänningar önskad vid varje tidssteg. Detta bör omfatta buller funktion.
2. Utför Spänning Clamp Mått
- Skapa ett mätprotokoll inom förvärvet programvara som är kompatibel med den stimulans fil som genereras tidigare. I Clampex finns det en meny som låter användaren att associera ett stimulus fil med det aktuella protokollet.
- Bifoga en modell (eller biologiska) cell till mätutrustningen.
- Utför experimentet som planerat. För kontroll, se till att inkludera periodiska mätningar som inte innehåller något ljud funktioner.
3. Inlägg Experiment Analys
- Beräkna IV kurvan för en enskild inspelning. Om inspelningen är vid steady state och ljudet funktionen används, kan IV kurvan skapas med en steady-state del av inspelningen tidsmässigt utanför området av buller funktion. Om inspelningen var inte steady-state kan ljudnivån funktionen störa beräkning av IV-kurvan, så en andra inspelning ska göras utan det buller funktionen närvarande.
- För varje spänningen steg i en inspelning beräkna den snabba Fouriertransformen av den del av inspelningen där bullret funktionen in. Kombinera Fouriertransformen för varje spänningen steg in amxn matris, där m är antalet frekvenser i FFT, och n är antalet spänningen steg. I denna konfiguration är varje rad i matrisen amplituden av en enda frekvens på alla spänningsnivåer steg i experimentet.
- För varje frekvens (dvs varje rad i ovanstående matris) korrelerar raden med IV-kurvan som genereras i 3,1 och spela korrelationskoefficienten.
- Plotta sambandet frekvens koefficienten vs att visualisera frekvenser som i hög grad korrelerar med IV-kurvan. Eftersom DC-komponent som finns inom de första frekvensen av FFT bör korrelationskoefficienten för denna frekvens alltid vara> 0,99.
4. Representativa resultat:
Representant spänningen klämma mätningar visas för en modell cell utan (Figur 1A) och med (Figur 1B) ett buller funktion sätts in i spänningen steg protokollet. Den IV kurvan beräknades också för modellen cellen (Figur 1C). För varje svep, i inspelningar från Figur 1, var FFT beräknas under den tid där bullret funktionen sattes in (se röda rutan i figur 1A, 1B). Siffror 2A och 2B visar FFT beräknas för de inspelningar som visas i figur 1A och 1B, respektive. Vid visuell inspektion, visas DC-komponent (markerade i rött) att efterlikna formen på IV-kurvan. Utan buller funktionen, alla frekvenser över DC verkar ha amplituder nära noll (Figur 2A). När bullret Funktionen infogas, frekvenser mellan 1 och 15 kHz har visuellt märkbara amplituder (Figur 2B). Figur 3 visar resultatet av korrelera enskilda frekvens amplituder över spänningsområdet åtgärder mot IV kurvan. Figur 3A-C visar korrelationskoefficienterna när försöket gjordes under kontroll förhållanden (inget buller funktion) och med buller amplitud på 50 och 100 mV, respektive. Lägg märke i alla fall tycks DC-komponenten att korrelera nästan perfekt med IV-kurvan. Faktum är att för alla inspelningar var korrelationskoefficienten för denna frekvens större än 0,99 (R = 0,9996 ± 1E-5, medelvärde ± standardavvikelse). När vi tittar på figur 3A (kontroll villkor) finns det inga frekvenser förutom DC-komponent vars amplitud signifikant korrelerar med IV-kurvan. Specifikt ingen av dessa frekvenser har korrelationskoefficienter högre än 0,5. Efter införandet av de lägsta amplitud buller funktion (50 mV), hade dessa samma frekvenser ändå korrelationskoefficienter mindre än 0,5. Den korrelationskoefficienter förSE frekvenser inte heller bli större än 0,5 när bullret amplitud ökades till 100 mV.
. Figur 1 Modell Cell Inspelningar: Spänning klämma inspelningar visas för en modell cell utan (1A) och med (1B) ett brus funktion som finns i spänningen steg protokollet. För första och sista 20 ms för varje svep, var potentiella hållits på jordbruksföretaget potentiella (0 mV). Varje spänningen steg var 80 ms lång, och ljudet fungerar sattes in 40 ms efter början av steget. Bullret funktion hade en varaktighet på 30 ms och innehöll frekvenser mellan 1 och 15 kHz. Spänning var steg tillbaka, -150 till +50 mV i 5 mV steg. En IV kurva för modellen cellen visas också (1C). För att göra inspelningar lättare att läsa, var bara var femte sveper ingår i 1A och 1B, men alla sveper ingick i 1C.
Figur 2 FFT över inspelningar:. FFT beräknades för de 30 ms del av varje svep där bullret funktion är att införas (det område som begränsas av den röda rutan i figurerna 1A, 1B). Siffror 2A och 2B visar FFT beräknas utan och med ljud funktion, respektive. Än en gång, för tydlighetens skull, är bara FFT från var femte sveper med i figuren, men alla sveper användes i framtida beräkningar.
. Figur 3 IV Frekvens Korrelationer: Resultaten av korrelationer mellan IV kurvan för en inspelning och amplituden på enskilda frekvenser över spänningsområdet steg visas. Siffror 1A - 1C visar korrelationskoefficienten för frekvenser från 0 till 20 kHz under kontroll förhållanden och i närvaro av 50 eller 100 mV brusfunktioner, respektive.
Figur 4 återskapande av IV Curve:. Den IV-kurvan för modellen cell (samma som figur 1C) och omfattningen av två frekvenser överlagras. Den första frekvensen var den DC-komponent (R = 0,995), och den andra var en slumpmässigt vald frekvens med låg korrelation (R = 0,3212). Frekvensen amplituder skars till ungefär samma amplitud som IV-kurvan.
Discussion
Det finns tekniska hinder som för närvarande hindrar forskare från att mäta flera typer jonkanal samtidigt med avsikt att senare bestämma hur mycket ström bör tillskrivas varje kanal typ. På grund av denna begränsning, är jonkanaler oftast studeras individuellt med hjälp av tekniker såsom spänning, ström och aktionspotential klämma. 1 Att studera enskild kanal typer, heterologa uttryck system används ofta. När du arbetar med celler som isolerats från vävnad, såsom cardiomyocytes 2 måste andra medel användas för att blockera olika jonkanaler. Till exempel kan natrium kanaler inaktiveras av en långsam depolariserande spänningsramp kan 3 inåt åtgärda kaliumkanaler blockeras med extracellulärt BaCl2, 4 och kalcium kanaler kan spärras med hjälp av verapamil. 5
En metod som används som delvis överbryggar denna begränsning är att mäta nuvarande flödet genom två kanaler typer samtidigt, sedan upprepa mätningen efter att selektivt blockera en kanal typ med en lämplig agent. Subtraktion av de två mätningarna kan sedan användas för att uppskatta hur mycket ström kan hänföras till den kanal som blockerats. Det finns dock två viktiga begränsningar för denna teknik 6. Först har kemiska medel inte identifierats som selektivt kan blockera varje jonkanaler, och vissa används allmänt droger har icke-specifika interaktioner med andra kanaler typer. 5,7 det andra kan det inte fastställas utifrån denna teknik om en kanal moduleras av en annan kanal. Till exempel har heterogena uttryck av NAV 1,5 och Kir 2,1 visats i marsvin ventriklar, och det har föreslagits att en synergistisk förhållande mellan de två kanalerna, så att högre Kir 2,1 uttryck i höger kammare trycker ned överledning hastighet. 8 närvarande Detta kan inte verifieras.
I denna studie föreslår vi att impedansspektroskopi kan vara ett användbart verktyg för att studera olika typer av jonkanaler mäts samtidigt. Även om metoden som presenteras aldrig har använts för att urskilja strömmar från två kanaler typer mäts samtidigt har impedansspektroskopi använts för att studera ett antal andra aspekter av jonkanaler funktion. Goodman och konst visade med sköldpadda celler auditiva hår som strömtång protokoll kan modifieras för att ställa en cell till olika frekvenser och svängningar i transmembrana potential beror på ett samspel mellan en aktiv åtgärda K +-kanal och en Ca 2 +-kanal. 9 Han och Frazier visat att impedansen kan mätas i en enda cell över ett brett spektrum av frekvenser (100 Hz till 5 MHz), och ökningen av impedansen observerades när K + och Ca 2 + kanaler blockerades kan vara ett enkelt sätt att upptäcka kanalen block i höga skärmar genomströmning drog. 10 Hayashi och Fishman har använt komplex konduktans för att studera kinetiska egenskaper för en inre åtgärda K +-kanal. 11 Andra grupper har satt in en enda frekvens i spänningen klämma protokollet av olika kanaler typer och visade att observerade frekvensomfång överens med den förväntade respons för vissa frekvenser men inte andra. 12,13 Millonas och Hanck föreslog anledning till att vissa frekvenser gav inte det förväntade svaret är närvaron av flera räntesatser konstanter i Markov-modell. 12 studier som dessa, liksom andra, har visat att det finns tillfällen när jonströmmar mätt från jonkanaler medan du använder impedansspektroskopi inte håller med den teoretiska frekvensomfång. Detta är inte ett problem i denna studie, eftersom syftet med metoden i denna studie är att identifiera frekvenser som korrelerar med den aktuella amplituden oberoende av de underliggande antagandena av membranet elektriska kretsen. Furtheremore är strömamplituden beräknas från delar av de inspelningar som inte har någon brusfunktioner in i dem. En rad andra studier också presentera modeller av många jonkanaler uppvisar många ledande och icke-överledning stater alla med sina egna hastighetskonstanterna. 14,15,16 Thompson et al visade att selektivitet filtret i KcsA kanalen har olika bindningsställen för Na +, Li + och K +, och den energiska kostnaden för att övergå från ett bindningsställe till en annan som en jon rör sig genom selektivitet filtret är det som gör kanalen företrädesvis bedriva K + joner genom sina porer. 17 I detta papper har vi satt in en rad av frekvenser (buller funktion) till en spänning steg protokoll och såg för frekvenser vars amplitud starkt korrelerar med den övergripande strömamplituden. Eftersom stark bevisning har lagts fram som tyder på multipel hastighetskonstanter spela en roll i ledning av joner genom differentieringT-kanaler, införandet av frekvenser i samband med dessa hastighetskonstanter kan orsaka vissa frekvenser att vibrera eller mycket korrelerar med den aktuella amplitud, som inte skulle ha annars. Tekniken visade i denna studie utförs på en modell cell, som är en parallell RC-krets som vanligtvis används för att testa spänningen klämma kretsar och förvärv utrustning. Det förväntas inte att alla frekvenser förutom DC skulle korrelera med nuvarande omfattning, och detta visas i våra data. Vi visar också att tillägg av ljudet fungerar inte orsaka några frekvenser till mycket korrelera med den nuvarande amplitud. Dessa två fynd är viktiga eftersom de visar att mätutrustningen och buller fungerar inte i sig orsaka några frekvenser att korrelera med den nuvarande amplitud. När framtida studier göra mätningar med hjälp av membran som innehåller jonkanaler, förväntas, beroende på vilken kanal, kommer frekvenser som motsvarar hastighetskonstanterna i selektivitet filtret eller möjligen pore påverka frekvensgången av kanalen och påverka vilka frekvenser har höga eller låg korrelation med nuvarande amplitud.
Eftersom denna metod är en ny teknik för att studera jonkanaler, det finns ett antal riktningar framtida studier kunde följa. Först ska tekniken användas för att karaktärisera frekvensgång av specifika isolerade kanaler. Ytterligare arbete behöver också göras för att kalibrera frekvens amplituder till den aktuella amplituder. När flera kanaler karaktäriseras individuellt, bör flera kanaler typer mätas samtidigt. Tekniken kan också anpassas för användning i aktionspotentialen klämma, strömtång och fältstudier stimulans. Även om detta är en ny teknik, det visar vad som kan vara ett kraftfullt sätt att göra elektrofysiologiska mätningar som tidigare inte var möjligt och ge nya värdefulla insikter i den fysiologiska roll jonkanaler.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health licensnummer R21-HL094828-01 tilldelades Dr Poelzing.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matlab | Mathworks | n/a | Natick, MA |
| Clampex 8 | Molecular Devices | Clampex 8 | Sunnyvale, CA |
| Integrating Patch Clamp Amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200 | Sunnyvale, CA |
| Headstage | Molecular Devices | CV202 | Sunnyvale, CA |
| 16-Bit Data Acquisition System | Molecular Devices | Digidata 1322A | Sunnyvale, CA |
| Model Cell | Molecular Devices | Patch 1 Model Cell | Sunnyvale, CA |
References
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).
- Ukomadu, C., Zhou, J., Sigworth, F. J., Agnew, W. S. mu]l Na+ channels expressed transiently in human embryonic kidney cells: Biochemical and biophysical properties. Neuron. 8, 663-676 (1992).
- Abriel, H. Novel Arrhythmogenic Mechanism Revealed by a Long-QT Syndrome Mutation in the Cardiac Na+ Channel. Circ Res. 88, 740-745 (2001).
- Giles, W. R., Imaizumi, Y. Comparison of potassium currents in rabbit atrial and ventricular cells. J Physiol. 405, 123-145 (1988).
- Lee, K. S., Tsien, R. W. Mechanism of calcium channel blockade by verapamil, D600, diltiazem and nitrendipine in single dialysed heart cells. Nature. 302, 790-794 (1983).
- Ozdemir, S. Pharmacological Inhibition of Na/Ca Exchange Results in Increased Cellular Ca2+ Load Attributable to the Predominance of Forward Mode Block. Circ Res. 102, 1398-1405 (2008).
- Zhang, S., Zhou, Z., Gong, Q., Makielski, J. C., January, C. T. Mechanism of Block and Identification of the Verapamil Binding Domain to HERG Potassium Channels. Circ Res. 84, 989-998 (1999).
- Veeraraghavan, R., Poelzing, S. Mechanisms underlying increased right ventricular conduction sensitivity to flecainide challenge. Cardiovasc. Res. 77, 749-756 (2008).
- Goodman, M., Art, J. Positive feedback by a potassium-selective inward rectifier enhances tuning in vertebrate hair cells. Biophysical Journal. 71, 430-442 (1996).
- Han, A., Frazier, A. B. Ion channel characterization using single cell impedance spectroscopy. Lab Chip. 6, 1412-1414 (2006).
- Hayashi, H., Fishman, H. Inward rectifier K+-channel kinetics from analysis of the complex conductance of Aplysia neuronal membrane. Biophysical Journal. 53, 747-757 (1988).
- Millonas, M. M., Hanck, D. A. Nonequilibrium response spectroscopy of voltage-sensitive ion channel gating. Biophys. J. 74, 210-229 (1998).
- Misakian, M., Kasianowicz, J., Robertson, B., Petersons, O. Frequency response of alternating currents through the Staphylococcus aureus alpha-hemolysin ion channel. Bioelectromagnetics. 22, 487-493 (2001).
- Sale, H. Physiological Properties of hERG 1a/1b Heteromeric Currents and a hERG 1b-Specific Mutation Associated With Long-QT Syndrome. Circ Res. 103, 81-95 (2008).
- Blatz, A. L., Magleby, K. L. Quantitative description of three modes of activity of fast chloride channels from rat skeletal muscle. J Physiol. 378, 141-174 (1986).
- Kuo, J. J., Lee, R. H., Zhang, L., Heckman, C. J. Essential role of the persistent sodium current in spike initiation during slowly rising inputs in mouse spinal neurones. The Journal of Physiology. 574, 819-834 (2006).
- Thompson, A. N. Mechanism of potassium-channel selectivity revealed by Na(+) and Li(+) binding sites within the KcsA pore. Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 1317-1324 (2009).
