Metaboliseringsvej Bekræftelse og Discovery Gennem ¹³ C-mærkning af proteinogene aminosyrer

Summary

¹³ C-isotop mærkning er en teknik til bestemmelse af cellens centrale stofskifte for forskellige typer af mikroorganismer. Efter at cellerne har været dyrket med en bestemt mærket substrat, kan GC-MS måling afslører funktionelle stofskifteveje baseret på unikke mærkning mønstre i proteinogene aminosyrer.

Abstract

Mikrober har komplekse metaboliske veje, som kan undersøges ved hjælp af biokemi og funktionel genomik metoder. En vigtig teknik til at undersøge cellens centrale stofskifte og opdage nye enzymer er ¹³ C-assisteret stofskifte analyse 1. Denne teknik er baseret på isotop-mærkning, hvor mikroorganismer er fodret med en ¹³ C-mærkede substrater. Ved at spore atomet overgangen stier mellem metabolitter i de biokemiske netværk, kan vi bestemme funktionelle veje og opdage nye enzymer.

Som en supplerende metode til at transcriptomics og proteomics, strategier for isotopomer-assisteret analyse af stofskifteveje indeholder tre vigtige trin ^2. Først, vi vokser cellerne med ¹³ C-mærkede substrater. I dette trin, er sammensætningen af ​​medium og udvælgelsen af ​​mærkede substrater to vigtige faktorer. For at undgå måling støj fra ikke-mærkede kulstof i næringsstof kosttilskud, Er en minimal medie med en eneste kulstofkilde påkrævet. Endvidere er valget af en mærket substrat er baseret på, hvor effektivt det vil belyse den vej at blive analyseret. Fordi romanen enzymer ofte indebærer forskellige reaktioner stereokemi og halvfabrikata, i almindelighed, enkeltvis mærket kulstof substrater er mere informativ til påvisning af nye veje end ensartet mærket dem til påvisning af nye veje ^{3, 4.} For det andet analyserer vi aminosyre mærkning mønstre ved hjælp af GC -MS. Aminosyrer er rigelige på protein og dermed kan fås fra biomasse hydrolyse. Aminosyrer kan derivatized af N-(tert-butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide (TBDMS) før GC adskillelse. TBDMS derivatized aminosyrer kan blive splittet på grund af MS og resultere i forskellige arrays af fragmenter. Baseret på massen til at oplade (m / z) forholdet mellem fragmenteret og fragmenteret aminosyrer, kan vi udlede den mulige mærket mønstre af de centrale metabolitter, der erforløbere for de aminosyrer. tredje, vi spore 13C kulstof overgange i det foreslåede veje, og baseret på isotopomer data, bekræfte, om disse veje er aktive ^2. Måling af aminosyrer giver isotopiske mærkning oplysninger omkring otte afgørende forløber metabolitter i det centrale stofskifte. Disse metaboliske centrale knudepunkter kan afspejle de funktioner af associerede central-veje.

¹³ C-assisteret stofskifte analyse via proteinogene aminosyrer kan anvendes bredt til funktionel karakterisering af dårligt karakteriseret mikrobielle metabolisme ^1. I denne protokol, vil vi bruge Cyanothece 51142 som den model stammen til at demonstrere brugen af mærket kulstof substrater for at opdage nye enzymatiske funktioner.

Protocol

1. Cellekultur (figur 1)

1. Grow celler i minimal medie med sporstoffer, salte, vitaminer og specifikt mærket kulstof substrater, der er bedst for pathway undersøgelse. Brug enten ryster kolber eller bioreaktorer til cellekulturmedier. Organiske næringsstoffer, såsom gærekstrakt, kan interferere med måling af aminosyre mærkning og kan derfor ikke være til stede i dyrkningsmediet.
2. Overvåg cellevækst ved at den optiske tæthed af kulturen på en optimal bølgelængde (f.eks OD ₇₃₀ til Cyanothece 51.142) med en UV / VIS spektrofotometer.
3. Celler kan først dyrkes i et ikke-mærket medium. Midt-log vækstfase celler er at foretrække frem skal anvendes til podning (3% (v / v) i volumen inokulation ratio) af mærket medium. Det mærkede kulturen skal sub-kulturperler (3% v / v indpodning ratio) i det samme mærkede medium for at undgå indførelsen af ​​ikke-mærkede kulstof fra de indledende inokulum.

1. Harvest sub-dyrkede celler (10 ml) i midten-log vækst fase ved centrifugering (10 min, 8000 × g).
2. Resuspender pellet i 1,5 ml af 6M HCl og overføre det til et klart glas, skrue-top GC hætteglasset. Cap hætteglassene og placere dem i en 100 ° C ovn i 24 timer til at hydrolysere biomasse proteiner til aminosyrer. Hydrolyse af biomasse piller kan give 16 af de 20 fælles aminosyrer (figur 2) ^5. Cystein og tryptofan nedbrydes, og glutamin og asparagin konverteres til glutamat og aspartat, hhv.
3. Centrifuger aminosyre løsningen på 20.000 × g i 5 min med 2 ml Eppendorf rør, og overføre de supernatanter til nye GC hætteglas. Dette trin fjerner faste partikler i hydrolyse løsning.
4. Tag GC hætteglasset låg og tørre prøver helt under en strøm af luft ved hjælp af en Thermo Scientific Reacti-VAP fordamper (bemærk: en fastfrysning tørretumbler kan også bruges to tørre prøver). Dette trin kan ske natten over.

3. Aminosyre derivatisering og GC-MS betingelser

Analyse af aminosyrer eller opkrævet / stærkt polære metabolitter via GC kræver, at disse metabolitter blive derivatized, så aminosyrer er flygtige og kan adskilles ved gaschromatografi ^2.

1. Opløs tørrede prøver med 150 μL af tetrahydrofuran (THF) og 150 μL af N-(tert-butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide derivatisering reagens.
2. Inkuber alle prøver i en ovn eller et vandbad mellem 65 og 80 ° C i 1 time. Vortex lejlighedsvis at sørge for, metabolitter i glasset er opløst.
3. Centrifugér prøverne ved 20.000 × gi 10 min, og derefter overføre supernatanten til nye GC hætteglas. Supernatanten skal være en klar og gullig opløsning. På grund af mætning af detektorer, kan GC-MS målenøjagtighed blive påvirket af de høje koncentration af injiceret TBDMS derivatized aminosyrer (disse prøver ofte viser mørk brun farve), derfor skal vi fortynde disse prøver ved hjælp af THF før GC-MS måling ^6.
4. Analyser af prøverne ved GC-MS (brug en 1:5 eller 1:10 delingsforholdet, injektionsvolumen = 1 ml, bæregas helium = 1,2 ml / min). Brug følgende GC temperatur program: hold ved 150 ° C i 2 minutter, stiger med 3 ° C pr minut til 280 ° C, øget ved 20 ° C pr minut til 300 ° C, og hold derefter i 5 minutter. Opløsningsmiddel forsinkelse kan indstilles som ~ 5 min (for en 30 meter GC kolonne). Rækken af ​​massen til at opkræve ratio (m / z) i MS kan indstilles mellem 60 og 500.

4. GC-MS analyse af data

1. TBDMS derivatized aminosyre måling kan også blive påvirket af isotop diskrimination i GC adskillelse. Light isotoper bevæge sig en anelse hurtigere end hive isotoper i GC-kolonne. For at mindske den potentielle målefejl, kan vi gennemsnit massen spektrum af heleaminosyre peak variationsbredde: ⁶
2. GC og MS spektre af TBDMS derivatized metabolitter er blevet rapporteret før ^7. GC opholdstid og den unikke m / z toppe for hver aminosyre er illustreret i Figur 3.
3. Derivatisering af aminosyrer eller centrale metabolitter indebærer betydelige mængder af naturligt mærkede isotoper, herunder ¹³ C (1,13%), ¹⁸ O (0,20%), ²⁹ Si (4,70%), og ³⁰ Si (3,09%). Målingen støj fra naturlige isotoper i den rå masse isotopomer spektrum kan afhjælpes ved hjælp af offentliggjort software ^{5, 8.} De endelige isotopiske mærkning data indberettes som massefraktioner, fx M _0, M _1, M _2, M ₃ og M ₄ (som repræsenterer fragmenter indeholder nul til fire ¹³ C mærket kulstofatomer).
4. Måling af aminosyrer kan give isotopiske mærkning oplysninger omkring otte afgørende forløber metabolitter: 2-oxo-glutarspiste, 3-P-glycerate, acetyl-CoA, erythrose-4-P, oxalacetat, phosphoenolpyruvat, pyruvat, og ribose-5-P. Mærkningen mønstre i disse metabolitter kan bruges til at identificere flere centrale metaboliske veje (figur 2) ^9. Resultatet af mærkning eksperimenter kan yderligere bekræftes ved hjælp af andre biokemiske metoder (f.eks, RT-PCR).

5. Pathway analyse ved hjælp af mærket aminosyre data

Ved at undersøge kun et par vigtige aminosyrer fremstillet af veldesignede ¹³ C tracer eksperimenter, kan vi afsløre flere unikke veje eller enzymaktiviteter uden at udføre sofistikerede ¹³ C-metabolisk flux analyse af hele den centrale stofskifte.

1. Entner-Doudoroff pathway: [1 - ¹³ C] glukose kan bruges som kulstofkilde. Hvis vejen er aktiv, vil serin mærkning være betydeligt lavere end mærkning i alanin ^10.
2. Forgrenede TCA cyklus: [1 - ¹³ C]pyruvat kan bruges som kulstofkilde. Hvis TCA cyklus er brudt, kan aspartat mærkes af to kulstofatomer, mens glutamat er mærket med kun én kulstof ^{11, 12.}
3. CO ₂ optagelse til Calvin-Benson-Bassham cyklus i en mixotrophic stofskifte: Ikke-mærkede CO ₂ og mærket kulstof substrater er både bruges som kulstofkilder. Hvis Calvins cyklus er funktionelt, vil serin og histidin mærkning være betydeligt udvandet, hvis man sammenligner med andre aminosyrer. En sådan metode kan bestemme den relative CO _2-fiksering, når organisk kulstof kilder er til stede på mellemlang ^13.
4. Oxidativ pentose fosfat pathway: [1 - ¹³ C] glukose kan bruges som kulstofkilde. Hvis vejen er aktiveret, vil ikke-mærkede alanin være> 50% ^12.
5. Anaplerotic vejen (f.eks PEP + CO ₂ à oxalacetat): ¹³ CO ₂ og ikke-mærkede kulstof substrater (fx glycerol eller PYRuvate) kan bruges som kulstofkilde. Hvis vejen er aktiv, vil aspartat mærkning være betydeligt beriget, sammenligne med alanin og serin ^13.
6. Re-citrat syntase: [1 - ¹³ C] pyruvat kan bruges som kulstofkilde. Hvis enzymet er aktiv, glutamat mærket i β-carboxyl-gruppe ^{3, 4.}
7. Citramalate her: [1 - ¹³ C] pyruvat, [2 - ¹³ C] glycerol, eller [1 - ¹³ C] acetat kan bruges som kulstofkilde. Hvis vejen er aktiv, leucin og isoleucin mærkning beløbene er identiske ^14.
8. Serin-isocitrate lyase cyklus: [1 - ¹³ C] pyruvat eller [1 - ¹³ C] laktat kan anvendes som kulstofkilde. Hvis vejen er aktiv, vil den tredje position kulstof i serin mærkes ^15.
9. Udnyttelse af næringsstoffer (dvs. eksogene aminosyrer): en kultur medie med fuldt mærkede kulstof substrater og ikke-mærkede aminosyrerkan anvendes. Hvis cellerne selektivt at udnytte disse suppleret umærket næringsstoffer, vil vi se en betydelig mærkning fortynding af disse aminosyrer i biomassen. Denne metode kan bruges til at undersøge, hvilke næringsstoffer kosttilskud er foretrukket af cellen ^16.

6. Repræsentative resultater

Nylige bioenergi undersøgelser har genoplivet interesse i at bruge romanen phototrophic mikroorganismer til produktion af bioenergi og CO _2-opsamling. I de seneste år har en hel del 13C-stofskifte analyser, herunder avancerede 13C-Metabolisk Flux Analyser (13C-MFA), blevet anvendt til at undersøge det centrale stofskifte i phototrophic bakterier, fordi biokemiske viden om de centrale metaboliske veje ikke er velfunderet i disse ikke-modelorganismer ^{10, 11, 17-20.} Her præsenterer vi et eksempel på opdagelsen af en alternativ isoleucin vej hos Cyanothece 51142 ^21. Cyanothece 51142 indeholder ikke det enzym (EF 4.3.1.19, threonin ammoniak-lyase), der katalyserer omdannelsen af threonin til 2-ketobutyrate i den typiske isoleucin syntesevejen. Du kan løse isoleucin vej, vi vokser Cyanothece 51.142 (20 ml) i ASP2 medium ²² med 54 mm glycerol (2-13C,> 98%). Cyanothece 51142 udnytter 2 ^nd position mærket glycerol som den vigtigste kulstofkilde. Vi observerer, at threonin og alanin har et mærket kulstof, mens isoleucin er mærket med tre kulstofatomer. Derfor kan syntese i Cyanothece 51142 ikke være afledt af threonin rute ansat i de fleste organismer (Figur 4). På den anden side har leucin og isoleucin identiske mærkning mønstre baseret på fragment (M-15) ⁺ og fragment (M-159) ^+. For eksempel, [M-15] de isotopomer data fra ⁺ (indeholdende fragmenteret aminosyrer) viser samme mærkning for leucin (M0 = 0,01, M1 = 0,03, M2 = 0,21, M3 = 00,69) og isoleucin (M0 = 0,01, M1 = 0,03, M2 = 0,24, M3 = 0,67). Således leucin og isoleucin skal syntetiseres fra samme prækursorer (dvs. pyruvat og acetyl-CoA). Denne observation er i overensstemmelse med den mærkede kulstof overgangen i citramalate vej for isoleucin syntese. For at bekræfte denne vej, vi søger Det Fælles Genome Institute database og finde tilstedeværelsen af en citramalate syntase Cima (cce_0248) i Cyanothece.

Figur 1. De ¹³ C-assisteret pathway analyse trin.

Figur 2. Aminosyrer, der anvendes for at opnå mærkning mønster af deres metaboliske prækursorer. ACoA, acetyl-CoA, AKG, α-ketoglutarat, C5P, ribose 5-fosfat, CIT, citrat, E4P, erythrose 4-fosfat, G6P, glucose-6-fosfat; åbent lufttrafikrum, oxalacetat, PEP, phosphoenolpyruvat, PGA, 3-fosfoglycerat, PYR, pyruvat.

Figur 3. GC toppe i 16 aminosyrer. TBDMS derivatized aminosyrer er revnede af MS i to fragmenter: (M-57) ^+, der indeholder hele aminosyre, og (M-159) ^+, som mangler α carboxyl-gruppen af aminosyren. For leucin og isoleucin, den (M-57) + blev overlappes af andre masse toppe. Vi foreslår at bruge fragment (M-15) + at analysere hele aminosyre mærkning. Den (f302) + gruppen er påvist i de fleste aminosyrer, som indeholder kun den første (α-carboxyl-gruppe) og for det andet kul i en aminosyre rygrad. Fordi denne MS højdepunkt har ofte høje støj-til-signal nøgletal, (f302) ⁺ anbefales ikke til kvantitativt at analysere den metaboliske flusmidler ^7.

IGUR 4 "/>
Figur 4. Labeling overgange i isoleucin veje i Cyanothece 51.142 (ændres fra vores tidligere papir) ^21.

Discussion

Denne protokol består af fodring cellen med en mærket substrat og måle den resulterende isotopisk mærkning mønstre i de aminosyrer via GC-MS. Siden MS data (m / z nøgletal) giver blot det samlede beløb for mærkning af MS ioner, er vi nødt til at vurdere isotopomer fordelinger af aminosyrer ved at undersøge m / z forhold for både fragmenteret (M-57) ⁺ og fragmenteret aminosyrer (dvs. (M-159) ⁺ og (f302) ^+). Desuden kan vi udføre flere cellekulturer med en kemisk identisk medium, men substrater, der har forskellige mærkning mønstre (1 ^st mærket beliggenhed, 2 ^nd mærket stilling osv.). Mærkningen oplysninger om metabolitter fra disse eksperimenter kan integreres til at afkode den faktiske CO overgangen ruter gennem den centrale metaboliske veje.

For pathway analyse er valget af en mærket substrat vigtig. Generelt er enkeltvis mærket kulstof substrater EASIER at bruge i spore skæbne mærket kulstof, når ¹³ C siver ned gennem det centrale veje, mens flere carbon mærkede substrater kan forvirre carbon sporing. Også enkeltvis mærkede substrater er mere informativt at belyse unikke molekyle strukturer i metabolitter end ensartet mærkede substrater. ⁴ For eksempel, den (Re)-typen citrat syntase viser forskellige reaktioner stereokemi fra normale citrat syntase og forårsager således citrat at have forskellige molekylære chiralitet . På den anden side er substrater forskellige i deres egnethed til at opdage deres tilknyttede veje. Glukose er bedst til at afsløre delingsforholdet mellem glycolysen og pentose fosfat veje, mens pyruvat eller acetat er bedst til at analysere TCA cyklus og nogle aminosyre veje. Derfor er det nødvendigt at bruge forskellige substrater til at undersøge det samlede billede af cellens stofskifte.

¹³ C-isotopmærkning er en teknik til bestemmelse af funktionelle veje i mikroorganismer. Men denne teknik har flere begrænsninger. For det første er kun egnet til analyse af kulstof-stofskiftet med økologiske substrater, da det ikke umiddelbart kan løse metabolisme i autotrofe stofskifte, hvis CO ₂ anvendes som den eneste kulstofkilde. Autotrofe kulturer med CO ₂ mærke alle aminosyrer i samme omfang som input ¹² CO ₂ / ¹³ CO ₂ blanding ^23. Dette gør sti analyse vanskelig, da stofskiftet analysen udledes fra en omlægning af ¹³ C kulstofatomer i metabolitter af forskellige metaboliske veje. For det andet, dette papir præsenteres udelukkende kvalitative resultater diskriminere mellem "aktive" og "ikke-aktive" veje. Præcis kvantificering af stofskifte kræver en sofistikeret modellering tilgang (dvs. tredje er anvendelsesområdet for ¹³ C-metabolisme analyse begrænset af tekniske udfordringer ved fastlæggelsen af lav tæthed og ustabile metabolitter. Bredere metaboliske netværk kan probed ved at analysere frie metabolitter foruden aminosyrer. Måling af frie metabolitter kræver både høj-effektive metabolit ekstraktionsmetoder og yderst følsom analytisk platforme. LC-MS, FT-ICR MS, og CE-MS er blevet brugt til at identificere mærkning mønstre af frie metabolitter, og give mere indsigt i cellens stofskifte ^2. Fjerde, ¹³ C-assisteret pathway analyse sker bedst i minimal medium, fordi tilsætning af ikke-mærkede næringsstof kosttilskud fører til falsk lavere mærkning koncentrationer og gøre de kvantitative ¹³ C-MFA undersøgelser ikke så ligetil. Desuden kan celler udnytte eksogene aminosyrer i vid udstrækning til protein synthesis, og dermed give meget svag mærkning signaler for disse proteinogene aminosyrer ^24. Hvis et rigt medium er forpligtet til at vokse celler, måling af intracellulære metabolitter, i stedet for aminosyrer, effektivt kan reducere indgrebet i mærkningen data, der opstår som følge af udefrakommende ikke-mærkede kulstof næringsstoffer.

Endelig er et stigende antal genom sekvenser for ikke-model mikrobielle arter, der offentliggøres hvert år. Imidlertid har funktionelle karakterisering af disse arter haltet langt bagefter tempoet i genomiske sekventering. ¹³ C-mærkning tilgange kan spille en vigtig rolle i bekræftelse og opdagelsen af stofskifteveje i mange ikke-modelorganismer. Desuden kan mærkningsoplysningerne blive integreret med metaboliske modellering ⁽¹³ C-MFA) til at dechifrere absolut kulstofstrømme i mikroorganismer ^25. Derfor kan denne teknik være almindeligt anvendt i analyse af biologiske systemer i forbindelse med biobrændstof, miljøkriteriernegiske og medicinske anvendelser.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
TBDMS	Sigma-Aldrich	19915	-
THF	Sigma-Aldrich	34865	-
Labeled carbon substrate	Cambridge Isotope Laboratories	Depend on the experimental requirement	Website: http://www.isotope.com
Gas chromatograph	Agilent Technologies	Hewlett-Packard, model 7890A	-
GC Columns	J&W Scientific	DB5 (30m)	-
Mass spectrometer	Agilent Technologies	5975C	-
Reacti-Vap Evaporator	Thermo Fisher Scientific, Inc.	TS-18825	For drying amino acid samples