Metabole route Bevestiging en Discovery door ¹³ C-etikettering van proteïnogene aminozuren

Summary

¹³ C-isotoop labeling is een nuttige techniek voor het bepalen van de cel centrale metabolisme voor verschillende soorten micro-organismen. Na de cellen zijn gekweekt met een specifiek gelabeld substraat, kunnen GC-MS metingen onthullen functionele metabole routes op basis van unieke patronen in de etikettering proteïnogene aminozuren.

Abstract

Microben hebben complexe metabole routes die kunnen worden onderzocht met behulp van de biochemie en functional genomics methoden. Een belangrijke techniek om cellen centrale metabolisme te onderzoeken en ontdekken nieuwe enzymen is ¹³ C-metabolisme ondersteunde analyse 1. Deze techniek is gebaseerd op de isotopische labeling, waarbij de microben worden gevoed met een ¹³ C gelabelde substraten. Door het opsporen van het atoom transitiepaden tussen metabolieten in de biochemische netwerk, kunnen we bepalen functionele paden en ontdek nieuwe enzymen.

Als een aanvullende methode om transcriptomics en proteomics, benaderingen voor isotopomeer-ondersteunde analyse van metabole routes bevatten drie belangrijke stappen ^2. Ten eerste, we groeien cellen met ¹³ C gelabelde substraten. In deze stap is de samenstelling van het medium en de selectie van gelabelde substraten zijn twee belangrijke factoren. Om te voorkomen dat de meting geluiden van niet-gemerkte koolstof in voedingssupplementen, Is een minimaal medium met een enige koolstofbron nodig. Verder is de keuze van een gelabeld substraat op basis van hoe effectief het zal het pad wordt geanalyseerd toe te lichten. Omdat de nieuwe enzymen vaak gepaard met andere reactie stereochemie of halffabrikaten, in het algemeen, afzonderlijk gelabelde koolstofsubstraten zijn meer informatief voor de detectie van nieuwe wegen dan uniform label die voor de detectie van nieuwe wegen ^{3, 4.} Ten tweede, analyseren we aminozuur etikettering patronen met behulp van GC -MS. Aminozuren zijn er in overvloed aan eiwitten en kan dus worden verkregen uit biomassa hydrolyse. Aminozuren kunnen gederivatiseerd worden door N-(tert-butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide (TBDMS) voor GC scheiding. TBDMS gederivatiseerde aminozuren kan worden versnipperd door MS en resulteren in verschillende arrays van fragmenten. Op basis van de massa op te laden (m / z) verhouding van de gefragmenteerde en ongefragmenteerd aminozuren, kunnen we afleiden van de mogelijke label patronen van de centrale metabolieten die wordenvoorlopers van de aminozuren. Ten derde, we sporen 13C carbon overgangen in de voorgestelde paden en, op basis van de isotopomeer gegevens bevestigen of deze pathways actief zijn ^2. Meting van aminozuren levert isotopische labeling informatie over de acht cruciale voorloper metabolieten in het centrale metabolisme. Deze metabole belangrijkste knooppunten kunnen weerspiegelen de functies van de geassocieerde landen in Midden paden.

¹³ C-metabolisme ondersteunde analyse via proteïnogene aminozuren op grote schaal kunnen worden gebruikt voor functionele karakterisering van slecht gekarakteriseerd microbiële metabolisme ^1. In dit protocol, zullen we gebruik maken Cyanothece 51.142 als het model inspannen om het gebruik van gelabelde koolstof substraten voor het ontdekken van nieuwe enzymatische functies te demonstreren.

Protocol

1. Celcultuur (figuur 1)

1. Groeien cellen in minimaal medium met sporenelementen, zouten, vitamines, en specifiek gelabeld koolstofsubstraten die het beste zijn voor pad onderzoek. Gebruik ofwel schudden kolven of bioreactoren voor celcultuur. Organische voedingsstoffen, zoals gist extract, kunnen interfereren met de meting van de aminozuur etikettering en kan dus niet aanwezig zijn in het kweekmedium.
2. Monitor celgroei door de optische dichtheid van de cultuur op een optimale golflengte (bv. OD ₇₃₀ voor Cyanothece 51142) met een UV / Vis spectrofotometer.
3. Cellen kunnen eerst worden gekweekt in een niet-gelabeld medium. De middelste-log groeifase cellen zijn bij voorkeur te worden gebruikt voor enting (3% (v / v) in volume enten ratio) van de gelabelde medium. De gelabelde cultuur moet worden sub-gekweekt (3% v / v inenting ratio) in hetzelfde label medium om de introductie van niet-gemerkte koolstof uit de initiële inoculum te vermijden.

1. Oogst sub-gekweekte cellen (10 ml) in het midden-log groeifase door centrifugeren (10 min, 8000 × g).
2. Resuspendeer de pellet in 1,5 ml van 6M HCl en overzetten naar een helder glas, schroef-top GC flacon. Cap de flacons en leg ze in een 100 ° C oven gedurende 24 uur om de biomassa eiwitten te hydrolyseren in aminozuren. Hydrolyse van biomassa pellets kan opleveren 16 van de 20 gewone aminozuren (Figuur 2) ^5. Cysteïne en tryptofaan worden afgebroken, en glutamine en asparagine worden omgezet naar glutamaat en aspartaat, respectievelijk.
3. Centrifugeer het aminozuur oplossing bij 20.000 xg gedurende 5 minuten met behulp van 2 ml Eppendorf buisjes, en breng de bovenstaande vloeistoffen om nieuwe GC flacons. Deze stap verwijdert vaste deeltjes in de hydrolyse oplossing.
4. Verwijder de GC flacon deksels en volledig droog de monsters onder een stroom van lucht met behulp van een Thermo Scientific Reacti-Vap verdamper (let op: een vriesdroger kan ook gebruikt worden to droge monsters). Deze stap kan 's nachts worden gedaan.

3. Aminozuur derivatisering en GC-MS condities

Analyse van de aminozuren of geladen / zeer polaire metabolieten via GC vereist dat deze metabolieten gederivatiseerd worden, zodat de aminozuren volatiel zijn en kunnen worden gescheiden door middel van gaschromatografie ^2.

1. Los van de gedroogde monsters met 150 ul van tetrahydrofuran (THF) en 150 pi van de N-(tert-butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide derivatiseringsreagens.
2. Broed alle monsters in een oven of een waterbad tussen 65 en 80 ° C gedurende 1 uur. Vortex af en toe te controleren of de metabolieten in de flacon worden opgelost.
3. Centrifugeer de monsters op 20.000 xg gedurende 10 minuten, en breng het supernatant om nieuwe GC flacons. Het supernatant moet een heldere en geelachtige oplossing zijn. Als gevolg van verzadiging van de detectoren, kunnen GC-MS meetnauwkeurigheid worden beïnvloed door de hoge concentration van de geïnjecteerde TBDMS gederivatiseerde aminozuren (deze monsters vaak shows donker bruine kleur), daarom moeten we verdunnen van deze monsters met behulp van THF voor GC-MS meting ^6.
4. Het analyseren van de monsters door GC-MS (gebruik een 1:05 of 1:10 splitsingsverhouding, injectie volume = 1 ui, draaggas helium = 1,2 ml / min). Gebruik de volgende GC temperatuur programma: houd bij 150 ° C gedurende 2 minuten, toename bij 3 ° C per minuut tot 280 ° C, te verhogen bij 20 ° C per minuut tot 300 ° C, en daarna gedurende 5 minuten. Solvent vertraging kan worden ingesteld als ~ 5 min (voor een 30 meter GC-kolom). Het bereik van de massa om ratio (m / z) lading in MS kan worden ingesteld tussen 60 en 500.

4. GC-MS data-analyse

1. TBDMS gederivatiseerde aminozuur meting kan ook worden beïnvloed door isotoop discriminatie in GC scheiding. Lichte isotopen bewegen iets sneller dan heave isotopen in GC-kolom. Ter vermindering van de potentiële meetfouten, kunnen we het gemiddelde van de massa spectrum van het geheelaminozuur peak range ⁶
2. De GC en MS spectra van TBDMS gederivatiseerde metabolieten zijn gemeld voor ^7. De GC retentietijd en de unieke m / z pieken voor elk aminozuur worden geïllustreerd in figuur 3.
3. Derivatisering van aminozuren of centrale metabolieten introduceert aanzienlijke hoeveelheden van natuurlijk-gelabelde isotopen, waaronder ¹³ C (1,13%), ¹⁸ O (0,20%), ²⁹ Si (4,70%), en ³⁰ Si (3,09%). De meting geluid van natuurlijke isotopen in de ruwe massa isotopomeer spectrum kan worden gecorrigeerd door gebruik te maken gepubliceerde software ^{5, 8.} De laatste isotopische labeling gegevens worden gerapporteerd als massa breuken, bijvoorbeeld, M _0, M _1, M _2, M ₃ en M ₄ (goed voor fragmenten die nul tot vier ¹³ C gelabeld koolstofatomen).
4. Meting van aminozuren kan isotopische labeling informatie over de acht cruciale voorloper metabolieten: 2-oxo-glutaraten, 3-P-glycerate, acetyl-CoA, erythrose-4-P, oxaalacetaat, fosfoenolpyruvaat, pyruvaat en ribose-5-P. De etikettering patronen in deze metabolieten kan worden gebruikt om een aantal centrale metabole routes (figuur 2) ⁹ identificeren. Het resultaat van de etikettering experimenten kan verder worden bevestigd met behulp van andere biochemische methoden (bijv., RT-PCR).

5. Pathway analyse met behulp van gelabelde aminozuur gegevens

Door te onderzoeken slechts een paar belangrijke aminozuren geproduceerd uit goed ontworpen ¹³ C tracer experimenten kunnen onthullen we een aantal unieke paden of enzym-activiteiten zonder het uitvoeren van geavanceerde ¹³ C-metabole flux analyse van de gehele centrale metabolisme.

1. Entner-Doudoroff route: [1 - ¹³ C] glucose kan worden gebruikt als koolstofbron. Als de route actief is, wordt serine etikettering beduidend lager dan de etikettering van alanine ^10.
2. Vertakte TCA cyclus: [1 - ¹³ C]pyruvaat kan worden gebruikt als koolstofbron. Als de TCA cyclus is gebroken, kan aspartaat worden gelabeld door twee koolstofatomen, terwijl de glutamaat is gemerkt met slechts een dubbele koolstof ^{11, 12.}
3. CO ₂ fixatie door Calvin-Benson-Bassham cyclus in een mixotrophic stofwisseling: Non-label CO ₂ en gelabeld koolstofsubstraten worden zowel gebruikt als koolstofbron. Als Calvin cyclus is functioneel, zal serine en histidine etikettering duidelijk worden verdund, in vergelijking met andere aminozuren. Een dergelijke methode kan bepalen de relatieve CO ₂ fixatie wanneer organische koolstof bronnen aanwezig zijn in het medium ^13.
4. Oxidatieve pentosefosfaat route: [1 - ¹³ C] glucose kan gebruikt worden als de koolstofbron. Als de route actief is, wordt niet-gemerkte alanine worden> 50% ^12.
5. Anaplerotic route (bijv. PEP + CO ₂ à oxaalacetaat): ¹³ CO ₂ en de niet-gelabelde koolstof substraten (bijvoorbeeld glycerol of pyruvate) kan worden gebruikt als koolstofbron. Als de route actief is, wordt aspartaat etikettering aanzienlijk verrijkt, te vergelijken met en alanine serine ^13.
6. Re-citraat synthase: [1 - ¹³ C] pyruvaat kan worden gebruikt als koolstofbron. Als het enzym actief is, is glutamaat geëtiketteerd in β-carboxylgroep ^{3, 4.}
7. Citramalate pad: [1 - ¹³ C] pyruvaat, [2 - ¹³ C] glycerol, of [1 - ¹³ C] acetaat kan worden gebruikt als koolstofbron. Als de route actief is, leucine en isoleucine etikettering bedragen zijn identiek ^14.
8. Serine-isocitrate lyase cyclus: [1 - ¹³ C] pyruvaat of [1 - ¹³ C] lactaat kan worden gebruikt als de koolstofbron. Als de route actief is, zal de derde positie koolstof in serine worden geëtiketteerd ^15.
9. Benutting van nutriënten (dat wil zeggen, exogene aminozuren): een kweekmedium met volledig gelabeld koolstofsubstraten en niet-gemerkte aminozurenkunnen worden gebruikt. Als de cellen selectief gebruik maken van deze aangevuld non-label voedingsstoffen, zullen we zien aanzienlijke verwatering etikettering van deze aminozuren in de biomassa. Deze methode kan gebruikt worden om te onderzoeken welke voedingssupplementen zijn de voorkeur van de cel ^16.

6. Representatieve resultaten

Recente studies hebben bio-energie nieuw leven ingeblazen belangen in met behulp van nieuwe fototrofe micro-organismen voor de productie van bio-en CO _2-afvang. In de afgelopen jaren hebben heel wat 13C-metabolisme analyses, waaronder geavanceerde 13C-Metabolic Flux Analyses (13C-MFA), is toegepast op centrale metabolisme te onderzoeken in fototrofe bacteriën, vanwege biochemische kennis van de centrale metabole routes is niet gegrond in deze niet-modelorganismen ^{10, 11, 17-20.} Hier presenteren we een voorbeeld van de ontdekking van een alternatieve route in isoleucine Cyanothece 51.142 ^21. Cyaanothece 51142 bevat niet het enzym (EG 4.3.1.19, threonine ammoniak-lyase), die de omzetting van threonine katalyseert om 2-ketobutyrate in de typische isoleucine synthese weg. Aan het oplossen van de isoleucine pad, we groeien Cyanothece 51.142 (20 ml) in ASP2 medium ²² met 54 mM glycerol (2-13C,> 98%). Cyanothece 51142 maakt gebruik van 2 ^e positie bestempeld glycerol als de belangrijkste koolstofbron. Zien we dat threonine en alanine heeft een carbon gelabeld, terwijl isoleucine is gelabeld met drie koolstofatomen. Daarom kan synthese in Cyanothece 51.142 niet worden afgeleid uit de threonine route in dienst van de meeste organismen (Figuur 4). Aan de andere kant, leucine en isoleucine hebben identieke patronen etikettering op basis van fragment (M-15) ⁺ en fragment (M-159) ^+. Bijvoorbeeld, de isotopomeer gegevens van [M-15] ⁺ (met ongefragmenteerd aminozuren) laten identieke etikettering voor leucine (M0 = 0.01, M1 = 0,03, M2 = 0,21, M3 = 00,69) en isoleucine (M0 = 0.01, M1 = 0,03, M2 = 0,24, M3 = 0,67). Zo leucine en isoleucine moeten worden gesynthetiseerd uit dezelfde voorlopers (dat wil zeggen, pyruvaat en acetyl-CoA). Deze waarneming is in overeenstemming met de gelabelde koolstof transitie in de citramalate route voor isoleucine synthese. Om te bevestigen deze route, zoeken we de Joint Genome Institute database en vind de aanwezigheid van een citramalate synthase Cima (cce_0248) in Cyanothece.

Figuur 1. De ¹³ C-ondersteunde pathway-analyse stappen.

Figuur 2. Aminozuren worden gebruikt voor het verwerven van de etikettering patroon van hun metabolische voorlopers. ACoA, acetyl-CoA, AKG, α-Ketoglutaraat, C5P, ribose 5-fosfaat, CIT, citraat, E4P, erythrose 4-fosfaat, G6P, glucose-6-fosfaat; OAA, oxaalacetaat, PEP, fosfoenolpyruvaat, PGA, drie-fosfoglyceraat; PYR, pyruvaat.

Figuur 3. GC pieken voor 16 aminozuren. TBDMS gederivatiseerde aminozuren zijn gebarsten door MS in twee fragmenten: (M-57) ^+, die de hele aminozuur, en (M-159) ^+, die mist de α carboxylgroep van het aminozuur. Voor leucine en isoleucine, de (M-57) + werd overlapt door andere massa pieken. We raden u aan fragment (M-15) + om de hele aminozuur etikettering te analyseren. De (f302) + groep is gedetecteerd in de meeste aminozuren, die bevat alleen de eerste (α-carboxyl-groep) en de tweede koolstof in een aminozuur backbone. Omdat deze MS piek heeft vaak met veel lawaai-to-signaal ratio's, (f302) ⁺ wordt niet aanbevolen voor kwantitatief analyseren van de metabole fluxen ^7.

igure 4 "/>
Figuur 4. Labeling overgangen in isoleucine paden in Cyanothece 51.142 (gemodificeerd uit ons vorige artikel) ^21.

Discussion

Dit protocol bestaat uit het voeden van de cel met een gelabeld substraat en het meten van de daaruit voortvloeiende isotopische labeling patronen in de aminozuren via GC-MS. Omdat MS-gegevens (m / z ratio's) geven gewoon het totale bedrag van de etikettering van MS-ionen, moeten we de isotopomeer verdelingen van aminozuren te beoordelen door onderzoek van de m / z ratio's van zowel de gefragmenteerde (M-57) ⁺ en gefragmenteerd aminozuren (dat wil zeggen, (M-159) ⁺ en (f302) ^+). Verder kunnen we uitvoeren een aantal celculturen met een chemisch identiek medium, maar substraten die verschillende etiketten patronen (een label ^st ligging, 2 gelabeld ^tweede positie, enz.). Het etiket informatie over metabolieten van deze experimenten kan worden geïntegreerd met de werkelijke CO overgang routes decoderen via de centrale metabole routes.

Voor pathway-analyse, de keuze van een gelabeld substraat is belangrijk. In het algemeen, afzonderlijk gelabelde koolstofsubstraten zijn easier om te gebruiken bij het ​​traceren van het lot van de gelabelde koolstof bij ¹³ C sijpelt via het centrum van wegen, terwijl de multiple-koolstof gelabelde substraten kunnen verwarren carbon tracing. Ook afzonderlijk gelabelde substraten zijn meer informatief om unieke molecuul-structuren toe te lichten in metabolieten dan uniform gelabelde substraten. ⁴ Voor bijvoorbeeld de (Re)-type citraat synthase andere reactie stereochemie van de normale citraat synthase shows, en dus oorzaken citraat te hebben verschillende moleculaire chiraliteit . Aan de andere kant, substraten zijn verschillend in hun geschiktheid om de bijbehorende paden op te sporen. Glucose is het beste voor het opsporen van de splitsing verhouding tussen de glycolyse en de pentosefosfaat paden, terwijl het pyruvaat of acetaat zijn het beste voor het analyseren van de TCA-cyclus en een aantal aminozuur wegen. Daarom is het noodzakelijk om verschillende substraten te gebruiken om het algemene beeld van de cel stofwisseling te onderzoeken.

¹³ C-isotoopetikettering is een nuttige techniek voor het bepalen van functionele paden in micro-organismen. Echter, deze techniek heeft een aantal beperkingen. In de eerste plaats is alleen geschikt voor de analyse van koolstof stofwisseling met behulp van organische substraten, want het kan niet rechtstreeks op te lossen metabolisme in autotrofe stofwisseling als de CO ₂ wordt gebruikt als de enige koolstofbron. Autotrofe culturen met behulp van CO _2-label alle aminozuren in dezelfde mate als de ingang ¹² CO ₂ / ¹³ CO ₂ mengsel ^23. Dit maakt het pad analyse moeilijk, zoals stofwisseling analyse worden afgeleid uit een herschikking van ¹³ C koolstoffen in metabolieten door verschillende metabole routes. Ten tweede, dit artikel bevat alleen kwalitatieve resultaten onderscheid te maken tussen "actieve" en "niet-actieve" paden. Exacte kwantificering van de stofwisseling vereist een geavanceerde modelmatige aanpak (dat wil zeggen, derde, is de omvang van ¹³ C-metabolisme analyse beperkt door technische uitdagingen bij het ​​bepalen van een lage overvloed en instabiel metabolieten. Bredere metabole netwerk kan worden gepeild door de analyse van vrije metabolieten naast aminozuren. Meten van de vrije metabolieten vereist zowel zeer efficiënte metaboliet extractie methoden en zeer gevoelige analytische platformen. LC-MS, FT-ICR MS, en CE-MS zijn gebruikt voor het identificeren van de etikettering patronen van de vrije metabolieten, en bieden meer inzicht in de cel stofwisseling ^2. Vierde ¹³ C-ondersteunde pathway-analyse kan het beste gebeuren in minimaal medium, omdat toevoeging van niet-gemerkte voedingssupplementen leidt tot een ten onrechte lagere concentraties etikettering en maak kwantitatieve ¹³ C-MFB studies niet zo eenvoudig. Ook kunnen cellen op grote schaal gebruik maken van exogene aminozuren voor eiwit synthesis, en geven zo zeer zwakke signalen etikettering voor deze proteïnogene aminozuren ^24. Als een rijk medium is nodig om cellen, meting van intracellulaire metabolieten, in plaats van aminozuren groeien, kan de interferentie effectief verminderen van de etikettering van gegevens dat voortvloeit uit exogene niet-gelabelde koolstof voedingsstoffen.

Tot slot worden een toenemend aantal genoom sequenties voor niet-model micro-organismen wordt gepubliceerd per jaar. Echter, functionele karakterisering van deze soorten, bleef ver achter het tempo van de genomische sequentie-analyse. ¹³ C-labeling benaderingen kunnen een belangrijke rol spelen in de bevestiging en de ontdekking van de metabole routes in veel niet-model organismen. Bovendien kan de informatie op het etiket worden geïntegreerd met metabole modellering ⁽¹³ C-MFA) te ontcijferen absolute koolstoffluxen in micro-organismen ^25. Daarom kan deze techniek op grote schaal worden gebruikt in de analyse van biologische systemen met betrekking tot biobrandstoffen, ECOLOGsche en medische toepassingen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
TBDMS	Sigma-Aldrich	19915	-
THF	Sigma-Aldrich	34865	-
Labeled carbon substrate	Cambridge Isotope Laboratories	Depend on the experimental requirement	Website: http://www.isotope.com
Gas chromatograph	Agilent Technologies	Hewlett-Packard, model 7890A	-
GC Columns	J&W Scientific	DB5 (30m)	-
Mass spectrometer	Agilent Technologies	5975C	-
Reacti-Vap Evaporator	Thermo Fisher Scientific, Inc.	TS-18825	For drying amino acid samples