Descriviamo l'adattamento della tomografia ottica di proiezione (OPT) 1 All'imaging nello spettro dell'infrarosso vicino, e l'attuazione di una serie di strumenti di calcolo. Questi protocolli consentire una valutazione della pancreatica β-cellulare di massa (BCM) in esemplari più grandi, aumentare la capacità multicanale della tecnica e aumentare la qualità dei dati OPT.
Articolo metodologico
Near Infrared Tomografia ottica di proiezione per la valutazione delle β-cellule Grande Distribuzione in Diabetes Research
* These authors contributed equally
In questo articolo
Avviso di errata corrige
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Sommario
Abstract
Adattando OPT per includere la capacità di imaging nel vicino infrarosso (NIR) dello spettro, si illustrano qui la possibilità di corpi immagine più grande di tessuto pancreatico, come il pancreas di ratto, e per aumentare il numero di canali (tipi cellulari) che possono essere studiato in un singolo campione. Approfondiremo l'attuazione di una serie di strumenti di calcolo che forniscono: posizionamento 1 / accurata di un campione (nel nostro caso il pancreas) centro di massa (COM) in corrispondenza dell'asse di rotazione (AR) 2; 2 algoritmi / perfezionati per posta -messa a punto di allineamento che impedisce distorsioni geometriche durante la ricostruzione tomografica 2 e 3 / un protocollo per l'equalizzazione per aumentare l'intensità del segnale ai rapporti di rumore in OPT-based determinazioni BCM 3. Inoltre, si descrive un porta-campioni che minimizza il rischio di movimenti accidentali del campione durante l'acquisizione dell'immagine. Insieme, questi protocolli consentire una valutazione della distribuzione del BCM e OTHcaratteristiche er, da svolgersi in tutto il volume del pancreas intatta o altri organi (ad esempio, in studi di trapianto di isole), con una risoluzione fino al livello dei singoli isolotti di Langerhans.
Introduzione
L'insulina producono β-cellule sono fondamentali per la capacità del corpo per controllare il glucosio nel sangue omeostasi. Pertanto, le valutazioni di distribuzione del pancreas BCM sono indispensabili per molte aree di ricerca pre-clinica del diabete. Nelle valutazioni dei regimi terapeutici, ad esempio, l'impatto di ablazione genica mirata sulla differenziazione delle cellule del sistema endocrino o su studi di eziologia del diabete in modelli di roditori per la malattia spesso dipendono da tali analisi. Tradizionalmente, questi tipi di valutazioni sono affidati a tempo consumando stereologica approcci che sono difficili da eseguire a causa delle dimensioni e complessa costituzione anatomica del pancreas. La maggior parte di imaging ad alta risoluzione approcci attualmente (tipicamente ottico), non forniscono una profondità sufficiente a consentire la penetrazione di imaging intero pancreas nei roditori. Al contrario, gli approcci di imaging che non si limitano con la loro profondità di penetrazione (tipicamente nucleare) fornire a bassa risoluzione per risolvere la distribuzione completa e BCM sono ostacolatidalla mancanza di mezzi di contrasto adeguati 4,5.
Tomografia a proiezione ottica è una modalità di imaging 3D che consente ad alta risoluzione valutazioni di campioni biomedici sulla scala mm a cm 6. Con la presente, le informazioni sulla posizione spaziale e il volume del individuale di insulina esprimere isole di Langerhans possono essere estratte in tutto il volume del pancreas in topi normali e diabetici 3,7-10. Lo scopo di questo studio è di migliorare ulteriormente la capacità di questa tecnica per la valutazione delle β-cellule pancreatiche; loro distribuzione endogena, quando innestato in altri tessuti, la loro relazione con altri costituenti pancreatici (come infiltrarsi tipi cellulari) e in grande preparazioni pancreatiche rispetto al passato.
Il vicino infrarosso tomografia ottica di proiezione (NIR-OPT) di installazione
In seguito protocolli, uno scanner OPT in base al set up originale descritto da Sharpe 1 et al, atto a imaging nel vicino infrarosso descritto ed utilizzato. Per valutazioni singolo canale del pancreas mouse (es. BCM), SkyScan 3001 (Bioptonics) scanner può essere utilizzato.
Una lampada ad alogenuri metallici che fornisce energia di eccitazione superiore una lampada a mercurio a lunghezze d'onda superiori a 650 nm, fornisce la luce di eccitazione. La luce viene trasferita attraverso una guida di luce liquida. Una utile combinazione di fluorocromi e filtri passa banda per NIR fluorescenza imaging e separazione dei canali sono mostrati in Figura 3. La luce emessa viene rilevata con una telecamera CCD retroilluminato, con alta efficienza quantica nello spettro NIR. La scansione OPT è automatizzata utilizza una piattaforma LabView che controlla la fotocamera e motore passo-passo. Per supportare campioni nella dimensione di pancreas di ratto intatto, uno specchio d'argento rivestito e protetto da una cuvetta grande viene utilizzata. Infine, un porta-campioni che elimina indesiderate movemen verticalits del campione durante la scansione creata.
Protocollo
1. Preparazione del campione e Scansione
1,1 Preparazione del campione
La seguente procedura viene eseguita essenzialmente come descritto in precedenza 7.
- Raccolto il pancreas. Utilizzare ghiacciata PBS al fine di evitare la degradazione proteolitica.
- Fissare il tessuto nel 4% PFA in PBS in ghiaccio per 2-3 ore. Accertarsi che i lobi sono "sparsi" durante la fissazione. Questo facilita l'identificazione dei punti di riferimento anatomici dopo la ricostruzione.
- Lavare in eccesso di PBS per 30 min.
- Disidratare il pancreas stepwise in metanolo (33, 66%, 100%), 15 min / step. Ciò riduce al minimo la formazione di bolle durante la sbianca (vedere fase 5) e previene la distruzione cellulare durante congelamento-scongelamento (vedere fase 7).
- Incubare il tessuto appena preparato in MeOH: H 2 O 2: DMSO sbianca buffer in un rapporto 02:01:03 a RT per 24 ore per estinguere la fluorescenza tissutale endogena. Per i più grandi campioni, lo scambio di nuove bleachitampone ng e incubare per un altro 24 h.
- Lavare in MeOH eccesso, ON.
- Congelamento-scongelamento per almeno 5 cicli di -80 ° C - RT per facilitare la penetrazione anticorpo.
- Reidratare graduale torna TBST (33, 66%, 100%), 15 min / step.
- Blocco in TBST con 10% di siero (preferibilmente dalla stessa specie in cui si genera l'anticorpo secondario), 5% DMSO e 0,01% Naaz per 12-24 ore a RT
- Incubare con anticorpi primari in tampone bloccante per 48 ore, a temperatura ambiente, si estendono a 72 ore per grandi campioni (anticorpi usati qui sono elencati nella tabella dei reagenti).
- Lavare in TBST eccesso, ON.
- Incubare con anticorpi secondari coniugati fluorescenti per 48 ore, a temperatura ambiente, estendere a 72 ore per i più grandi campioni.
- Lavare in TBST eccesso, ON.
1,2
La procedura seguente descrive come montare il campione in agarosio e allegarlo al supporto personalizzata di esempio fatto (vedi Figura 7) Prima OPT scansione.
- Separare i lobi splenica, duodenale e gastrica secondo la figura 3A in Hörnblad et al 3. La relazione tra i lobi è ulteriormente chiarita in Hörnblad et al 11.
- Preparare 1,5% (w / v) di agarosio a bassa temperatura di fusione in dH 2 O, filtro, lasciare raffreddare a 37 ° C e lavare il tessuto in dH 2 O per lavare via il detergente e rimuovere bolle prima agarosio-embedding su ghiaccio.
- Tagliare un blocco di agarosio racchiude il campione e lasciato uno spacer cm ~ tra il campione e la base di agarosio. Ritagliare bordi taglienti (≤ 90 °) del blocco agarosio per ridurre dispersione della luce.
- Disidratare il campione stepwise in MeOH (33, 66%, 100%), lasciando il tempo per equilibrare tra ogni passo. Quando il campione affonda è considerato essere equilibrati.
- Cancellare il campione in una soluzione 1:02 di alcol benzilico: Benzyl Benzoate (BABB) fino a che non diventa trasparente. Scambio BABB soluzione e incubare per ulteriori 12 ore.
- Posizionare il campione eliminato nel supporto del campione e fissarlo inserendo due aghi attraverso il distanziatore agarosio attraverso i fori nelle flange del titolare.
- Collocare il campione nello scanner e immergerlo in una vaschetta piena di soluzione BABB compensazione. Quando si confrontano una serie di pancreas stesso ingrandimento dovrebbe essere utilizzato per tutte le scansioni. L'ingrandimento dovrebbe essere ottimizzato per il più grande campione nella serie.
1.3 Posizionamento del campione in AR
Il protocollo che segue descrive la procedura per posizionare con precisione un campione utilizzando la COM-AR algoritmo. Questa procedura è applicabile solo quando il ROI include l'intero campione. Per una descrizione dettagliata degli algoritmi, vedere Cheddad et al 2.
- Acquisire le immagini del campione in due posizioni per il both l'anatomia e canali di segnale. Posizione 1 a 0 ° (associato con l'asse X), mostrano la più grande area di proiezione, e la posizione 2 a 90 ° (associato con l'asse Z). Stiamo utilizzando il canale GFP per visualizzare l'anatomia.
- Applicare l'aspettativa-massimizzazione (EM) algoritmo sulle immagini di anatomia alla soglia del ROI.
- Calcolare i punti COM (ascisse) delle immagini binarie ottenute nella fase 2 sia di 0 ° e 90 ° proiezioni.
- Sovrapporre una linea verticale passante per il punto COM identificato calcolato nella fase 3 a 0 ° e 90 ° immagini del canale di segnale.
- Utilizzare le immagini acquisite nel passaggio 4 come riferimenti per spostare il campione in modo che la linea centrale del campo visivo passa attraverso i punti COM trovati del campione.
1.4 Scansione
- Regolare il tempo di esposizione per ottenere il massimo rapporto segnale-rumore possibile senza saturazioneTING tutte le aree di proiezione delle immagini. Ripetere l'operazione per tutti i canali da sottoporre a scansione.
- Selezionare il set di filtri per il primo canale di fluorescenza da analizzare. Emissioni da fluorofori λ più brevi possono eccitare fluorofori con più λ e quindi causare foto sbiancamento. Per ridurre al minimo questa possibilità, eseguire la scansione del fluoroforo con λ più lunga eccitazione prima.
- Aprire l'otturatore per illuminare il campione e raccogliere il segnale di fluorescenza su 360 °, ruotando il campione lungo l'asse verticale per ciascun canale. L'angolo di fase utilizzato per il NIR-OPT di installazione è di 0,9 ° e per lo scanner 3001 Bioptonics 0,45 °.
- Selezionare il filtro appropriato per il canale successivo e procedere come sopra.
2. Elaborazione computazionale e la ricostruzione
2,1 post-acquisizione di rilevamento e correzione errori di allineamento (A-valore di accordatura)
In tomografia a proiezione, è in generale necessarioassegnare un valore post-allineamento alle sporgenze per mettere a punto la posizione immagini lungo l'asse di rotazione prima ricostruzione. Tuttavia, una aberrazione piccolo angolo della telecamera verso l'asse ottico può causare non uniformi valori A lungo la lunghezza del campione e quindi indurre distorsioni geometriche. Per evitare tali distorsioni, un metodo di calcolo per trovare l'esatta e unificato post-allineamento valore (valore A) durante l'intero campione può essere applicato 2.
- Utilizzare una trasformata discreta di Fourier per dividere una proiezione del segnale specifico a 0 ° e 180 ° in 8 blocchi altezza pixel e calcolare lo spostamento lungo l'asse x (valore A) tra ogni blocco.
- Applicare una regressione lineare almeno per calcolare l'angolo θ ', che descrive la pendenza dell'asse x-spostamento lungo la lunghezza del campione, e di trovare un punto di rotazione centrale.
- Correggere per disallineamenti durante la scansione ruotando tutti progeZIONI θ '/ 2 in giro per il centro di rotazione.
2,2 equalizzazione Contrasto limitato istogramma adattativo (CLAHE)
Per facilitare l'individuazione e la segmentazione di oggetti (isolotti) mostrano segnali molto deboli, che sono a rischio di essere "thresholded fuori" durante la ricostruzione e / o la segmentazione per le valutazioni quantitative, un algoritmo CLAHE può essere applicato alle immagini di proiezione. L'operazione viene eseguita con CLAHE due trasformazioni intensità principali:
- Il contrasto locale è stimato e allineate ai non sovrapposte blocchi l'immagine proiettata.
- Le intensità sono poi normalizzati in corrispondenza delle zone di confine tra i blocchi tramite interpolazione bilineare.
Il nome contrasto limitata riferisce al limite clip, che è impostato per evitare di saturare pixel nell'immagine. In questo protocollo, il MATLAB built-in funzione "adapthisteq" è stato utilizzato e applicato con la c di default labbro limite di 0,01 e una dimensione di porzione di 256. Nota, la dimensione ottimale piastrella deve essere testato empiricamente e possono variare a seconda del campione analizzato. Maggiori dettagli su l'algoritmo e gli esempi si possono trovare in Hörnblad et al 3.
Nota: I passaggi sopra elencati di elaborazione di calcolo (tra cui COM-AR, messa a punto A-Valore e CLAHE, vedere 1,3-2,2) si basano su algoritmi standard e vengono eseguiti in MATLAB (Mathworks).
2,3 ricostruzione tomografica e iso-superficie di rendering
- Utilizzando un filtro retroproiezione algoritmo, le immagini corrette e normalizzato possono ora essere ricostruita con compensazione disallineamenti unificata e requisito minimo per l'ottimizzazione della gamma dinamica. In questo protocollo, tutte le ricostruzioni sono effettuate con il metodo di proiezione filtrata torna disponibile nel software NRecon (Skyscan), versione 1.6.8 (= "_blank"> Http://www.skyscan.be/products/downloads.htm). Nota, l'ingrandimento di un oggetto con immagini dipende dalla sua distanza dal punto focale della lente a meno geometria della trave parallela è implementata nella configurazione di imaging. Pertanto, quando l'importazione di un set di dati di proiezione al software NRecon è importante includere l'oggetto corretta distanza di sorgente (mm) e la direzione di rotazione dello scanner (per antioraria ingresso "cc" e per l'ingresso in senso orario "cw") in accompagnamento file di log, per evitare artefatti fascio a cono indotte durante la ricostruzione.
- Per visualizzare e quantificare la pila di sezioni virtuali ottenuti, generare 3D iso-superfici utilizzando un software di elaborazione delle immagini, come Imaris o Volocity.
Isolamento delle isole murine e procedure di trapianto sono stati eseguiti a Cella Dati preclinici di elaborazione del Diabetes Research Institute e Core modello traslazionale secondo protocolli esaminati e approvati dall'Università di Miami cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso. Il comitato etico per la ricerca sugli animali, nel nord della Svezia, ha approvato tutti gli altri esperimenti che coinvolgono animali.
Risultati
Nella presente relazione si descrive un protocollo per l'estrazione e l'elaborazione dei dati di calcolo in BCM pancreas roditori (e altri tessuti) con NIR-OPT (Figura 1). Come illustrato in figura 2, autofluorescense tessuto pancreatico dal campione è notevolmente diminuita come previsto nello spettro NIR. Questo porta ad un aumento significativo segnale medio di rumore (S: N) per la valutazione di isolotti di Langerhans insulina marcata. Dagli adattamenti di OPT all'imaging nella parte NIR dello spettro, come qui descritto, almeno tre canali specifici possono essere visualizzati con sufficiente S: rapporto N per consentire una valutazione di tipi cellulari anticorpo marcato in tutto il volume del pancreas murino con distinta canale di separazione (vedi figura 3 e 4). Applicata all'imaging dei processi diabetogeni e / o valutazioni BCM in generale, la tecnica permette quindi la visualizzazione e la quantificazione deiaree insulina positive relative alle circostante e / o interagendo tipi cellulari (vedi Figura 4). Tali valutazioni sono grazie alla maggiore profondità di penetrazione del tessuto ottenuto nella gamma NIR possibile effettuare in campioni molto più grandi rispetto al passato, compreso il pancreas di ratto, che è 3-5 volte più grande rispetto al suo omologo mouse (vedi Figura 5). Indipendentemente dal fatto che le lunghezze d'onda visibili o NIR sono utilizzati, l'attuazione di CLAHE può facilitare notevolmente OPT valutazioni base di BCM durante diverse condizioni genetiche e fisiologiche aumentando la sensibilità di rilevamento della tecnica (vedere Figura 6). Uno schema per il supporto del campione sviluppata è mostrato in Figura 7.
Figura 1. Diagramma di flusso che descrive i passaggi critici per OPT analisi basate su BCM in murpancreas ine. Il tempo necessario per valutare un pancreas tipico mouse è 13-14 giorni. La maggior parte del tempo viene consumato durante la lavorazione e la colorazione immunoistochimica del tessuto (10 giorni), la compensazione dei tessuti richiede circa 2 giorni, mentre la durata della scansione dipende dal tempo di esposizione necessario (normalmente circa 1 ora). La successiva elaborazione computazionale viene tipicamente eseguita in un giorno. Nota, il protocollo di colorazione relativamente lungo è ideale per l'elaborazione batch di grandi quantità di campioni.
Figura 2. Segnale rumore rapporto di valutazione della BCM a diverse lunghezze d'onda. Un lobo duodenale pancreas mouse colorati per l'insulina e con un cocktail di anticorpi secondari coniugati con fluorocromo (Alexa 488, 594, 680 e750), è stato utilizzato per determinare S: N coefficienti a lunghezze d'onda diverse. A, Le immagini mostrano il primo fotogramma di proiezione per ogni canale del segnale. B, grafico illustrante la media S: N per ciascun canale di segnale. I coefficienti sono stati determinati come l'intensità isolotto media (basata su 215 isolotti) divisa per l'intensità di fondo (la fluorescenza tessuto endogeno dal tessuto esocrino). C, il grafico mostra S: rapporti di N per le isole individuali in ogni canale normalizzata con l'S: N ottenuti per il canale 594 di Alexa. Un modo ANOVA è stato utilizzato per le analisi statistiche. Livelli di significatività indicati corrispondono agli ** p <0.01. Scala in bar (A) corrisponde a 1 mm. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura3. Separazione dei canali. A, anticorpi secondari coniugati con coloranti Alexafluor elencati nella tabella sono stati immobilizzati separatamente proteinG-sefarosio perline. B, Le perle fluorescenti sono stati poi integrati a diversi livelli in un fantasma agarosio e ripreso utilizzando filtri indicati.
Figura 4. OPT imaging basato multicanale nella ricerca sul diabete. A, OPT base iso-superficie di ricostruzione di un pancreas (12 settimane, lobo duodenale) dal diabetico non obeso (NOD) modello per diabete di tipo 1. Il campione è macchiato di insulina (isole β-cellule, pseudo colore blu); muscolatura liscia α-actina (vasi sanguigni, rossi) e CD3 (linfociti T infiltranti, verde). Gli anticorpi secondari utilizzati sono stati corrispondenti, Cy3, IRDye-680 e DyeLight-750, rispettivamente. Ilinserti (A'-A'' '), mostrano i canali dei segnali singoli. B, immagine OPT (blow up vista) di un lobo epatico mouse (lateralis lobus sinistri) innestato con isolotti singenici e ripreso con NIR-OPT due settimane dopo trapianto. Le isole di insulina che esprimono sono pseuodocolored in blu e il muscolo liscio α-actina navi positivi sono in rosso. L'approccio consente valutazioni di trapianto delle isole di distribuzione all'interno della rete vascolare. Barre scala corrisponde a 1 mm.
Figura 5. NIR-OPT facilita l'imaging di grandi campioni. A, Iso-superficie di rendering della distribuzione BCM in un pancreas di ratto dal modello Zucker Fatty per diabete di tipo 2 (lobo splenico a 9 mesi), che esemplifica la possibilità di provino immagine sul ratto scala pancreas di NIR-OPT. Come determinatoda questa tecnica il lobo visualizzato è ~ 6 volte più grande (v / v) rispetto al suo omologo mouse e ospita 10.139 insulina esprimere isole di Langerhans cui β-volume cellulare costituisce 1,32% del volume totale lobulare. B, corrispondente alla sezione tomografica linea tratteggiata in (A) illustra che le isole di tutte le profondità del tessuto vengono rilevati. C, Iso-superficie di rendering della distribuzione BCM in un pancreas topo (lobo splenico a 8 settimane) hanno mostrato come riferimento dimensione. Il lobo visualizzata ospita 2.490 isolotti di insulina che esprimono la cui β-cellule del volume costituisce il 0,89% del volume totale lobulare. Il pancreas sono macchiati con GP anti-insulina seguita da Alexa594 capra coniugato anti-GP (mouse) e IRDye 680 Donkey coniugata anti-GP (ratto) anticorpi rispettivamente. I campioni in (AC) sono raffigurati in scala e la barra di scala in (C) corrisponde a 2 mm.
Figura 6. CLAHE facilita la rilevazione di isolotti nel pancreas murino per immagini OPT. AC, Rappresentante iso-superficie le immagini di rendering di un OPT C57Bl / 6 pancreas mouse (lobo splenico a 8 settimane) marcato per l'insulina. Iso-superficie ricostruzioni di immagini OPT stati eseguiti prima (A, verde pseudo colorato) e dopo il protocollo CLAHE stato applicato (B, pseudo colore rosso). C, sovrapposizione dei dati non normalizzati in (A) ed i dati CLAHE trasformati in (B). C'-C ", rappresentativa overlay alto ingrandimento dei non normalizzati (A) e CLAHE trasformati (B) le immagini. Come mostrato dalla presenza di" red-solo "isolotti, lo script CLAHE facilita il rilevamento di piccolo segnale e bassa isolotti intensità. Nell'esempio raffigurato il campione attuale (dopo CLAHE trasformazione) harbored 2419 isolette con un volume di 1,74 mm 3 (numeri in base ai dati corrispondenti proiezione non trasformate 1057 isolette with un volume di 1,77 mm 3). D ed E, i dati di esempio di controllo (D) e l'ob / ob modello murino di diabete di tipo 2 12 (E) a 6 mesi che implementano il protocollo CLAHE. Si noti il massiccio aumento generale delle dimensioni delle isole in ob / ob pancreas (E). In (D) e (E) il contorno pancreas (grigio) è basato sul segnale dal autofluorescenza tessuto. Barra della scala in C è di 500 micron di AC. Barra della scala in C "corrisponde 200 micron in C 'e C''. Scala bar E corrisponde a 1 mm (D) e (E). Immagini di (AC) sono adattato da Hörnblad et al 3 e sono stati generati utilizzando il Bioptonics 3001 scanner.
Figura 7. Supporto del campione per il fissaggio dei campioni OPT. Il campione viene fissato inserendo aghi attraverso il distanziatore agarosio attraverso i fori predisposti nelle flange. Il titolare è incernierato al motore passo-passo tramite unforte magnete situato nella sua base. Questa configurazione omette l'uso di colle instabili e impedisce movimenti indesiderati del campione durante la scansione.
Discussione
Le tecniche descritte per l'imaging OPT consente l'estrazione di parametri spaziali e quantitativi in tutto il volume del pancreas murino. A causa di limitazioni nella risoluzione ottenibile per questo tipo di immagini si mesoscopica va notato che, come per la maggior parte delle modalità di imaging, più grande è il campione inferiore della risoluzione (Anche se l'uso di una risoluzione CCD superiore dovrebbe aumentare la risoluzione della scansione OPT) . Quindi, per la valutazione dei lobi intatti topo pancreatici, la tecnica al momento non fornisce sola risoluzione cella anche se vicino (circa 15-20 micron) 7. Ancora, per l'estrazione di distribuzione BCM nel pancreas topo protocolli hanno fornito dati che più ben corrispondono a quelli ottenuti dal punto esempio contando morfometria 3,13 Si segnala che, sebbene implementazione del protocollo CLAHE permette di individuare isolotti significativamente più , queste isole sono generalmente più piccole e non contributite sostanzialmente ai complessivi β-cellule volumi.
I protocolli immunoistochimici coinvolte sono relativamente lunghe (fino a due settimane), ma le mani reali in tempo per la preparazione dei campioni è breve e quindi la tecnica è adatto per lo studio di grandi coorti di animali 9. Se il potenziale di distribuzioni eterogenee è un punto di riferimento per l'indagine, va sottolineato che occorre prestare attenzione nella procedura relativa fissaggio e montaggio per evitare che il tessuto pancreatico si fissa in senso sfavorevole e un piatto ("stese" ) supporto del tessuto deve essere cercato per agevolare tali valutazioni.
Un importante problema quando si esegue OPT COM è che il campione è fissata in corrispondenza dell'asse di rotazione e che non si muove, verticalmente o orizzontalmente, durante la procedura di scansione. Pertanto, è essenziale avere una configurazione meccanica stabile ed un sistema ben funzionante per attaching il campione. Abbiamo risolto il problema con la costruzione di un supporto nuovo (Figura 7).
Geometria parallela non era vero per il nostro NIR-OPT o Bioptonics 3001 scanner, che è stato rilevato come spostamento verticale tra la schiena e posizioni anteriori di oggetti periferici nelle immagini registrate proiezione. Regolando l'oggetto a distanza di sorgente nel file di log dello scanner corrispondente (vedi 2.3.1) si potrebbe migliorare sensibilmente la qualità dei nostri dati e correggere le distorsioni geometriche ai bordi più esterni delle immagini di proiezione, che è di particolare importanza quando valutazione più grandi campioni.
Nel protocollo attuale, forniamo una proposta di set di filtri che permettono la visualizzazione di tre diversi canali specifici e un canale "anatomia" nelle valutazioni di preparazioni pancreatiche intatti. Ovviamente queste impostazioni può essere modulata per meglio adattarsi alle fluorocromi utilizzati per un determinato studio, anche se, come per tutte le forme di fluorescenzamicroscopia cento, il rischio potenziale del segnale sanguinare-through deve essere attentamente valutato. Lo studio di isolette insulina marcata con fluorocromi eccitati sopra 750 nm non è stato ancora possibile da noi utilizzando la lampada ad alogenuri metallici che il nostro set up utilizza. E 'possibile che una telecamera con ancora maggiore efficienza quantica nelle lunghezze d'onda pertinenti in combinazione con fonti alternative di luce (ad esempio diodi laser) potrebbe aumentare il potenziale di NIR-OPT ulteriormente ea permettere l'imaging a lunghezze d'onda ancora più elevati.
OPT immagini è una tecnica estremamente versatile per le valutazioni spaziali e quantitative di campione biomedici sul mm cm scala. Anche se i protocolli qui presentati sono stati sviluppati con lo scopo principale del pancreas / diabete di ricerca che dovrebbe essere possibile tradurre la ricerca su altre specie, tipi di campioni e marcatori. Con la possibilità di visualizzare diversi canali distinti in preparazioni pancreatiche intatti, NIR-OPT immagini fLTERIORI ha il potenziale come strumento per valutare la specificità assorbimento di agenti di contrasto destinati non invasivi valutazioni da altre modalità di imaging, purché questi agenti di contrasto possono essere destinate a svolgere anche un fluoroforo rilevabile da OPT.
Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Dr. P. Lindström è riconosciuto per la fornitura di topi ob / ob. J. Lehtonen è riconosciuto per l'assistenza con la produzione video e J. Gilbert aiuto con l'editing. Questo studio è stato supportato anche da finanziamenti del Diabetes Research Institute Foundation (AP), la Juvenile Diabetes Research Foundation (AP e UA), la Commissione europea (FP-7, convenzione di sovvenzione n.: CP-IP 228933-2) (JS e UA), le Fondazioni Kempe, Università di Umea e il Consiglio svedese della ricerca a UA
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente / materiale | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
| Metanolo | Scharlau | ME03162500 | |
| 30% H 2 O 2 | Scharlau | HI01362500 | |
| Benzyl Alcohol | Scharlau | AL01611000 | |
| Benzoato di benzile | Scharlau | BE01851000 | |
| Basso punto di fusione agarosio | LONZA | 50100 | |
| Paraformaldeide (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Topo anti-asma-Cy3 | Sigma-Aldrich | C6198 | Anticorpo primario |
| Coniglio anti-CD3 | Sigma-Aldrich | C7930 | Anticorpo primario |
| Guinea Pig anti-Ins | DAKO | A0564 | Anticorpo primario |
| Donkey contro GP-IRDye680 | LI-COR Biosciences | 926-32421 | Anticorpo secondario |
| Di capra anti-Rb DyeLight750 | Thermo Scientific | 35570 | Anticorpo secondario |
| Di capra anti-GP Alexa594 | Molecular Probes | A-11.076 | Anticorpo secondario |
| Di capra anti-GP Alexa488 | Molecular Probes | A-11.008 | Anticorpo secondario |
| Capra antiGP-Alexa594 | Molecular Probes | A-11.012 | Anticorpo secondario |
| Di capra anti-GP Alexa680 | Molecular Probes | A-21.076 | Anticorpo secondario |
| Di capra anti-GP Alexa750 | Molecular Probes | A-21.039 | Anticorpo secondario |
| OPT Skyscan 3001 | Bioptonics | OPT-Scanner | |
| Leica MZ FLIII | Leica Microsystems | Stereomicroscopio | |
| Leica Obiettivo 0.5x | Leica Microsystems | 10446157 | |
| Leica Camera adattatore 1,0 x | Leica Microsystems | 10445930 | |
| EL6000 ioduri metallici | 11504115 | Lightsource | |
| Liquid Light Guide | 11504116 | ||
| Cuvette | Hellma Analytics | 6030-OG | 55 x 55 x 52.5 mm |
| Specchio | Edmund Optics | F68-334 | 50 x 50 mm |
| Andor Ikon-M | Andor Tecnologia | DU934N-BV | Retroilluminato CCD |
| Filterset | Tecnologia Chroma | 41021-MZFLIII | TXR, Alexa-594, Cy3 |
| Filterset | Tecnologia Chroma | 41022-MZFLIII | IRDye680, Alexa-680 |
| Filterset | Tecnologia Chroma | 49037-MZFLIII | Dylight750, Alexa-750 |
| ProteinG-Sepharose perline | GE Healthcare | 17-0618-01 | Protein G Sepharose Fast Flow 4 |
| Di sodio azide | Sigma-Aldrich | 08591 | Azide di sodio 0,1 M soluzione |
Riferimenti
- Sharpe, J., et al. Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296, 541-545 (2002).
- Cheddad, A., Svensson, C., Sharpe, J., Georgsson, F., Ahlgren, U. Image Processing Assisted Algorithms for Optical Projection Tomography. IEEE Trans. Med. Imaging. , (2012).
- Hornblad, A., Cheddad, A., Ahlgren, U. An improved protocol for optical projection tomography imaging reveals lobular heterogeneities in pancreatic islet and beta-cell mass distribution. Islets. 3, 204-208 (2011).
- Holmberg, D., Ahlgren, U. Imaging the pancreas: from ex vivo to non-invasive technology. Diabetologia. 51, 2148-2154 (2008).
- Ahlgren, U., Gotthardt, M. Approaches for imaging islets: recent advances and future prospects. Adv. Exp. Med. Biol. 654, 39-57 (2010).
- Sharpe, J. Optical projection tomography. Annu. Rev. Biomed. Eng. 6, 209-228 (2004).
- Alanentalo, T., et al. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nat. Methods. 4, 31-33 (2007).
- Alanentalo, T., et al. High-resolution three-dimensional imaging of islet-infiltrate interactions based on optical projection tomography assessments of the intact adult mouse pancreas. J. Biomed. Opt. 13, 054070(2008).
- Alanentalo, T., et al. Quantification and Three-Dimensional Imaging of the Insulitis-Induced Destruction of beta-Cells in Murine Type 1 Diabetes. Diabetes. 59, 1756-1764 (2010).
- Sun, G., et al. Ablation of AMP-activated protein kinase alpha1 and alpha2 from mouse pancreatic beta cells and RIP2.Cre neurons suppresses insulin release in vivo. Diabetologia. 53, 924-936 (2010).
- Hornblad, A., Eriksson, A. U., Sock, E., Hill, R. E., Ahlgren, U. Impaired spleen formation perturbs morphogenesis of the gastric lobe of the pancreas. PLoS One. 6, e21753(2011).
- Lindström, P. The physiology of the Obese-Hyperglycemic Mice (ob/ob Mice). The Scientific World JOURNAL. 7, 665-685 (2007).
- Bock, T., Pakkenberg, B., Buschard, K. Genetic background determines the size and structure of the endocrine pancreas. Diabetes. 54, 133-137 (2005).
Ristampe e permessi
Errata corrige
Formal Correction: Erratum: Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of β-cell Mass Distribution in Diabetes Research
Posted by JoVE Editors on 11/05/2018. Citeable Link.
A correction was made to Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of β-cell Mass Distribution in Diabetes Research. In Protocol section 1.1, the order of the listed chemicals MeOH:H2O2:DMSO has accidentally been switched and should instead be MeOH:DMSO:H2O2.
Protocol section 1.1 was changed from:
Incubate the tissue in freshly prepared MeOH:H2O2:DMSO bleaching buffer in a 2:1:3 ratio at RT for 24 hr to quench endogenous tissue fluorescence. For larger samples, exchange to new bleaching buffer and incubate for another 24 hr.
to:
Incubate the tissue in freshly prepared MeOH:DMSO:H2O2 bleaching buffer in a 2:1:3 ratio at RT for 24 hr to quench endogenous tissue fluorescence. For larger samples, exchange to new bleaching buffer and incubate for another 24 hr.
Tag
