高级别瞬态表达重组蛋白的植物高效的农杆菌
Summary
植物提供了一种新的系统，以商业规模生产药物蛋白，更具可扩展性，成本效益和安全比目前的表达范式。在这项研究中，我们报告一个简单方便，且可扩展的方法，引入目标基因<em>农杆菌</em进入植物蛋白的瞬时表达。
Abstract
哺乳动物细胞培养物是主要的商业化生产人用疫苗和治疗性蛋白质的平台。但是，它不能满足日益增长的全球需求由于其有限的可扩展性和成本高的药品。植物已证明是最有前途的替代，健壮，可伸缩的，低的成本和安全的药品生产平台之一。最近开发的基于病毒的载体，使快速和高层次的重组蛋白在植物中的瞬时表达。为了进一步优化瞬时表达系统的效用，我们展示了一个简单，高效，可扩展的方法引入到植物组织在这项研究中含有目标基因的农杆菌 。我们的研究结果表明，农杆菌与注射器和真空方法所导致的农杆菌介导的高效引入到两个荧光蛋白的叶子和严谨的生产; GFP和DsRed的。此外，我们展示了这两种方法所提供的独特的优势。注射器浸润简单，不需要昂贵的设备。它也允许灵活地渗透到整个假与靶基因，或在一个叶片上的多个目标基因引入。因此，它可以用于实验室规模的重组蛋白的表达，以及用于比较不同的蛋白质或载体的产率或表达动力学。简单的注射器渗透也表明其效用为主题的生物技术在高中和大学教育。与此相反，真空渗入是更强大的，并可以按比例增加的商业生产药用蛋白。它还提供了能够agroinfiltrate植物物种不适合如生菜和拟南芥浸润注射器的优势。总体而言，结合注射器和真空农杆菌的研究人员和教育工作者提供了一个简单，高效和强大的方法瞬态蛋白表达。这将大大促进药物蛋白和发展，促进科学教育。
Introduction
自20世纪70年代以来，植物已被探讨，作为替代品的哺乳动物，昆虫，细菌的细胞培养物的商业生产重组蛋白和蛋白质疗法1。以植物为基础的系统，生物制药的表达，表明承诺在最近几年一些新的治疗方法的疾病，如高雪氏病，H5N1禽流感3，在临床试验中显示了成功。主管机制的开发重组蛋白在植物中表达的几十年中，因为这些最初的实验中已经创建了用于植物为基础的系统中，有三个主要理由改变目前的蛋白质生产范式的潜力。首先，有一个显着的成本下降所致哺乳动物，昆虫，细菌的生物反应器需要相当大的启动成本，昂贵的生长介质，下游纯化的复杂工序4。创造稳定的转基因植物线也可以让他们超越其他表达系统的可扩展性蛋白表达植物可以种植和收获的农业规模5。其次，以植物为基础的表达系统中显着地减少从对人类的蛋白质表达的主机发送的人或动物的病原体的危险性，展示在公众安全6的优越性。最后，植物利用类似于哺乳动物细胞的真核细胞内膜系统，可以进行适当的翻译后修饰的蛋白质，包括糖基化和组件的多个亚单位蛋白质7。这种能力使植物为基础的系统，提前基于原核系统中，如细 菌，因为一个更广泛的重组蛋白类药物，包括单克隆抗体（mAbs），有一个更复杂的结构，并需要大量的翻译后修饰或组件8。
有两个主要的适当疼痛在植物中表达的重组蛋白。第一个是一个稳定的转基因品系，克隆到编码目标蛋白的DNA的表达盒引入到无论是核或叶绿体基因组的发展。这样做，外源DNA变成通过遗传后代，可以极大地提高了可扩展性，远远超出其他表达系统1。核基因组的外源DNA的通常是由根癌土壤杆菌感染植物组织实现，或较少，通过微粒轰击的组织9。然后，使用植物激素诱导分化和生长的转基因植物组织如根和叶。无法实现的叶绿体基因组中的变换可以与甲农杆菌 ，但完全依赖于黄金或钨颗粒涂发射弹道与DNA导入植物细胞。表达recombina的第二种方法nt的蛋白质在植物中的瞬时表达通过10。在这种情况下，感兴趣的基因的病毒衍生的载体传递通过A。经历一个过程的充分开发植物叫农杆菌农杆菌。相反交付的基因构建体整合到植物基因组，然后将开始，直接瞬态生产所需的蛋白质，它可以被收获和一个短的潜伏期后，分离。瞬时基因表达提供了更大的整体蛋白的积累，以及一个改进的时间生产蛋白质的优势，如植物准备收获后约1-2周农杆菌11。这是明显快于稳定的转基因植物线，这可能需要数个月至一年的生成，选择和确认的过程。然而，这也是瞬时表达系统的局限性，因为它不会产生遗传稳定的工厂里未列名可以用来产生大规模的商业生产的种子银行。尽管这样的方法已被开发以提高大规模的瞬时表达。在这里，我们演示了一种瞬态蛋白表达烟草植物由A.交付使用解构病毒载体的代农杆菌 。
A.交付正在开发的两个主要方法农杆菌进入植物组织：台秤通过注射器通过真空室的大规模渗透浸润。这里描述的这两个协议都使用N.本生，这是密切相关的普通烟草厂，寄主植物两个荧光蛋白的瞬时表达绿色荧光蛋白（GFP）的，从水母维多利亚和红色荧光蛋白从Discosoma珊瑚（红色荧光蛋白）12,13。 N.本生是最常见的寄主植物重组蛋白，因为它是服从遗传转化，可以产生大量的生物质迅速，是一位多产的种子生产，规模化生产14。的另一个优点，使用全本生作为蛋白表达的主机是可用的多种表达载体2,5。在这项研究中，两个解构病毒载体的烟草花叶病毒（TMV）RNA复制系统（MagnICON向量）和豆黄矮病毒（BeYDV）DNA复制系统（geminiviral向量）4,11是来自于其他的，基于15-18，都是用来携带绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白基因，并把他们交N. A.本生细胞通过根癌农杆菌的三DNA构建将被使用的GFP或红色荧光蛋白与MagnICON载体的表达。它们包括的5'模块（pICH15879）含有启动子和其他的遗传元件的驱动表达的靶基因，含有感兴趣的基因的3'模块（PICH-GFP或PICH红色荧光蛋白），以及整合模块（pICH14011）编码一种酶，它集成了5'和3'的模块组合在一起表达后8,15。 3个DNA构建体，还需要表达用geminiviral载体。除了 含有的的目标的基因（pBYGFP或pBYDsRed）的复制的载体，载体编码复制蛋白（pREP110）的扩增所需的目标复制11,14,16。此外，列入番茄丛矮病毒的载体沉默抑制p19的是理想的高层次目标基因的表达11,16。
一般而言，有三种主要的步骤引入到植物细胞的基因重组蛋白通过农杆菌包括植物生长，A.根癌土壤杆菌培养制备，渗透。作为此过程的最终成功的每一步都是关键，因此，详细描述每个两个注射器渗透和下面的真空渗透。
Protocol
Representative Results
Discussion
全球蛋白质为基础的药品的日益增加的需求所需要的新的生产平台，健壮，可伸缩的，低的成本和安全。植物已显示出是一个最有前途的替代生产系统生产药用蛋白。近年来，开发的解构的病毒为基础的载体已启动，瞬时表达的蛋白质在植物中，从而大大提高了植物表达系统2,10的速度和产率。为了进一步优化瞬时表达系统的效用，我们展示了一个简单而有效的和可扩展的方式引入到植物?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢R. Sun和其他学生陈的实验室所作出的贡献，植物材料的产生。我们也感谢D.格林博士对他的支持本科生科研技术和创新学院（CTI）。这项研究是由美国国立卫生研究院资助U01 AI075549和1R21AI101329陈问：和上证授予CTI亚利桑那州立大学的陈问：部分支持。 ，J. M.登特·柳辛格·乌尔塔多和J. Stahnke是由上证所补助金支持的本科生。
Materials
| Reagents | |||
| GFP | Invitrogen | V353-20 | www.invitrogen.com See reference: Lico and Chen, et al 2008 |
| DsRed | Clontech | 632152 | www.clontech.com See reference: Baird and Zacharias, et al 2000 |
| MagnICON Vector | Icon Genetics | n/a | www.icongenetics.com See reference: giritch and Marillonnet, et al 2006 |
| Geminiviral Vector | Author’s Lab | n/a | See reference: Chen and He, et al 2011 |
| N. benthamiana | Author’s Lab | n/a | herbalistics.com.au |
| Agrobacterium tumefaciens strain gv3101 | Author’s Lab | n/a | See reference: Lai and Chen 2012 |
| LB Agar Carbenicillin-100, plates | Sigma | L0418 | www.sigmaaldrich.com |
| LB Agar Kanamycin-50, plates | Sigma | L0543 | www.sigmaaldrich.com |
| Magnesium sulfate hepa hydrate | Sigma | M2773-500 g | www.sigmaaldrich.com |
| Bacto-Tryptone | Fisher | 73049-73-7 | www.fishersci.com |
| Bacto Yeast Extract | Becton, Dickinson & CO. | REF 212750 | www.bd.com |
| Difco Nutrient Broth | Becton, Dickinson & CO. | REF 234000 | www.bd.com |
| MES hydrate Buffer | Sigma | M8250-1kg | www.sigmaaldrich.com |
| Carbenicillin | Sigma | C1613-1ML | www.sigmaaldrich.com |
| Kanamycin | Sigma | 70560-51-9 | www.sigmaaldrich.com |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 221465 | www.sigmaaldrich.com |
| Jack’s Fertilizer | Hummert International | Jul-25 | www.hummert.com |
| Equipment | |||
| Vacuubrand MD4 Vacuum Pump | Fisher | 13-878-113 | www.fishersci.com |
| Vacuum Air Regulator Valve | Fisher | NC9386590 | www.fishersci.com |
| Desiccator 12 1/8″ with O ring | Fisher | 08-594-15C | www.fishersci.com |
| 3 L Tub | Rubber-Maid | n/a | Rubbermaid Servn’ Saver Bowl, 10-cup will work |
| plate/shelf 230ML | Fisher | NC9489269 | www.fishersci.com |
| Peat Pellet | Hummert International | 14-2370-1 | www.hummert.com |
| Propagation Tray Dome | hydrofarm | 132052 | www.hydroponics.net |
| Propagaiton Tray | hydrofarm | 138758 | www.hydroponics.net |
| Virbo Hand Seeder | Gro-Mor INC | n/a | www.gro-morent.com |
| Flora Cart 4 shelf | Hummert International | 65-6924-1 | www.hummert.com |
| 15 ml Round Bottom Culture Tubes | Sigma | CLS430172-500EA | http://www.sigmaaldrich.com |
| Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | www.bio-rad.com |
| Spectrophotometer Cuvettes | Bio-Rad | 223-9950 | www.bio-rad.com |
| Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1415-2500 | www.usascientific.com |
| Benchtop Centrifuge | Bio-Rad | 166-0602EDU | www.bio-rad.com |
| Incubator/Shaker | Eppendorf | Excella E25 | www.eppendorf.com |
| Ultraviolet Light Model#: UVGL-25 | UVP | 95-0021-12 | www.uvp.com |
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