Effektiv Agroinfiltration av växter för hög nivå Transient Expression av rekombinanta proteiner
Summary
Växter har ett nytt system för produktion av farmaceutiska proteiner i kommersiell skala som är mer skalbar, kostnadseffektiv och säker än nuvarande uttryck paradigm. I denna studie, rapporterar vi ett enkelt och bekvämt, men ändå skalbar metod för att införa mål-genen innehåller<em> Agrobacterium tumefaciens</em> In växter för protein övergående uttryck.
Abstract
Däggdjurscellkultur är den viktigaste plattformen för kommersiell produktion av humana vacciner och terapeutiska proteiner. Däremot kan inte möta den ökande globala efterfrågan på läkemedel på grund av sin begränsade skalbarhet och höga kostnader. Växter har visat sig vara en av de mest lovande alternativa läkemedel produktionsplattformar som är robusta, skalbara, billig och säker. Den senaste utvecklingen av virus-baserade vektorer har möjliggjort snabb och hög nivå transient expression av rekombinanta proteiner i växter. För att ytterligare optimera användbarheten av transienta expressionssystem, visar vi en enkel, effektiv och skalbar metod för att införa mål-gen som innehåller Agrobacterium i växtvävnad i denna studie. Våra resultat tyder på att agroinfiltration med både spruta och vakuum metoder har resulterat i en effektiv introduktion av Agrobacterium i blad och robust produktion av två fluorescerande proteiner, GFP och DsRed. Vidarevi visar de unika fördelar som erbjuds av båda metoderna. Spruta infiltration är enkel och behöver inte dyr utrustning. Det ger också möjlighet att antingen infiltrera hela ledigheten med ett mål gen, eller att införa gener i flera mål på ett blad. Således, kan den användas för laboratorieskala uttryck av rekombinanta proteiner samt för att jämföra olika proteiner eller vektorer för avkastning eller uttryck kinetik. Enkelheten i sprutan infiltration antyder också dess användbarhet i high school och college utbildning för ämnet bioteknik. I motsats härtill är vakuuminfiltrering mer robust och kan skalas upp för kommersiell framställning av farmaceutiska proteiner. Det ger också fördelen av att kunna agroinfiltrate växtarter som inte är mottaglig för spruta infiltration såsom sallat och Arabidopsis. Sammantaget ger kombinationen av sprutan och vakuum agroinfiltration forskare och lärare en enkel, effektiv och robustmetodik för övergående proteinuttryck. Det kommer att underlätta utvecklingen av farmaceutiska proteiner och främja naturvetenskaplig utbildning.
Introduction
Sedan 1970-talet har växter undersökts som alternativ till däggdjurs-, insekt, och bakteriella cellkulturer för kommersiell produktion av rekombinanta proteiner och terapi protein 1. Växt-baserade system för uttryck av biologiska läkemedel har visat lovande resultat i de senaste åren som flera nya behandlingar för sjukdomar, som Gauchers sjukdom 2, och aviär H5N1 influensa 3, har visat framgång i kliniska prövningar. Utvecklingen av behöriga mekanismer för rekombinant proteinuttryck i växter i årtionden eftersom dessa initiala experiment har skapat förutsättningar för växt-baserade system för att förändra den nuvarande paradigm av protein produktion av tre huvudsakliga skäl. För det första finns det en märkbar minskning av kostnaderna som däggdjur, insekter och bakterier bioreaktorer kräva betydande startkostnader, dyra odlingssubstrat, och komplicerade processer för nedströms rening 4. Skapandet av en stabil transgen växtlinjer ger också dem att växa snabbare än skalbarhet av andra expressionssystem som protein uttryckande växter kan odlas och skördas på en jordbruks-skala 5. Andra växt-baserade expressionssystem avsevärt minska risken för överföring av en människa eller ett djur patogen från protein-uttryckande värden till människor, visar överlägsenhet i allmän säkerhet 6. Slutligen kraftverk utnyttja en eukaryot endomembrane system som liknar däggdjursceller, vilket möjliggör riktig post-translationell modifiering av proteiner inkluderande glykosylering och sammansättning av multipel-subenhetsproteinema 7. Denna förmåga sätter växt-baserade system framåt av de baserade på prokaryota system, såsom bakterier, eftersom ett större antal av farmaceutiska rekombinanta proteiner, inklusive monoklonala antikroppar (mAb), har en mer komplicerad struktur och kräver omfattande posttranslationella modifieringar eller montering 8.
Det finns två stora lämpligavärk till att uttrycka rekombinanta proteiner i växter. Det första är utvecklingen av en stabilt transgen linje, där DNA som kodar för målproteinet klonas in i en expressionskassett och introducerade till antingen nukleära eller kloroplast genom. På så sätt blir det främmande DNA ärftliga genom efterföljande generationer och möjliggör enormt förbättrad skalbarhet, långt bortom den av andra expressionssystem 1. Införande av exogent DNA till det nukleära genomet uppnås vanligen genom Agrobacterium tumefaciens infektion i växtvävnad eller, mindre ofta, genom mikroprojektilbombardemang av vävnaden 9. Växthormoner används sedan för att inducera differentiering och tillväxt av transgen växtvävnad såsom rötter och blad. Transformation av kloroplasten genomet kan inte uppnås med A. tumefaciens, utan förlitar sig helt på guld eller volfram partiklar belagda med DNA sköt ballistiskt i växtceller. Den andra metoden att uttrycka rekombinationnt protein i växter är genom övergående uttryck 10. I detta scenario, är virus-härledda vektorer härbärgerar genen av intresse levereras via A. tumefaciens till fullt utvecklade växter genom en process som kallas agroinfiltration. I stället för att integrera i växtgenomet, kommer den levererade genkonstruktionen börjar sedan att styra transitorisk produktion av det önskade proteinet, som kan skördas och isoleras efter en kort inkubationstid. Transient genuttryck erbjuder fördelen med större övergripande proteinackumulering liksom en förbättrad tid för proteinproduktion, som växter kommer att vara redo att skörda cirka 1-2 veckor efter agroinfiltration 11. Detta är betydligt snabbare än de processer av produktion, urval och bekräftelse av stabila transgena växter linjer, vilket kan ta flera månader till ett år. Detta är dock också en begränsning av övergående uttryck systemet, eftersom det inte kommer att ge genetiskt stabil växt liian som kan användas för att generera en fröbank för storskalig kommersiell produktion. Trots detta, har metoder utvecklats för att förbättra storskalig transient uttryck. Här visar vi en metod för generering av övergående protein-uttryckande Nicotiana benthamiana anläggningar som använder deconstructed virala vektorer levereras av A. tumefaciens.
Två stora metoder utvecklas för leverans av A. tumefaciens i växtvävnad: bänkskala infiltration via spruta och storskalig infiltration via vakuumkammare. Båda protokollen beskrivs här med N. benthamiana, som är nära besläktad med den gemensamma tobaksplantan, som värdväxt för övergående uttryck av två fluorescerande proteiner: det grönt fluorescerande protein (GFP) från maneten Aequorea victoria och röda fluorescerande proteinet från Discosoma korall (DsRed) 12,13. N. benthamiana är den vanligaste värdväxt förrekombinant protein eftersom det är mottaglig för genetisk transformation, kan ge stora mängder biomassa snabbt, och är en flitig frötillverkaren för skala upp produktionen 14. En annan fördel med att använda N. benthamiana som värdar för proteinuttryck är att det finns en mängd expressionsvektorer 2,5. I denna studie två deconstructed virala vektorer, en baserad på en tobakmosaikvirus (TMV)-RNA-replikon-systemet (MagnICON vektorerna) och det andra härrör från böna gul dvärg virus (BeYDV) DNA replikon-systemet (geminiviral vektorer) 4,11, 15-18, används för att bära GFP och DsRed genen och giva dem i N. benthamiana celler via A. tumefaciens. tre DNA-konstruktioner kommer att användas för GFP eller DsRed uttryck med MagnICON vektorer. De inkluderar 5'modulen (pICH15879) innehållande promotorn och andra genetiska element för att driva uttrycket av målgenen, 3'-modul som innehåller genen av intresse (PICH-GFP eller PICH-DsRed) och integras modulen (pICH14011) som kodar för ett enzym som integrerar 5 'och 3' moduler tillsammans vid uttryck 8,15. Tre DNA-konstruktioner behövs också för uttryck med geminiviral vektorer. Förutom vektorer innehållande replikonet av målgenen (pBYGFP eller pBYDsRed), en vektor som kodar för replikering protein (pREP110) som krävs för amplifiering av mål replikon 11,14,16. Dessutom är införandet av en vektor som kodar för den tysta suppressor p19 från tomat buskig stunt virus önskas för hög nivå målgenuttryck 11,16.
Det finns i allmänhet tre viktiga steg för införandet av gener av rekombinanta proteiner i växtceller genom agroinfiltration inklusive växttillväxt, A. tumefaciens kultur förberedelse, och infiltration. Eftersom varje steg är avgörande för den slutliga framgången av detta förfarande, alltså, en detaljerad beskrivning för varje tillhandahållsför både spruta infiltration och vakuuminfiltrering nedan.
Protocol
Representative Results
Discussion
De ökande kraven på proteinläkemedel kräver världsomfattande nya produktionsplattformar som är robusta, skalbara, billig och säker. Växter har visat sig vara en av de mest lovande system alternativa produktionsmetoder för farmaceutisk protein produktion. Under senare år har utvecklingen av deconstructed virus-baserade vektorer aktiverat transient expression av proteiner i växter, vilket kraftigt ökar hastigheten och utbytet av system växtexpressionsvektorer 2,10. För att ytterligare optimera nyt…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar R. Sun och andra studenter av Chen: s Laboratorium för deras bidrag till plantera materiella generation. Vi tackar även Dr D. Grön för hans stöd av grundutbildningen forskningen i Högskolan of Technology-och Innovation (CTI). Denna forskning stöttades i del av NIH bidrag U01 AI075549 och 1R21AI101329 till Q. Chen, och en SSE bidrag från CTI av Arizona State University till Q. Chen. K. Leuzinger, M. Dent, J. Hurtado, och J. Stahnke är grundutbildningen studenter som stöds av den SSE bidraget.
Materials
| Reagents | |||
| GFP | Invitrogen | V353-20 | www.invitrogen.com See reference: Lico and Chen, et al 2008 |
| DsRed | Clontech | 632152 | www.clontech.com See reference: Baird and Zacharias, et al 2000 |
| MagnICON Vector | Icon Genetics | n/a | www.icongenetics.com See reference: giritch and Marillonnet, et al 2006 |
| Geminiviral Vector | Author’s Lab | n/a | See reference: Chen and He, et al 2011 |
| N. benthamiana | Author’s Lab | n/a | herbalistics.com.au |
| Agrobacterium tumefaciens strain gv3101 | Author’s Lab | n/a | See reference: Lai and Chen 2012 |
| LB Agar Carbenicillin-100, plates | Sigma | L0418 | www.sigmaaldrich.com |
| LB Agar Kanamycin-50, plates | Sigma | L0543 | www.sigmaaldrich.com |
| Magnesium sulfate hepa hydrate | Sigma | M2773-500 g | www.sigmaaldrich.com |
| Bacto-Tryptone | Fisher | 73049-73-7 | www.fishersci.com |
| Bacto Yeast Extract | Becton, Dickinson & CO. | REF 212750 | www.bd.com |
| Difco Nutrient Broth | Becton, Dickinson & CO. | REF 234000 | www.bd.com |
| MES hydrate Buffer | Sigma | M8250-1kg | www.sigmaaldrich.com |
| Carbenicillin | Sigma | C1613-1ML | www.sigmaaldrich.com |
| Kanamycin | Sigma | 70560-51-9 | www.sigmaaldrich.com |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 221465 | www.sigmaaldrich.com |
| Jack’s Fertilizer | Hummert International | Jul-25 | www.hummert.com |
| Equipment | |||
| Vacuubrand MD4 Vacuum Pump | Fisher | 13-878-113 | www.fishersci.com |
| Vacuum Air Regulator Valve | Fisher | NC9386590 | www.fishersci.com |
| Desiccator 12 1/8″ with O ring | Fisher | 08-594-15C | www.fishersci.com |
| 3 L Tub | Rubber-Maid | n/a | Rubbermaid Servn’ Saver Bowl, 10-cup will work |
| plate/shelf 230ML | Fisher | NC9489269 | www.fishersci.com |
| Peat Pellet | Hummert International | 14-2370-1 | www.hummert.com |
| Propagation Tray Dome | hydrofarm | 132052 | www.hydroponics.net |
| Propagaiton Tray | hydrofarm | 138758 | www.hydroponics.net |
| Virbo Hand Seeder | Gro-Mor INC | n/a | www.gro-morent.com |
| Flora Cart 4 shelf | Hummert International | 65-6924-1 | www.hummert.com |
| 15 ml Round Bottom Culture Tubes | Sigma | CLS430172-500EA | http://www.sigmaaldrich.com |
| Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | www.bio-rad.com |
| Spectrophotometer Cuvettes | Bio-Rad | 223-9950 | www.bio-rad.com |
| Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1415-2500 | www.usascientific.com |
| Benchtop Centrifuge | Bio-Rad | 166-0602EDU | www.bio-rad.com |
| Incubator/Shaker | Eppendorf | Excella E25 | www.eppendorf.com |
| Ultraviolet Light Model#: UVGL-25 | UVP | 95-0021-12 | www.uvp.com |
Riferimenti
- Chen, Q., Mou, B., Scorza, R. . Transgenic Horticultural Crops: Challenges and Opportunities – Essays by Experts. , 86-126 (2011).
- Chen, Q., Lai, H. Plant-derived virus-like particles as vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9, 26-49 (2013).
- Landry, N., et al. Preclinical and clinical development of plant-made virus-like particle vaccine against avian H5N1 influenza. PLoS One. 5, e15559 (2010).
- Lai, H., Chen, Q. Bioprocessing of plant-derived virus-like particles of Norwalk virus capsid protein under current Good Manufacture Practice regulations. Plant Cell Reports. 31, 573-584 (2012).
- Chen, Q. Expression and Purification of Pharmaceutical Proteins in Plants. Biological Engineering. 1, 291-321 (2008).
- Chen, Q. Turning a new leaf. European Biopharm. Rev. 2, 64-68 (2011).
- Chen, Q., Levine, M. M., et al. . New Generation Vaccines. , 306-315 (2009).
- Lai, H., et al. Monoclonal antibody produced in plants efficiently treats West Nile virus infection in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 2419-2424 (2010).
- Buswell, S., Medina-Bolivar, F., Chen, Q., Van Cott, K., Zhang, C. Expression of porcine prorelaxin in transgenic tobacco. Annals of the New York Academy of Sciences. 1041, 77-81 (2005).
- Lico, C., Chen, Q., Santi, L. Viral vectors for production of recombinant proteins in plants. J. Cell. Physiol. 216, 366-377 (2008).
- Chen, Q., He, J., Phoolcharoen, W., Mason, H. S. Geminiviral vectors based on bean yellow dwarf virus for production of vaccine antigens and monoclonal antibodies in plants. Hum. Vaccin. 7, 331-338 (2011).
- Tsien, R. Y. The Green Fluorescent Protein. Annual Review of Biochemistry. 67, 509-544 (1998).
- Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97, 11984-11989 (2000).
- Lai, H., He, J., Engle, M., Diamond, M. S., Chen, Q. Robust production of virus-like particles and monoclonal antibodies with geminiviral replicon vectors in lettuce. Plant Biotechnology Journal. 10, 95-104 (2012).
- Giritch, A., et al. Rapid high-yield expression of full-size IgG antibodies in plants coinfected with noncompeting viral vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14701-14706 (2006).
- Huang, Z., Chen, Q., Hjelm, B., Arntzen, C., Mason, H. A DNA replicon system for rapid high-level production of virus-like particles in plants. Biotechnol. Bioeng. 103, 706-714 (2009).
- Santi, L., et al. An efficient plant viral expression system generating orally immunogenic Norwalk virus-like particles. Vaccine. 26, 1846-1854 (2008).
- He, J., Lai, H., Brock, C., Chen, Q. A Novel System for Rapid and Cost-Effective Production of Detection and Diagnostic Reagents of West Nile Virus in Plants. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 1-10 (2012).
- Huang, Z., et al. High-level rapid production of full-size monoclonal antibodies in plants by a single-vector DNA replicon system. Biotechnol. Bioeng. 106, 9-17 (2010).
- Kuta, D., Tripathi, L. Agrobacterium-induced hypersensitive necrotic reaction in plant cells: a resistance response against Agrobacterium-mediated DNA transfer. African Journal of Biotechnology. 4, 752-757 (2005).
- Phoolcharoen, W., et al. Expression of an immunogenic Ebola immune complex in Nicotiana benthamiana. Plant Biotechnology Journal. 9, 807-816 (2011).
- Phoolcharoen, W., et al. A nonreplicating subunit vaccine protects mice against lethal Ebola virus challenge. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 20695-20700 (2011).
- Herbst-Kralovetz, M., Mason, H. S., Chen, Q. Norwalk virus-like particles as vaccines. Expert Rev. Vaccines. 9, 299-307 (2010).
- Chen, Q., et al. Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins. Adv. Tech. Biol. Med. 1, 103 (2013).
