Syntese, Cellular Levering og Published: September 10, 2013 doi: 10.3791/50545

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Lorenzo Albertazzi¹, Barbara Storti², Marco Brondi², Sebastian Sulis Sato², Gian Michele Ratto³, Giovanni Signore⁴, Fabio Beltram²

¹Institute for Complex Molecular Systems & Laboratory of Macromolecular and Organic Chemistry, Eindhoven University of Technology & NEST, Scuola Normale Superiore and Istituto Nanoscienze-CNR, ²NEST, Scuola Normale Superiore and Istituto Nanoscienze-CNR & IIT@NEST, Center for Nanotechnology Innovation, ³NEST, Scuola Normale Superiore and Istituto Nanoscienze-CNR, ⁴IIT@NEST, Center for Nanotechnology Innovation

Summary

Fluorescens sensorer er kraftige verktøy i life science. Her beskriver vi en metode for å syntetisere og bruke dendrimer-baserte fluorescerende sensorer for å måle pH-verdien i levende celler, og in vivo. Dendrittiske stillas forbedrer egenskapene til konjugerte fluorescerende fargestoffer som fører til bedre føle egenskaper.

Abstract

Utviklingen av fluorescerende indikatorer representerte en revolusjon for biovitenskap. Genetisk kodet og syntetiske fluoroforene med sensing evner tillot visualisering av biologisk relevante arter med høy romlig og tidsmessig oppløsning. Syntetiske fargestoffer er av spesiell interesse takket være deres høye tunability og det brede utvalget av målbare analytter. Men disse molekylene lider flere begrensninger knyttet til lite molekyl atferd (dårlig oppløselighet, vanskeligheter med målretting, ofte ingen ratiometric bildebehandling tillatt). I dette arbeidet har vi introdusere utvikling av dendrimer-baserte sensorer og presentere en fremgangsmåte for pH-måling in vitro, i levende celler, og in vivo. Vi velger dendrimers som ideell plattform for våre sensorer for sine mange ønskelige egenskaper (monodispersity, tunbare egenskaper, multivalency) som har gjort dem en mye brukt stillas for flere biomedisinske enheter. Konjugering av fluorescerende pHindikatorer til dendrimer stillaset førte til en forbedring av deres sensing forestillinger. Spesielt dendrimers utstillings redusert celle lekkasje, økt intracellulær målretting og tillate ratiometric målinger. Disse nye sensorer ble med hell anvendt for å måle pH-verdien i levende HeLa-celler og in vivo i mus i hjernen.

Introduction

Bruken av fluorescerende molekyler å merke spesifikke biologisk relevante molekyler har helt forandret måten vi studerer biologiske systemer. Vidvinkel og konfokalmikroskopi tillatt for en sanntids høy oppløsning visualisering av biologiske prosesser, og i dag er blant de mest populære metoder for å studere biologiske hendelser in vitro i celler og in vivo. ^Ett En relevant forbedring var representert ved utvikling av fluorescens indikatorer , dvs. fargestoffer hvis fluorescens er avhengig av konsentrasjonen av en spesifikk molekylær enhet. pH og kalsium indikatorer i særdeleshet hatt en dramatisk innvirkning på studiet av cellefysiologi på grunn av den enorme relevansen av H ⁺ og Ca ^{2 +-ioner} i biologi. ^2,3

Men de fleste av de følefargestoffer presentere flere iboende begrensninger knyttet til deres lite molekyl atferd som for eksempel: i) vanskeligheter i subcellulære targeting, ii) dårlig løselighet i vann, og følgelig dårlig biokompatibilitet,. iii) cellelekkasje, og dermed manglende lang time-lapse tenkelig evne ^4. Videre er signalet på mange prober kan ikke korrigeres for avhengigheten av fargestoff konsentrasjonen (non- ratiometrisk avbildning), og derfor er det ikke mulig en absolutt måling i celler eller in vivo.

Vi har nylig beskrevet en enkel og effektiv metode for å overvinne disse begrensningene basert på konjugering av følerfargestoffer på en dendrimer stillaset. ^Fem Dendrimers er monodisperse hyperforgrenede polymerer med meget tiltalende egenskaper for biologiske anvendelser. ^6. Spesielt flere dendrittiske arkitekturer er blitt utviklet og brukt for narkotika ⁷ og genet levering. ⁸ Kun svært nylig flere grupper begynte å undersøke mulighetene for disse molekylene som stillas for sensing enheter. ^9,10,11

Vi tidligerebeskrevet en enkel syntetisk vei mot funksjonalisering av forskjellige polyamidoamin (PAMAM) stillas basert på NHS-aktiverte estere. ^12. Konjugater kan oppnås i et enkelt trinn ved hjelp av dialyse som kun rensing. Interessant denne tilnærmingen kan lett anvendes på en rekke dendrittiske eller polymere stillaser. ^13,14

For å oppnå ratiometrisk avbildnings dendrimers ble dobbeltmerket med to sett av fargestoffer: i) en pH-indikator (for eksempel fluorescein), og ii) en pH-uavhengig fluorescerende moiety (dvs. rhodamin). Dette tillater oss å utføre nøyaktige pH avbildning som forholdet mellom fluorescein og rhodamin bare er avhengig av pH og ikke mer av konsentrasjonen av proben. En annen interessant tilnærming til dette problemet er representert ved bruken av levetids-baserte prober. ^15. Som levetiden ikke er avhengig av probe-konsentrasjon disse målingene trenger ikke en ratiometrisk korreksjon. Men LIFetime målinger krever en mer komplisert instrumental oppsett og deres tidsmessig oppløsning er sub-optimalt for raske fysiologiske prosesser, og dermed begrense sine potensielle bruksområder.

For å kunne utføre intracellulær avbildning, må sonden som skal leveres over plasma membran inn i cytosol. Som dendrimers ikke er permeabel membran på grunn av deres størrelse og hydrofilitet, kan intracellulær levering bli oppnådd ved elektroporering. Ved hjelp av denne teknikken, er mye brukt i biologi for transfeksjon, kan merkede makromolekyler være effektivt leveres inn i cellene for å utføre høykvalitetsbilder. Dessuten, med elektroporering komplikasjoner relatert til dendrimer endocytose kan unngås, da de makromolekyler er direkte levert til cytoplasma. Interessant etter electroporation ulike dendrimers viser forskjellige lokaliseringer inne i cellene selv i fravær av noen bestemt målgruppe sekvens. ⁵ Denne passive målretting, bare på grunn av de fysisk-kjemiske egenskapene til dendrimer, kan utnyttes til å oppnå organspesifikke pH avbildning.

Ratiometric bildebehandling kan utføres ved hjelp konfokalmikroskopi. Fluorescein og rhodamin, kovalent konjugert til dendrittiske stillaset, ble separat fotografert og en pixel-for-pixel ratio kartet ble laget. Flere fremgangsmåter for å kontrollere intracellulære pH i levende celler ved hjelp av ionophores ble rapportert. Ionophores er små hydrofobe molekyler i stand til å transportere ioner over plasmamembranen; ionophores for H ⁺ ion, slik som nigericin, er tilgjengelige og kan brukes til å kalibrere dendrimer-baserte sensorer ¹⁶ Disse målingene viste en lineær respons til pH på samme måte som det som observeres. in vitro. På grunnlag av kalibrerings intracellulære pH kan måles nøyaktig. Disse målingene viste at dendrimer-baserte sensor kan være et verdifullt verktøy i å studere H ⁺ homeostAsis i levende celler og patologiske prosesser som involverer pH regulering feil.

Vi har nylig vist at dendrimer-baserte pH-sensorer kan også bli anvendt in vivo, å utføre pH-avbildning i hjernen hos bedøvede mus. ^17. På grunn av det komplekse miljø av levende vev av høy kvalitet in vivo sensing er teknisk utfordrende. Her viser vi en detaljert beskrivelse av den eksperimentelle prosedyren for in vivo pH bildebehandling med vektlegging av de avgjørende spørsmål som må belyses for å utføre en nøyaktig pH bildebehandling i hjernen. To-fotonmikroskopi ble anvendt for to hovedgrunner: i) anvendelse av infrarødt lys gjør det mulig å overvinne mangelen på vev inntrengning av standard konfokal mikroskopi, ii) den brede to-foton absorpsjon av fluorescein og rhodamin tillate deres samtidige magnetisering unngå komplikasjoner knyttet til bruk av to bølgelengder for eksitering. pH-målinger i mus hjernen varmed hell utføres, sensorer lett reagere på hypoksi indusere forandring i pH i hjernen ekstracellulære rom. Disse målinger viser at dendrimer-baserte indikatorer kan med hell brukes til å markere fysiologisk og patologisk endring av pH-verdien in vivo i en dyremodell.

Protocol

En. Syntese av sensorer

1. I det følgende gir vi en prosedyre for bøying av pH-indikatorer til PAMAM dendrimers. Den samme protokollen kan brukes med minimal endring til alternative amin bærende dendrimers. ^5,17,13,14 Kommersielt tilgjengelige dendrimers og fargestoffer kan brukes uten ytterligere renselser.
2. Oppløs dendrimer i vannfri DMSO (50 mikrometer endelig konsentrasjon). Forbered 10 mM stamløsninger av fluorescein-NHS og tetramethyl-rhodamin-NHS (TMR) i vannfritt DMSO.
3. Legg til dendrimer løsning den ønskede mengden av fluorescein og TMR. Det molare forhold i blandingen vil gjenspeile mengden av fargestoffer som er lagt på dendrimer. Vanligvis 1 ml av G4 PAMAM dendrimer-løsning i et mikrosentrifugerør omsettes med 8 ekvivalenter (40 ul) av fluorescein og 8 ekv (40 ul) av TMR. Omrør løsningen ved romtemperatur i 12 timer.
4. Fortynn 1:10 med avionisert vann og legg i reaksjonenblandingen i en dialysepose (MWCO = 10 kDa). Dialyser i 24 timer mot deionisert vann for å erstatte vanlige vannet i reservoaret.
5. Overfør løsningen til en ampulle og frysetørket i 24 timer. En lilla pulver bør innhentes. Vekt det oppnådde faststoff og oppløse den i MilliQ vann ved en sluttkonsentrasjon på 10 uM. Aliquot løsningen og oppbevar ved -20 ° C.

2. In Vitro pH-målinger

1. For in vitro kalibrerings forberede en løsning 500nM av dendrimer i PBS (2 mM fosfat) i en kvarts kuvette. Bruken av en meget fortynnet PBS-buffer (2 mM) for å unngå plutselige forandringer i pH-verdien i løpet av titreringen er anbefalt.
2. Mål emisjonsspektrene til fluorescein (Eks 488 nm) og TMR (Eks 550 nm) og optimalisere de optiske innstillinger av fluorimeter for å oppnå et godt signal-til-støy-forhold.
3. Utfør en pH titrering ved å legge små mengder NaOH 0,1 N og HCl 0,1 N. Etter hvert tillegg riste kyvettenfor blanding, vent i 1 min for ekvilibrering, og måling av pH ved hjelp av et pH-mikroelektroden. Utslipps spektra av fluorescein og TMR bør registreres for hvert steg, uten noen endring i de optiske innstillinger.
4. Plott fluorescensintensiteten vs pH for titreringen. Den rodamin signalet skal være upåvirket av pH (<10%). Det fluorescein-signalet skal være en sigmoidal kurve, og bør være utstyrt med en enkelt-binding modellen med pK = 6,4.

Tre. Cell Culture and Electroporation

1. Dyrk HeLa-celler in Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) supplert med 10% føtalt bovint serum og 100 U / ml penicillin og 100 mg / ml streptomycin (Invitrogen). Hold cellekultur ved 37 ° C i en fuktig 5% _CO2 atmosfære.
2. For dendrimer elektroporering, når cellene er sammenflytende fjerne media og vaske cellene ved hjelp DPBS (Dulbeccos Phosphate-Buffered Saline). Fjern DPBS og legge trypsin-EDTA. Nøytralisere Trypsynde ved å legge medium som inneholder serum, men ikke antibiotika. Sentrifuger på 900-1200 rpm i 2 min ved romtemperatur. Ta ut papiret og skyll pellets ved hjelp DPBS.
3. Telle celler og ta 4 * 10 ⁶ celler. Sentrifuger på 1,200-1,500 rpm i 2 min ved romtemperatur.
4. Resuspender cellepelleten i 200 ul microporation buffer (levert av produsenten microporator) og overføre cellene til et 1,5 ml mikrosentrifugerør.
5. Legg dendrimer vandig oppløsning inn resuspenderte celler. Den mengde dendrimer som kreves per prøve er avhengig av PAMAM type (vanligvis 250 nM for kationiske og 2 mM for nøytrale dendrimers).
6. Legg electroporation buffer (levert av microporator produsent) i en microporation tube. Pipetter cellene og dendrimers blandinger med elektroporering spissen av 100 mL volum-sized. Sett microporator pipetten inn i pipetten stasjonen. Sett pulsen betingelse for microporation: puls spenning = 1005 V; puls widT = 35 msek, puls nummer = 2.
7. Etter at pulsoverførings celler til et 1,5 ml mikrosentrifugerør og sentrifuger cellene i 5 min ved 1200 rpm for å fjerne overskudd av dendrimer i mediet. Plate 10 mL av electroporated celler bort på 35 mm med glassbunn retter (Willco-fatet GWSt-3522) med frisk medium w / o antibiotika.

4. pH Sensing i Living HeLa celler

1. Bilde celler med en konfokalmikroskop 12 timer etter elektroporering.
2. Standard filtersett for fluorescein og rhodamin kan brukes. Hvis avstembare filtre er tilgjengelige sett en grønn kanal 500-550 nm og en rød kanal fra 580 nm til 650 nm. Eksitasjon ved 488nm er optimal for fluorescein mens rhodamin kan bli fotografert enten ved 543nm eller 561 laserlinjen.
3. Fokus på prøven og justere lasere kraft og detektorer får å maksimalisere signal-til-støy-forhold. Hvis electroporation var vellykkede cellene skal være lyst fluorescerende i begge kanaler. Denlokalisering er avhengig av størrelsen og er ansvarlig for dendrimer benyttes. Ofte noen lysosomal lokalisering (små oppklaring rundt kjernen vesikler) er til stede på grunn av endocytose eller compartmentalization. Ved det lysosomale lokalisering er overveiende, det vil si de fleste av fluorescensen er lokalisert inne i vesiklene, og dårlig signal er observert i cytosol, betyr dette toksisitet og målingen må kasseres. Tilegne seg sekvensielt de to kanalene, om nødvendig skaffe flere bilder og gjennomsnittlig bildene for å forbedre bildekvaliteten.
4. For kalibrering klemme celle pH ved hjelp av buffere med ionophores ved forskjellig pH og skaffe minst 20 celler pr pH som beskrevet ovenfor. For en detaljert beskrivelse av framgangsmåten og sammensetningen av buffere henvises til Bizzarri og kollegaer. ¹⁶ Vi foreslår å måle minst fem poeng fra pH = 5,5 til pH = 7,5. pH under 6 er giftig for cellene, men tolerert for kort tid, anbefaler vi å kjøpe bildene så fort som mulig. Hvis cellenedemonstrere tegn til apoptose, forkaste cellene og starte på nytt.
5. Bruk ImageJ eller analogt programvare for dataanalyse. Importere bildene av den grønne og røde kanalen, subtrahere bakgrunn og skape en piksel for piksel ratio bildebehandling med verktøyet "Image kalkulator".
6. Tegn en region av interesse (ROI) å velge den ønskede celle og måle intracellulær grønn-til-rød-forhold. Analysere alle bilder ervervet og deretter plotte forholdet versus pH. I området 5,5 til 7,5 trenden bør være lineær. Den lineære form av punktene som oppnås vil gi kalibreringskurve som vil bli brukt til å konvertere grønn-til-rød-forhold til pH.
7. Som ytterligere kontroll skaffe flere ubehandlede celler (ingen ionophores) og prøver å beregne pH med innhentet kalibreringskurve. En verdi på mellom 7.2 og 7.4 skal innhentes.

5. In Vivo Prøvepreparering

1. Forsøkene ble utført på C57BL/6J (menn og kvinner) mellom postnatal day 28 og 70 år. Bedøvet mus med en intraperitoneal injeksjon av uretan (dvs. etyl-karbamat) (20% v / v i fysiologisk saltvann, 20 mg / kg uretan). Dyrene ble avlivet etter eksperimentet med en overdose uretan, etterfulgt av en intrakardial injeksjon av den samme bedøvelse.
2. Utfør en intramuskulær injeksjon av deksametason natriumfosfat (2 mg / kg kroppsvekt) for å redusere det kortikale stressrespons og cerebralt ødem under operasjonen.
3. Barbere dyrets hode og bruke 2,5% lidokain gel til hodebunnen.
4. Bruk saks til å klippe klaffen av huden som dekker skallen av begge halvkuler
5. Vask eksponerte benet med saltvann og fjern forsiktig periosteum med tang. Dette vil gi et bedre grunnlag for lim og dental sement til å følge med.
6. Påfør en skreddersydd stål hode stolpe med et sentralt bildebehandling kammer og lim den med cyanoakrylat i et fly omtrent parallelt med skallen over kortikale regionen interest og fikse det på plass med hvit dental sement (Paladur).
7. Fest hodet av musen for å utføre en kraniotomi på 2-3 mm i diameter boret over regionen av interesse.
8. Prøv å redusere oppvarming av hjernebarken under operasjonen, durale tårer, eller blødning.
9. Hold cortex superfuseres med steril ACSF (126 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,2 mM KH ₂ PO _4, 1,3 mM _MgSo4, 26 mM NaHCO _3, 2,4 mM CaCl _2, 15 mM glukose, 1,2 mMHEPES i destillert H ₂ O , pH = 7,4).

6. pH bildebehandling i Mouse Brain

1. Under eksperimentet middel dyr respirasjon gi O _to anriket luft. Oksygen er beriket på opptil 80%. O ₂ partialtrykket og strømnings er ofte justeres for å oppnå en skikkelig respirasjon hjelpemiddel. Holde kroppstemperatur konstant ved 37 ° C med et tilbakekoblingsstyrt varme-teppe.
2. Fix dyret gjennom stål innlegg under målet om en to-foton bildeoppsett.
3. For å kunne injisere sensoren i hjernebarken laste et glass som inneholder en pipette AgCl elektrode (tip diameter 4 mm) med dendrimer-løsning (1 uM). Elektroden vil tillate å ta opp ekstracellulære feltpotensialer.
4. Med en mikroinjeksjon setup setter pipetten i hjernebarken på ca 150 mikrometer dybde. Injiseres i 1-2 min ved et trykk på 0,5 kPa.
5. Optimalisere den optiske oppsettet for bildebehandling. Laser makt bør justeres for å minimere fotobleking og photodamage. Vanligvis lasereffekten som benyttes er rundt 20 mW og PMT gevinst ble holdt konstant på 667 V, siden tidligere kalibreringer viste at denne spenning som gir den beste S / N-forhold.
6. For bildebehandling opphisse sensoren ved 820 nm og oppdage samtidig fluorescein og rodamin fluorescens gjennom standard FITC og TRITC filtre.
7. For tiden løst målinger skaffe time lapse serie på 2 Hz.
8. For bakgrunnskorreksjon skaffe en mørk ramme med laser spjeldet er lukket for å måle den midlere termisk støy som oppstår i de PMTs og pidestallen som regel er lagt til av elektronikken.
9. For dataanalyse følge samme prosedyre rapportert i kapittel 4.

Representative Results

Figur 1 viser en skjematisk fremstilling av konjugering av avføling av fargestoffer til forskjellige dendrittiske stillaser. De resulterende indikatorer kan oppnås på en enkel syntetisk trinn fra kommersielt tilgjengelige produkter. Amin-bærende dendrimers omsettes med NHS-aktiverte fargestoffer i DMSO og renset ved dialyse. Denne generelle prosedyren har allerede blitt brukt for merking av flere dendrimers: i) PAMAM dendrimer generasjon 2, 4 og 6, ¹² pegylerte PAMAM dendrimers ¹⁷ og PEG-dendrittiske hybrider ^18. Som distinkte dendrimers viser forskjellige interaksjoner med celler og vev (lokalisering, toksisitet, permeabilitet, diffusjon) til valg av den dendrittiske struktur er sterkt relatert til den ønskede anvendelse, og til prøven av interesse.

Følerne omfatter to sett med fluorescerende fargestoffer: i) pH-indikatorer og ii) pH-ufølsomt molekyldeler som virker som interne referanser. Although et stort utvalg av indikatorer og referanser er tilgjengelige, de beste resultatene er oppnådd med fluorescein og tetramethylrhodamine. Forholdet mellom de to fargestoffer som kan være innstilt ganske enkelt å bruke forskjellige molare ekvivalenter i reaksjonen. Figur 2 viser et typisk in vitro-titrering av en pH-sensor. Fluorescein og rhodamin kan separat spent på 488nm og 550nm, henholdsvis, slik at minst krysstale mellom de to kanalene. Som det klart kan sees, fluorescein (figur 2A) viser en pH-avhengig, mens virkemåten rhodamin (figur 2 A)-signal ikke endrer seg vesentlig i det fysiologiske pH-område. Derfor er forholdet mellom disse to signalene er ikke avhengig av sensor-konsentrasjon, men bare på pH. Denne konsentrasjon uavhengighet vil være av stor betydning for de biologiske målinger som intracellulær probe-konsentrasjon ikke kan kontrolleres.

For levende celler målinger intracellular levering av de dendrittiske sensorer oppnås via elektroporering. Denne teknikken er mye brukt i biologien for DNA-transfeksjon, og kan anvendes med minimale variasjoner på produsentens protokoll. Gjennom elektroporering, kan makromolekylene bli levert direkte til cytoplasma, unngår enhver komplikasjon i forbindelse med vesikulær system for endocytose. Figur 3a viser confocal bilder av HeLa-celler electroporated med dendrimer sensorer. Et sterkt signal i både fluorescein (grønn, til venstre) og rhodamin (rød, midten) er observert. De to signalene perfekt colocalize demonstrere integriteten av sensorstrukturen. En ratiometric kartet er rekonstruert ved å dele de to bildene piksel-for-piksel og representert med et Pseudo skala (figur 3a, høyre). pH-fastspenning med ionophores ble utført, for å kalibrere sensoren reaksjon inne i cellene. Kalibrering med ionophores er en godt etablert protokoll, Several protokoller er blitt omfattende beskrevet og kan anvendes uten modifikasjoner. Indikatorer ¹⁹ lett å svare til pH med en endring av det grønne-til-rød-forhold som vist i figur 3b. Dette tillot oss å få en kalibreringskurve (Figur 3c) for nøyaktige pH-målinger. Den lineære trend i kalibrerings demonstrerer evnen av sensoren til å reagere på pH uten noen forstyrrelse fra det cellulære miljø. Den kalibreringskurve er blitt brukt til å bestemme pH-verdien av levende HeLa-celler til å være 7,4 og 4,8 for cytoplasma og lysosomer, respektivt. Disse resultatene er i god overensstemmelse med litteraturen.

Endelig viste vi hvordan dendrimer-baserte sensorer kan benyttes for in vivo avbildning. Dendrimers kan injiseres lett gjennom vevet med en prosedyre som ligner på de mest brukte kalsium indikatorer. ^20. Når i vevet, indikatorene diffundere meget langsomt, allowing langsiktig bildebehandling før komplett vev drenering. Typiske resultater er vist i figur 4.. Fluorescein (grønn) og rhodamin (røde) signaler har vært samtidig oppnådd med 820 nm eksitasjon og kart forholdet ble bygget på en pixel-for-pixel basis, i likhet med levende celler målinger. Spesielt, indikatorene lokalisere i den ekstracellulære rom, de ikke-fluorescerende områder i bildet identifisere cellulære organer eller små blodårer. For å verifisere sensor respons til pH, vi foreslo bruken av hyperkapni. Faktisk er karbondioksyd kjent for å endre likevekter av karbonat-buffere i blod og vev, noe som resulterer i en surgjøring av vev. ^21. Som vist på figur 4b, er den inhalasjon av 30% CO ₂ tilstrekkelig til å indusere en sterk respons av sensor som er fullstendig reversibel ved re-ventilasjon av musen. Disse resultatene viser at potensialet for dendrimer-baserte sensorer for å fremheve fysiologiske og pathological forandringer av pH-verdien i levende celler, og in vivo.

Figur 1. Syntese av dendrimer-baserte sensorer skjematisk fremstilling av dendrimer-baserte pH-sensor. Samme prosedyre kan anvendes på praktisk talt alle aminbærende dendrimer (til venstre). Produktet ble oppnådd gjennom en enkelt konjugering reaksjon etterfulgt av dialyse. Klikk her for å se større figur .

Figur 2. In vitro pH-titrering for en dendrimer-baserte sensor. a) Reaksjon av pH-indikatoren fluorescein og b) på i-nternal referanse, rhodamin, og viser ingen endring over den fysiologiske pH-området.

Figur 3. Representative resultatene av pH bildebehandling i levende HeLa celler. a) Confocal avbildning av fluorescein kanal (til venstre), rodamin kanal (i midten) og pH ratiometric kartet (til høyre). b) pH kalibrering med ionophores. c) representative ratiometric kart av celler klemmes på ulike pH. . Gjengitt fra Albertazzi L, Brondi M, Pavan GM, Sato SS, et al (2011) Dendrimer-baserte Fluorescent Indikatorer:.. In vitro og in vivo Applications PLoS ONE 6 (12), e28450. doi: 10.1371/journal.pone.0028450

Figur 4. pH bildebehandling iHjernen til bedøvet mus. a) grønn og rød kanal (samtidig spent på 820 nm) og pH ratiometric kartet. b) typisk respons på sensoren til hyperkapni (30% CO _2). Tilpasset fra:. Gjengitt fra Albertazzi L, Brondi M, Pavan GM, Sato SS, et al (2011) Dendrimer-baserte Fluorescent Indikatorer:.. In vitro og in vivo Applications PLoS ONE 6 (12), e28450. doi:. 10.1371/journal.pone.0028450 Klikk her for å se større figur .

Discussion

De kritiske trinn for vellykket pH avbildning med dendrimer-baserte sensorer er: i) valg av den riktige dendrittiske stillaset og antall indikatorer konjugert til den, og ii) optimalisering av sensoren leveringsprotokoll i celler eller in vivo.

Den syntetiske fremgangsmåten er forholdsvis enkel, og kan anvendes praktisk talt i alle amin-bærende hyperforgrenede polymeren. Sensorene kan fås fra kommersielt tilgjengelige dendrimers og NHS-aktivert fargestoffer i ett enkelt trinn. Vi tror at denne modul og grei fremgangsmåte vil være fordelaktig for den videre bruk av slike sensorer i en rekke biologiske spørsmål. Rensing kan effektivt oppnås ved dialyse for å fjerne de ikke-konjugerte fargestoffer. Utvelgelsen av den dendrittiske stillaset er avgjørende og avhenger av den spesifikke anvendelse ønsket. Ulike dendrimers har vist seg å ha særegne lokaliseringer inne i cellene på grunn av spesifikke interaksjoner med subcellular strukturer. Nøytrale dendrimers (for eksempel acetylert PAMAM G4) ikke viser noen interaksjon inni cellene og viser en diffus lokalisering. Dermed representerer de et godt valg for en hel-celle bildebehandling. Tvert imot positivt ladet dendrimers av ulike generasjoner (fra G2 til G6) skjerm elektrostatiske interaksjoner med negativt ladet biomolekyler (dvs. RNA) som resulterer i bestemt cellulær lokalisering. Kationiske dendrimers er dermed ideell for organspesifikke bildebehandling.

Valget av sensestoffer er kritisk. Flere pH indikatorer og pH-insensitive fargestoffer med annen farge utslipp og H ⁺ affinitet (PK) er tilgjengelig. Vi prøvde mange forskjellige fargestoff kombinasjoner og de beste resultatene ble oppnådd med fluorescein og tetramethylrhodamine. Dette paret gi en god respons på pH i det fysiologiske området (pK = 6,4) og som er kompatibel med vanlig brukte mikrosfilter oppsett. For ulike krav, som målings i ulike pH-område, kan noen optimalisering være nødvendig. Spesielt, ikke alle indikatorene beholde sine egenskaper (lysstyrke, PK) ved dendrimer konjugering ⁵ Denne oppførselen avhenger både av fargestoff og dendrimer strukturer;. Men vi var i stand til å rapportere flere indikatorer der photophysical egenskaper indikatorene ikke er vesentlig berørt. ¹⁷ Dersom dette er tilfelle vi foreslår å konjugere de fargestoffer gjennom en linker for å minimalisere dendrimer-fargestoff interaksjoner. Flere av reaktive fargestoffer er kommersielt tilgjengelige med alkyl-avstandsstykker ^22, eller i alternative PEG linkere kan brukes. Også antall indikatorer og forholdet indikatorer-til-referansefargestoffer på stillaset er viktig. Den ideelle forholdet er avhengig av den spektrale følsomhet av mikros oppsettet som brukes, og av de biologiske prøven av interesse ^5,17. Selv om noen feilsøking kan være nødvendig, vil den svært enkel og rask syntetisk prosedyre i stor grad forenkle prosessen. Endeliggraden av funksjonalisering av dendrimer, det vil si prosentandelen av endegruppene til dendrimer som er konjugert til fargestoffer, som vil kunne påvirke de forestillinger av indikatorene. For å unngå eventuelle løselighet problem vi foreslå funksjon ca 10% -20% av dendrimer endegrupper. I tilfellet med pegylerte dendrimers Men på grunn av PEG bidrag til oppløselighet, kan en fullstendig funksjonalisering kan oppnås. Dette kan også begrense uønsket tilstedeværelse av FRET og andre slukke fenomener mellom de konjugerte fargestoffer.

Dendrimers er ikke celle-gjennomtrengelig, men intracellulær levering kan oppnås ved elektroporering. Vi har anvendt DNA-transfeksjon produsenten protokoll for cellelinje av interesse, uten ytterligere modifikasjoner. En viktig parameter er konsentrasjonen av dendrimer i electroporation buffer, særlig i tilfellet med indikatorene med dårlig lysstyrke eller dendrimers at ved høye konsentrasjoner kan være toksisk for cellene. Lav concentrations av dendrimer vil resultere i dårlig signal inne i cellene, mens høye konsentrasjoner vil føre til toksisitet og indusere celledød. Den ideelle konsentrasjon avhenger dendrimer / indikator par så vel som på bildeoppsett tilgjengelig og kan trenge litt optimalisering. Hvis en electroporator er ikke tilgjengelig i laboratoriet, kan mikroinjeksjon representere et gyldig alternativ. Men dette er en enkelt-celle-teknikk og vil gjøre anskaffelsen av et betydelig antall avbildes celler mer arbeidskrevende.

Den sensorer bildebehandling Prosedyren er svært fleksibel og kan enkelt tilpasses til flere mikros oppsett. Vi har tidligere rapportert ved bruk av sensorer i henhold til en konfokal system med avstembare akustooptikk optiske filtre ^5,17 men standard FITC / TRITC filtersett kan også brukes. Når optimal intracellulær konsentrasjon er oppnådd, er pH avbildning ukomplisert. Vi foreslår å optimalisere laser intensitet, pinhole og detektorer få over et stort spekter av sensor intracellulærkonsentrasjoner før du kjører pH kalibrering med ionophores. Hvis den samme mikros oppsett brukes under de samme betingelser kalibreringen kan brukes for alle eksperimenter. Her foreslår vi ratiometric bildebehandling for å unngå sensor konsentrasjon avhengighet og gjenstander. En annen interessant metode for å oppnå dette er representert ved levetidsbaserte prober som elegant viste ved Vinogradov og kolleger ¹⁵ og begge alternativene vise fordeler og ulemper. Lifetime målinger krever ikke noen korreksjon som de er egenkonsentrasjonsuavhengig og kalibreringsprosedyrer er ofte lettere og mer stabil. Videre er en enkelt farge som brukes unngå komplikasjoner og mulige avvik indusert av grønn-til-rød ratiometrisk avbildning. Men bare få effektive levetid sonder er tilgjengelige mens en stort utvalg av intensitet-baserte prober er kommersielt tilgjengelig. Utstyret som kreves for ratiometric bildebehandling er enklere og mer sannsynlig tilgjengelig i såtandard mikros anlegget. Videre levetid målinger er egentlig treg og kan ikke brukes til å følge raske biologiske prosesser. Derfor er valget mellom disse to teknikker avhenger sterkt av instrumentering tilgjengelige og av den spesifikke biologiske prosessen av interesse.

Selv om prinsippet ligner, er in vivo avbildning mer utfordrende enn i cellekultur. Signal-til-støy-forholdet er redusert ved spredning og interaksjoner med vevene kan påvirke responsen til sensoren. Videre diffusjon gjennom vevet og derved lekkasje av indikatoren fra regionen av interesse representerer et ekstra problem ikke til stede for intracellulære mål i kultur. Av disse grunner, er valget av indikatoren avgjørende. Mens for intracellulære målinger fleste dendrimers fungerer utmerket (G4, G4-AC, G6, PAMAM-PEG hybrider), for in vivo sensing vi anbefaler bruk av pegylerte dendrimers. ¹⁷ Indeed denne arkitekturen er særlig effektiv for dette formål av flere grunner: i) PEG øke størrelsen av dendrimer og reduserer dens lekker fra vevet, ii) PEG linkeren minimerer slukke som følge av fargestoff-fargestoff og fargestoff-dendrimer interaksjoner og iii) PEG beskytter de fargestoffer fra vevet unngå tap av funksjonen ofte observeres etter injeksjon av tissue følere. Kvaliteten av pH-føler avhenger sterkt av den vellykkede injeksjon av en tilstrekkelig mengde av dendrimer i vevet. Når dette er oppnådd avbildningsprosedyren, og analyse av data er tilsvarende det som allerede var rapportert for cellekultur. Dette er en klar demonstrasjon av sensor effektivitet in vivo og kan anvendes som en intern kontroll for indikatoraktivitet før noen måling.

Vi mener at disse resultatene sammen med de detaljerte prosedyrer rapportert i dette arbeidet vil tillate bruk av dendrimer-baserte sensorer for å markere physiological og patologiske forandringer i pH i levende celler, og in vivo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PAMAM G4	Sigma-Aldrich	412449
Carboxyfluorescein NHS ester	Life technologies	C-1311
TMR NHS ester	Life technologies	C-1171
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Dyalsis bags	Spectrum Labs	132117
WillCo Dishes	WillCo Wells	GWSt-3512
Urethane	Sigma-Aldrich	U2500