Sintesi, Consegna Cellulare e In vivo Applicazione di sensori di pH basati Dendrimero

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di sviluppare nuovi sensori fluorescenti basati su tamburini Dun con proprietà migliorate per l'imaging del pH in vitro in cellule viventi e in vivo. Ciò si ottiene coniugando prima i coloranti sensibili al pH in un'impalcatura dendritica insieme ad altre frazioni, come i gruppi bersaglio o il pH nei coloranti sensibili. E le misurazioni in vitro vengono effettuate per generare una curva di calibrazione del pH accanto all'immagine del pH nelle cellule viventi.

Il sensore viene erogato mediante elettroporazione e le mappe di pH vengono generate utilizzando la microscopia confocale per visualizzare il pH nello spazio extracellulare del cervello. Durante l'attività neurale fisiologica e patologica, il sensore viene microiniettato nel cervello di topi anestetizzati. I dati di fluorescenza vengono quindi acquisiti utilizzando la microscopia a due fotoni.

I risultati ottenuti mostrano che i sensori basati su drimmer riescono a misurare le variazioni di pH con un'elevata risoluzione spaziale e temporale, sia nelle cellule viventi che in vivo. Sebbene siano già stati impiegati diversi coloranti per canne fumarie con comportamento sensibile al pH, soffrono di diversi inconvenienti, come scarsa mobilità e perdite cellulari. Inoltre, non consentono la misurazione assoluta metrica avventata.

Qui abbiamo dimostrato la conazione di coloranti sensibili al pH allo scaffold genetico D, e poiché le prestazioni consentono una misurazione accurata con la risoluzione speciale e temporale, questo metodo potrebbe essere uno strumento utile per studiare i processi fisiologici e patologici regolati dal pH nelle cellule viventi. L'interruzione della regolazione del pH nel sistema neuronale è associata a diverse condizioni come l'ictus e l'epilessia, e il sensore di pH disponibile si è dimostrato scarsamente efficace portando alla progettazione del sensore presentato. Sebbene questo sia stato applicato qui all'imaging del pH h, si tratta di un approccio generale e può essere applicato ad altre specie biologicamente rilevanti.

Scegliendo il colorante sensibile al profitto, l'approccio sintetico facile e versatile rende queste procedure semplici. A illustrare la procedura oggi saranno Giovanni Re, Barbara Ti, Marco Brody e Sebastian Suli a coniugare gli indicatori di pH a Piam Demers. Iniziare sciogliendo il rimer in DMSO anidro a una concentrazione finale di 50 micromolari.

Preparare 10 soluzioni madre micromolari di fluoresceina NHS e tetraetilrumina NHS, nota anche come TMR in anidra, DMSO in una provetta da microcentrifuga combinata, un millilitro di G quattro peram dederer soluzione con otto equivalenti, o 40 microlitri di fluoresceina e otto equivalenti, o 40 microlitri di TMR. Il rapporto molare nella miscela rifletterà la quantità di coloranti caricati sul demer. Mescolare la soluzione a temperatura ambiente per 12 ore.

Successivamente, diluire la miscela da uno a 10 con acqua deionizzata e caricare la miscela di reazione in una sacca per dialisi con un limite di peso molecolare di 10 kilodaltoni, dializzare contro l'acqua deionizzata e sostituire l'acqua nel serbatoio tre volte nell'arco di 24 ore. Il giorno successivo, trasferire la soluzione in una fiala di vetro e congelarla a meno 80 per alcune ore. Quando la soluzione è completamente congelata, trasferire la fiala in un liofilizzatore e liofilizzare per 24 ore.

Va ottenuta una polvere viola, ondulata ottenuta solida, e scioglierla in mqe acqua. Alla concentrazione finale di 10 micromolari. Erogare la soluzione in aliquote da 50 microlitri in provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri e conservarle a meno 20 gradi Celsius.

Per la calibrazione in vitro, preparare una soluzione da 500 nanomolari di D drummer in due PBS millimolari in un veterinario Q al quarzo. Viene utilizzato un tampone PBS molto diluito per evitare bruschi cambiamenti di pH durante la titolazione. Misura gli spettri di emissione della fluoresceina e del TMR e ottimizza le impostazioni ottiche del fluorimetro per ottenere un buon rapporto segnale/rumore.

Successivamente, eseguire una titolazione del pH aggiungendo piccoli volumi di idrossido di sodio normale 0,1 e acido cloridrico normale 0,1. Dopo ogni aggiunta, agitare il Q vet per mescolare. Attendere un minuto per l'equilibratura e poi misurare il pH per mezzo di un pH.

Gli spettri di emissione dei microelettrodi di fluoresceina e TMR devono essere registrati per ogni passaggio senza alcuna modifica. Nelle impostazioni ottiche, tracciare l'intensità della fluorescenza rispetto al pH. Per la titolazione, il segnale del domine a bastoncello non deve essere influenzato dal pH.

Il segnale della fluoresceina dovrebbe essere una curva sigmoidale e dovrebbe essere dotato di un modello di legame singolo con una PK di 6,4 per l'elettroporazione. Trasferire sei volte 10 alla quinta cella hela in 72 microlitri in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri alle cellule risospese. Aggiungere dendri o soluzione acquosa a una concentrazione di due micromolari, aggiungere tre millilitri, tampone di elettroporazione a un tubo di micropurificazione.

Quindi, utilizzando una punta di elettroporazione da 10 microlitri, aspirare le miscele di celle e rimeri. Quindi, inserire la micropipetta nella stazione di pipettaggio e impostare qui le condizioni dell'impulso di micropurazione. La tensione dell'impulso è impostata su 1005 volt.

L'ampiezza dell'impulso è impostata su 35 millisecondi e il numero di impulsi è impostato su due dopo la piastra dell'impulso. 20 microlitri di cellule elettroporate su piastre con fondo di vetro con terreno fresco senza antibiotici. 12 ore dopo l'elettroporazione imaging delle cellule con un microscopio confocale utilizzando un set di filtri standard per fluoresceina e r domina.

Concentrati sul campione e regola la potenza del laser e il guadagno del rivelatore per massimizzare il rapporto segnale/rumore. Se l'elettroporazione ha avuto successo, le cellule dovrebbero essere fluorescenti in entrambi i canali. La localizzazione dipende dalle dimensioni e dalla carica dei D utilizzati. Spesso.

La localizzazione lisosomiale del sole, che si vede come piccole vescicole perinucleari, è presente a causa dell'endocitosi o della compartimentalizzazione. Se la localizzazione lisosomiale è predominante, in cui la maggior parte della fluorescenza è localizzata all'interno delle vescicole e si osserva un segnale dei pori nel citosol. Ciò significa tossicità e le misurazioni devono essere scartate.

Acquisisci i due canali in sequenza, acquisisci diverse immagini e calcola la media delle immagini per migliorare la qualità dell'immagine. Per generare una curva di calibrazione del pH, utilizzare tamponi con opfor a ph diversi per raggruppare il pH intracellulare ed extracellulare allo stesso valore. Acquisire almeno 20 immagini cellulari per pH e misurare almeno cinque punti da pH 5,5 a pH 7,5.

Ricorda che il pH B sei è tossico per le cellule ma può essere tollerato per un breve periodo di tempo, quindi acquisisci immagini il più brevi possibile. Se vedi segni di apoptosi, scarta le cellule e riavvia. A seguito dell'acquisizione.

Utilizzare l'immagine J o un software analogo per l'analisi dei dati. Innanzitutto, determina il rapporto verde/rosso. Quindi traccia il rapporto rispetto al pH per produrre una tendenza lineare che fornirà una curva di calibrazione che può essere utilizzata per convertire il rapporto in pH in esperimenti futuri.

Per la preparazione del campione in vivo, iniziare con C 57 neri sei J e topi femmina tra il 28° e il 70° giorno postnatale. Dopo aver anestetizzato i topi con uretano, eseguire un pizzicamento delle dita dei piedi per assicurarsi che l'animale sia completamente anestetizzato e applicare un unguento per gli occhi per ridurre la risposta allo stress corticale e l'edema cerebrale. Durante l'intervento chirurgico, iniettare due milligrammi per chilogrammo di peso corporeo di desametasone, fosfato di sodio per via intramuscolare.

Successivamente, utilizzando le cesoie chirurgiche, radere la testa dell'animale, quindi posizionare un telo chirurgico e applicare il gel di lidocaina al 2,5% sul cuoio capelluto. Usa le forbici per tagliare il lembo di pelle che copre il cranio di entrambi gli emisferi. Lavare l'osso esposto con soluzione fisiologica e con una pinza, rimuovere delicatamente il periostio.

Ciò fornirà una migliore superficie di adesione. Per la colla e il cemento dentale, applicare un perno di testa in acciaio su misura con una camera di imaging centrale e, utilizzando cianoacrilato, incollarlo in posizione in un piano approssimativamente parallelo al cranio sopra la regione corticale di interesse. Fissare il perno in posizione con cemento dentale bianco.

Fissa la testa del topo ed esegui una craniotomia di due o tre millimetri di diametro perforando la regione di interesse. Frequentemente durante la procedura di perforazione utilizza una siringa per applicare un liquido cerebrospinale sterile fresco al cranio per ridurre al minimo il riscaldamento della corteccia durante l'intervento chirurgico. Dopo la craniotomia, trasferire l'animale allo stadio di imaging per mantenere la testa ferma sotto l'obiettivo.

Avvitare la camera di imaging al perno regolabile. Applicare una testata di plastica su misura collegata all'ossigeno. Questo fornirà aria arricchita di ossigeno durante l'esperimento per aiutare la respirazione degli animali.

Per iniettare il sensore nella corteccia cerebrale, caricare una pipetta di vetro con un diametro della punta di quattro millimetri e un elettrodo di cloruro d'argento. Con la soluzione ER con un drimmer micromolare, l'elettrodo faciliterà la registrazione dei potenziali di campo extracellulare con una configurazione di microiniezione. Inserire la pipetta nella corteccia a una profondità di circa 150 micron.

Iniettare per uno o due minuti a una pressione di 0,5 libbre per pollice quadrato per ottimizzare la configurazione ottica per l'imaging. Regola la potenza del laser per ridurre al minimo lo sbiancamento e i danni alle foto. In genere, la potenza del laser impiegata è di circa 20 milliwatt e il guadagno PMT viene mantenuto costante a 667 volt.

Imposta la lunghezza d'onda del laser per eccitare il sensore a 820 nanometri e dirigi il software per rilevare simultaneamente la fluoresceina e la fluorescenza del domine a bastoncello attraverso filtri FTSE e trit standard. Impostare anche la frequenza di acquisizione su un frame rate di due hertz per la correzione dello sfondo. Acquisisci una cornice scura con l'otturatore laser chiuso per misurare il rumore termico medio che si verifica nei PMT e nel piedistallo.

Infine, acquisire immagini di fluorescenza dipendenti dal pH e conservarle per le analisi successive. Analizzare i dati come prima per valutare il comportamento in vitro della fluoresceina e della rumina. Caricato sul riproduttore, è stata eseguita una titolazione del pH utilizzando un fluorimetro.

Questa figura mostra una titolazione tipica di un sensore di pH. La fluoresceina e la rumina possono essere eccitate separatamente rispettivamente a 488 nanometri e 550 nanometri, consentendo una diafonia minima tra i due canali, come si può vedere chiaramente. La fluoresceina mostra un comportamento dipendente dal pH mentre il segnale R domino non cambia significativamente nell'intervallo fisiologico del pH.

Pertanto, il rapporto di questi due segnali non dipende dalla concentrazione del sensore, ma solo dal pH. Successivamente, per fornire l'indicatore, le cellule hela intracellulari sono state elettroporate con i sensori dederer ed è stato eseguito l'imaging confocale come descritto in questo video. Queste immagini confocali mostrano le cellule nel canale della fluoresceina a sinistra, il canale R domine al centro e visualizzate come una mappa metrica del rapporto pH a destra.

Si osservano forti segnali di fluoresceina e r domine, che colocalizzano dimostrando l'integrità della struttura del sensore. Una mappa metrica di rapporto viene ricostruita dividendo le due immagini pixel per pixel ed è rappresentata con una pseudo scala di colori. Per calibrare la risposta del sensore all'interno delle celle, è stato eseguito il clampaggio del pH con ionofori come mostrato qui.

Gli indicatori rispondono prontamente al pH con una variazione del rapporto verde-rosso. I dati risultanti sono stati utilizzati per generare una curva di calibrazione per misure accurate del pH. L'andamento lineare nella calibrazione dimostra la capacità del sensore di rispondere al pH senza alcuna perturbazione dall'ambiente cellulare.

Per dimostrare come i sensori basati su dendri possano essere impiegati per l'imaging in vivo, l'imaging del pH è stato eseguito nel cervello di un dendri o di un topo anestetizzato iniettato. I segnali di fluoresceina e r domino sono stati ottenuti simultaneamente con un'eccitazione di 820 nanometri e la mappa del rapporto è stata costruita su una base pixel per pixel simile alle misurazioni delle cellule vive. In particolare, gli indicatori si localizzano nello spazio extracellulare, le aree non fluorescenti nell'immagine identificano i corpi cellulari o i piccoli vasi sanguigni per verificare la risposta del sensore al pH.

Abbiamo impiegato l'uso dell'ipercapnea. Infatti, è noto che l'anidride carbonica altera l'equilibrio dei tamponi carbonato nel sangue e nei tessuti, con conseguente acidificazione del tessuto. Come si vede in questo grafico, l'inalazione del 30% di anidride carbonica è sufficiente per indurre una forte risposta del sensore che è completamente reversibile al momento della ventilazione del mouse.

Questi risultati dimostrano il potenziale dei sensori basati su ofer per evidenziare i cambiamenti fisiologici e patologici del pH nelle cellule viventi e in vivo. R, la nostra procedura è compatibile con altre misurazioni come le registrazioni elettrofisiologiche. Ciò ha permesso di ottenere contemporaneamente informazioni complementari sul processo biologico in corso.

Questo metodo, dopo il suo sviluppo, ha aperto la strada ai ricercatori in biologia cellulare e neurobiologia per esplorare i processi regolati dal pH nelle cellule di coltura e in vivo.