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Chemistry

Síntesis, Entrega y Celular Published: September 10, 2013 doi: 10.3791/50545
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 3, 4, 2
1Institute for Complex Molecular Systems & Laboratory of Macromolecular and Organic Chemistry, Eindhoven University of Technology & NEST, Scuola Normale Superiore and Istituto Nanoscienze-CNR, 2NEST, Scuola Normale Superiore and Istituto Nanoscienze-CNR & IIT@NEST, Center for Nanotechnology Innovation, 3NEST, Scuola Normale Superiore and Istituto Nanoscienze-CNR, 4IIT@NEST, Center for Nanotechnology Innovation

Summary

Sensores de fluorescencia son herramientas poderosas en ciencias de la vida. Aquí se describe una metodología para sintetizar y utilizar sensores fluorescentes basadas en dendrímeros para medir el pH en las células vivas e in vivo. El andamio dendríticas mejora las propiedades de los tintes fluorescentes conjugados que conducen a propiedades mejoradas de detección.

Abstract

El desarrollo de indicadores fluorescentes representó una revolución para las ciencias de la vida. Genéticamente codificados y fluoróforos sintéticas con capacidades de detección permite la visualización de las especies de importancia biológica con alta resolución espacial y temporal. Los colorantes sintéticos son de particular interés, gracias a su elevada capacidad de ajuste y la amplia gama de analitos medibles. Sin embargo, estas moléculas sufren varias limitaciones relacionadas con la pequeña molécula de la conducta (mala solubilidad, las dificultades en la selección, a menudo no hay imagen radiométrica permitido). En este trabajo presentamos el desarrollo de sensores basadas en dendrímeros y presentamos un procedimiento para la medición de pH in vitro, en células vivas y en vivo. Elegimos dendrímeros como plataforma ideal para nuestros sensores por sus muchas propiedades deseables (monodispersidad, propiedades sintonizables, multivalencia) que los de un andamio ampliamente utilizado por varios dispositivos biomédicos hechos. La conjugación del pH fluorescenteindicadores al andamio dendrímero condujeron a una mejora de sus actuaciones de detección. En particular, los dendrímeros presentan reduce las fugas de células, mejorando la orientación intracelular y permitir mediciones radiométricas. Estos nuevos sensores se emplean con éxito para medir el pH en las células HeLa que viven e in vivo en cerebro de ratón.

Introduction

El uso de moléculas fluorescentes para etiquetar moléculas biológicamente relevantes específicos ha cambiado completamente la forma en que estudiamos sistemas biológicos. Widefield y microscopía confocal permitió un tiempo real de alta resolución de visualización de procesos biológicos y en la actualidad se encuentran entre las técnicas más populares para estudiar los eventos biológicos in vitro, en células e in vivo. 1 Una mejora relevante estuvo representado por el desarrollo de indicadores de fluorescencia , es decir, colorantes cuya fluorescencia es dependiente de la concentración de una entidad molecular específica. indicadores de pH y calcio, en particular, han tenido un impacto dramático en el estudio de la fisiología de las células debido a la enorme relevancia de H + y Ca 2 + iones en la biología. 2,3

Sin embargo, la mayoría de los tintes de detección presentan varias limitaciones intrínsecas relacionadas con su comportamiento pequeña molécula, tales como: i) dificultades en targeti subcelularng; ii) escasa solubilidad en agua y por lo tanto pobre biocompatibilidad;. y iii) la fuga de células y por lo tanto la falta de tiempo la capacidad de time-lapse 4 Por otra parte, la señal de muchas sondas no se puede corregir para la dependencia de la concentración de colorante (no radiométrica de imágenes) y, por lo tanto, una medida absoluta en células o in vivo no es posible.

Recientemente hemos descrito una metodología sencilla y eficaz para superar estas limitaciones, basado en la conjugación de los tintes de detección en un andamio dendrímero. 5 Los dendrímeros son polímeros hiperramificados monodispersas con propiedades muy atractivas para aplicaciones biológicas. 6 En particular, varias arquitecturas dendríticas se han desarrollado y utilizado de drogas 7 y la entrega de genes. 8 Sólo muy recientemente varios grupos comenzaron a explorar el potencial de estas moléculas como andamio para dispositivos de detección. 9,10,11

Anteriormentese describe una ruta sintética fácil hacia la funcionalización de diferentes poliamidoamina (PAMAM) andamios sobre la base de ésteres activados-NHS. 12 Los conjugados se pueden obtener en una sola etapa por medio de diálisis como sólo la purificación. Curiosamente este enfoque se puede aplicar fácilmente a una variedad de andamios dendríticas o poliméricos. 13,14

Para lograr dendrímeros de formación de imágenes radiométricas fueron doble marcado con dos conjuntos de colorantes: i) un indicador de pH (es decir, fluoresceína) y ii) un resto fluorescente independiente del pH (es decir, la rodamina). Esto nos permitió realizar imágenes pH preciso como el cociente entre la fluoresceína y rodamina sólo depende del pH y no más de la concentración de la sonda. Otro enfoque interesante para este problema está representada por el uso de sondas basadas en toda la vida. 15 Como el tiempo de vida no depende de la concentración de la sonda estas mediciones no necesitan una corrección radiométrica. Sin embargo, LIFmediciones Etime requieren una configuración de instrumento más complicado y su resolución temporal es sub-óptimo para los procesos fisiológicos rápidos, lo que limita sus posibles aplicaciones.

Con el fin de realizar las imágenes de intracelular, la sonda tiene que ser entregado a través de la membrana plasmática en el citosol. Como los dendrímeros no están membrana permeable debido a su tamaño y la hidrofilia, la administración intracelular podría lograrse mediante electroporación. Por medio de esta técnica, ampliamente utilizado en biología para la transfección, macromoléculas marcadas se pueden entregar de manera efectiva en las células para realizar las imágenes de alta calidad. Por otra parte, con la electroporación las complicaciones relacionadas con la endocitosis dendrímero se pueden evitar como las macromoléculas son entregados directamente al citoplasma. Curiosamente después de electroporación diferentes dendrímeros muestran localizaciones distintas dentro de las células, incluso en ausencia de una secuencia de acceso específica. 5 Este passive focalización, sólo se debe a las propiedades físico-químicas del dendrímero, se puede aprovechar para lograr imágenes pH-orgánulo específico.

Radiométrico de imágenes se puede realizar utilizando microscopía confocal. Fluoresceína y rodamina, covalentemente conjugado con el andamio dendríticas, se obtuvieron imágenes por separado y una relación de mapa píxel por píxel se ha creado. Se informó de varios procedimientos para controlar el pH intracelular en las células vivas mediante ionóforos. Los ionóforos son pequeñas moléculas hidrófobas capaces de transportar iones a través de la membrana plasmática; ionóforos de iones H +, tales como nigericina, están disponibles y se puede utilizar para calibrar sensores basados ​​en dendrímeros 16 Estas mediciones revelaron una respuesta lineal a pH de manera similar a lo observado. in vitro. Sobre la base de que el pH intracelular de calibración podría ser medido con precisión. Estas mediciones demostraron que el sensor basado en dendrímero puede ser una herramienta valiosa en el estudio de H + homeostasis en las células vivas y los procesos patológicos que implican un mal funcionamiento de regulación de pH.

Recientemente hemos demostrado que los sensores de pH basados ​​en dendrímeros también se pueden aplicar in vivo, la realización de imágenes de pH en el cerebro de los ratones anestesiados. 17 Debido a la complejidad del entorno de los tejidos vivos de una alta calidad en la detección in vivo es técnicamente difícil. Aquí se muestra una descripción detallada del procedimiento experimental para obtener imágenes de pH in vivo con énfasis de los temas cruciales que deben abordarse para realizar una imagen precisa del pH en el cerebro. Microscopía de dos fotones ha sido empleado por dos razones principales: i) el uso de la luz infrarroja permite superar la falta de penetración en el tejido de la microscopía confocal estándar; ii) la amplia absorción de dos fotones de fluoresceína y rodamina permite evitar su excitación simultánea del complicaciones relacionadas con el uso de dos longitudes de onda para la excitación. mediciones de pH en el cerebro de ratones fueronllevaron a cabo con éxito; sensores responden fácilmente a la hipoxia induce el cambio de pH en el espacio extracelular del cerebro. Estas mediciones demuestran que los indicadores basados ​​en dendrímeros pueden ser utilizados con éxito para resaltar cambio fisiológico y patológico de pH in vivo en un modelo animal.

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Protocol

1. Síntesis de los Sensores

  1. En la siguiente sección, se proporciona un procedimiento para la conjugación de indicadores de pH a dendrímeros PAMAM. El mismo protocolo se puede aplicar con modificaciones mínimas a dendrímeros de amina de soporte de alternativas. 5,17,13,14 dendrímeros y colorantes comercialmente disponibles pueden ser utilizados sin más purificaciones.
  2. Disolver el dendrímero en DMSO anhidro (concentración final 50 mM). Preparar soluciones madre 10 mM de fluoresceína-NHS y tetrametil-rodamina-NHS (TMR) en DMSO anhidro.
  3. Añadir a la solución dendrímero la cantidad deseada de fluoresceína y TMR. La relación molar en la mezcla reflejará la cantidad de colorantes cargados en el dendrímero. Típicamente 1 ml de solución de dendrímero PAMAM G4 en un tubo de microcentrífuga se hace reaccionar con 8 eq (40 mu l) de fluoresceína y 8 eq (40 mu l) de TMR. Se agita la solución a temperatura ambiente durante 12 h.
  4. Diluir 1:10 con agua desionizada y cargar la reacciónmezcla en una bolsa de diálisis (MWCO = 10 kDa). Se dializa durante 24 horas frente a agua desionizada reemplazar con frecuencia el agua en el depósito.
  5. Transfiera la solución a un vial y se liofiliza durante 24 horas. Un polvo de color púrpura se debe obtener. Peso del sólido obtenido y se disuelven en agua MilliQ a una concentración final de 10 mM. Alícuota de la solución y se almacenan a -20 ° C.

2. In Vitro de pH Las mediciones

  1. Para la calibración in vitro preparar una solución 500 nM de dendrímero en PBS (fosfato 2 mM) en una cubeta de cuarzo. Se recomienda el uso de un tampón de PBS muy diluidas (2 mM) para evitar cambios bruscos de pH durante la valoración.
  2. Medir los espectros de emisión de la fluoresceína (exc 488 nm) y TMR (exc 550 nm) y optimizar la configuración ópticas del fluorímetro para lograr una buena relación señal-ruido.
  3. Realizar una valoración del pH mediante la adición de pequeñas cantidades de NaOH 0,1 N y HCl 0,1 N. Después de cada adición agitar la cubetapara mezclar, esperar 1 min para el equilibrio y medir el pH por medio de un microelectrodo de pH. Espectros de emisión de la fluoresceína y TMR debe registrarse para cada paso sin ningún cambio en la configuración óptica.
  4. Trazar la intensidad de fluorescencia vs pH para la titulación. La señal de rodamina no debería verse afectada por el pH (<10%). La señal de fluoresceína debe ser una curva sigmoidal y debe ser equipado con un modelo de una sola unión con pK = 6,4.

3. Cultivo celular y electroporación

  1. Cultivar las células HeLa en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal al 10% y 100 U / ml de penicilina, y 100 mg / ml de estreptomicina (Invitrogen). Mantener el cultivo de células a 37 ° C en el 5% de CO 2 humidificado atmósfera.
  2. Para la electroporación dendrímero, cuando las células son confluentes, extraiga el soporte y lavar las células mediante DPBS (fosfato de Dulbecco-Buffered Saline). Retire el DPBS y añadir tripsina-EDTA. Neutralizar el tryppecar mediante la adición de un medio que contiene suero, pero no antibióticos. Centrifugar a 900-1.200 rpm durante 2 min a temperatura ambiente. Retire el papel y enjuague el pellet con DPBS.
  3. Contar las células y tomar 4 * 10 6 células. Centrifugar a 1.200-1.500 rpm durante 2 min a temperatura ambiente.
  4. Resuspender el sedimento de células en 200 l de tampón de microporos (proporcionado por el fabricante microporator) y transferir las células a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
  5. Añadir solución acuosa dendrímero en células resuspendidas. La cantidad de dendrímero requerido por muestra es dependiente del tipo PAMAM (típicamente 250 nM para catiónico y 2 M durante dendrímeros neutros).
  6. Añadir tampón de electroporación (proporcionado por el fabricante microporator) en un tubo de microporos. Pipetear las células y los dendrímeros mezclas con punta de electroporación de 100 l de volumen de tamaño. Inserte la pipeta microporator en la estación de la pipeta. Establecer la condición de impulsos para microporación: tensión de impulso = 1005 V; wid pulsoth = 35 ms, el número de pulsos = 2.
  7. Después de que las células de transferencia de impulsos a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y centrifugar las células durante 5 min a 1200 rpm para eliminar el exceso de dendrímero en el medio. Placa de 10 l de células sometidas a electroporación en 35 mm platos con fondo de cristal (Willco plato GWSt-3522) con un nuevo medio w / o antibióticos.

4. Detección de pH en las células vivas HeLa

  1. Celdas de imagen con un microscopio confocal de 12 horas después de la electroporación.
  2. Conjunto de filtros estándar de fluoresceína y rodamina se puede utilizar. Si los filtros sintonizables están disponibles un conjunto de canal verde 500-550 nm y un canal rojo de 580 nm a 650 nm. La excitación a 488 nm es óptimo para la fluoresceína mientras rodamina podría ser reflejado ya sea con el 543nm o la línea de láser 561.
  3. Enfoque la muestra y ajustar la energía láseres y detectores de ganar para maximizar la relación señal-ruido. Si la electroporación fue el de células exitosos deben ser fluorescentes brillantes en ambos canales. Lala localización depende del tamaño y la carga del dendrímero utilizado. A menudo, algunos de localización lisosomal (pequeñas vesículas perinuclear) está presente debido a la endocitosis o la compartimentación. Si la localización lisosomal es predominante, es decir, la mayor parte de la fluorescencia se localiza en el interior de las vesículas y se observa mala señal en el citosol, esto significa la toxicidad y la medición deben ser desechados. Adquirir secuencialmente los dos canales, si es necesario adquieren varias imágenes y un promedio de las imágenes para mejorar la calidad de la imagen.
  4. Para abrazadera de calibración de pH celular utilizando tampones con ionóforos a diferentes pH y adquirir al menos 20 células por pH como se describe anteriormente. Para una descripción detallada del procedimiento y la composición de los tampones consulte Bizzarri y compañeros de trabajo. 16 Sugerimos para medir al menos 5 puntos de pH = 5,5 a pH = 7,5. pH inferior a 6 son tóxicos para las células, pero tolerada por poco tiempo, le sugerimos adquirir las imágenes lo más rápido posible. Si las célulasdemostrar signos de apoptosis, desechar las células y se reinicie.
  5. Utilice ImageJ o software similar para el análisis de datos. Importe las imágenes del canal verde y rojo, restar fondo y crear un pixel por pixel ratio de la imagen con la herramienta "Calculadora de la imagen".
  6. Dibujar una región de interés (ROI) seleccionar la celda deseada y medir la proporción de verde a rojo intracelular. Analizar todas las imágenes obtenidas y luego trazar la relación frente al pH. En el rango de 5,5 a 7,5 la tendencia debe ser lineal. El ajuste lineal de los puntos obtenidos dará la curva de calibración que se utiliza para convertir la relación de verde a rojo a pH.
  7. Como un control adicional adquirir varias células no tratadas (no ionóforos) y tratar de calcular el pH con la curva de calibración obtenida. Se debe obtener un valor de entre 7,2 y 7,4.

5. In Vivo Preparación de la muestra

  1. Los experimentos se realizaron en C57Bl/6J (hombres y mujeres) entre postnatal day 28 y 70. Anestesiado el ratón con una inyección intraperitoneal de uretano (es decir, carbamato de etilo) (20% w / v en solución salina fisiológica, 20 mg / kg de uretano). Los animales fueron sacrificados después de experimentar con una sobredosis de uretano seguido de una inyección intracardiaca de la misma anestesia.
  2. Realice una inyección intramuscular de dexametasona fosfato de sodio (2 mg / kg de peso corporal) para reducir la respuesta al estrés cortical y el edema cerebral durante la cirugía.
  3. Afeitarse la cabeza del animal y aplicar 2,5% en gel de lidocaína al cuero cabelludo.
  4. Utilice unas tijeras para cortar el colgajo de piel que cubre el cráneo de ambos hemisferios
  5. Lave el hueso expuesto con solución salina y retire suavemente el periostio utilizando fórceps. Esto proporcionará una mejor base para el pegamento y el cemento dental que se adhieran con.
  6. Aplique un poste de acero de cabeza a medida con una cámara de imágenes central y pegarlo con cianoacrilato en un plano aproximadamente paralelo al cráneo sobre la región cortical del il interés y fijar en su lugar con cemento dental blanca (Paladur).
  7. Fijar la cabeza del ratón con el fin de realizar una craneotomía de 2-3 mm de diámetro perforado más de la región de interés.
  8. Trate de minimizar el calentamiento de la corteza durante la cirugía, desgarros durales o sangrado.
  9. Mantenga la corteza superfused con ACSF estéril (NaCl 126 mM, 3 mM KCl, 1,2 mM KH 2 PO 4, 1,3 mM MgSO 4, 26 mM NaHCO 3, 2,4 mM CaCl 2, glucosa 15 mM, 1,2 mM HEPES en H 2 O destilada , pH = 7,4).

6. imágenes pH en cerebro de ratón

  1. Durante la respiración animal ayuda experimento proporcionar O aire enriquecido-2. El oxígeno es enriquecido hasta el 80%. Presión parcial de O2 y el flujo se ajusta con frecuencia para obtener una ayuda a la respiración adecuada. Mantener la temperatura constante del cuerpo a 37 ° C con una manta de calefacción realimentación controlada.
  2. Fijar el animal a través del poste de acero bajo el objetivo de una foto de dosconfiguración n de imagen.
  3. Con el fin de inyectar el sensor en la corteza cerebral cargar una pipeta de vidrio que contiene un electrodo AgCl (diámetro de la punta de 4 mm) con la solución de dendrímero (1 M). El electrodo permitirá grabar los potenciales de campo extracelulares.
  4. Con una configuración de microinyección insertar la pipeta en la corteza a unos 150 m de profundidad. Inyectar durante 1-2 min a una presión de 0,5 psi.
  5. Optimizar la configuración óptica para obtener imágenes. Potencia del láser debe ser ajustado para minimizar fotoblanqueo y fotodaño. Típicamente la potencia del láser empleado es de alrededor de 20 mW y la ganancia de PMT se mantuvo constante a 667 V ya calibraciones anteriores mostraron que esta tensión ofrece la mejor relación S / N.
  6. Para imágenes excitar el sensor a 820 nm y detectar simultáneamente fluoresceína y rodamina a través de filtros de fluorescencia FITC y TRITC estándar.
  7. Para el tiempo de las mediciones resueltas adquieren serie lapso de tiempo a 2 Hz.
  8. Para la corrección de fondo adquiere un marco oscuro con la laser obturador cerrado para medir el ruido térmico promedio que surge en los PMT y el pedestal normalmente añadidos por el sistema electrónico.
  9. Para el análisis de los datos siga el mismo procedimiento indicado en el apartado 4.

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Representative Results

La figura 1 muestra una representación esquemática de la conjugación de detección de colorantes a diferentes andamios dendríticas. Los indicadores resultantes se pueden obtener en una etapa sintética fácil a partir de productos disponibles comercialmente. -Dendrímeros que llevan amina se hacen reaccionar con colorantes activada con NHS en DMSO y se purificaron por diálisis. Este procedimiento general ha sido ya utilizado con éxito para el etiquetado de varios dendrímeros: i) generación del dendrímero PAMAM 2, 4 y 6; 12 dendrímeros PAMAM pegilados 17 e híbridos de PEG-18 dendríticas. Como dendrímeros distintas muestran diferentes interacciones con las células y tejidos (localización, la toxicidad, la permeabilidad, la difusión) la selección de la estructura dendrítica está fuertemente relacionada con la aplicación deseada y para la muestra de interés.

Los sensores comprenden dos conjuntos de colorantes fluorescentes: i) indicadores de pH y ii) mitades de pH insensible que actúan como referencias internas. Although una gran variedad de indicadores y referencias están disponibles, los mejores resultados se han obtenido con fluoresceína y tetrametilrodamina. La relación de los dos colorantes se puede ajustar simplemente utilizando diferentes equivalentes molares en la reacción. La Figura 2 muestra un típico de valoración in vitro de un sensor de pH. Fluoresceína y rodamina pueden ser excitados por separado a 488 nm y 550 nm, respectivamente, lo que permite la diafonía mínima entre los dos canales. Como se puede ver claramente, fluoresceína (Figura 2A) muestra un comportamiento dependiente del pH, mientras que la rodamina (Figura 2A) de la señal no cambia significativamente en el intervalo de pH fisiológico. Por lo tanto, la relación de estas dos señales no depende de la concentración de sensor, pero sólo en el pH. Esta independencia concentración será de gran importancia para las mediciones biológicas como concentración de la sonda intracelular no se puede controlar.

Para las mediciones de células vivas la intrentrega acelular de los sensores dendríticas se consigue a través de la electroporación. Esta técnica es ampliamente utilizado en biología para la transfección de ADN y se puede aplicar con variaciones mínimas en el protocolo del fabricante. A través de la electroporación, las macromoléculas se pueden entregar directamente al citoplasma, evitando cualquier complicación relacionada con el sistema vesicular de endocitosis. Figura 3a muestra imágenes confocales de células HeLa sometidas a electroporación con los sensores de dendrímero. Una señal fuerte tanto en fluoresceína (verde, izquierda) y rodamina (rojo, medio) se observa. Las dos señales perfectamente colocalize demostrar la integridad de la estructura del sensor. Un mapa radiométrica se reconstruye dividiendo las dos imágenes píxel por píxel y representado con una escala pseudocolor (Figura 3a, derecha). Se realizó pH de sujeción con ionóforos, con el fin de calibrar la respuesta del sensor dentro de las células. Calibración con ionóforos es un protocolo bien establecido, Seveprotocolos de RAL se han descrito ampliamente y puede ser utilizado sin modificaciones. 19 Indicadores de responder fácilmente a pH con un cambio de la relación de verde a rojo como se muestra en la Figura 3b. Esto nos ha permitido obtener una curva de calibración (Figura 3c) para mediciones precisas de pH. La tendencia lineal en la calibración demuestra la capacidad del sensor para responder a pH sin ninguna perturbación del entorno celular. La curva de calibración se ha utilizado para determinar el valor del pH de las células HeLa que viven a ser 7,4 y 4,8 para el citoplasma y lisosomas, respectivamente. Estos resultados están en buen acuerdo con la literatura.

Finalmente, mostramos cómo sensores basados ​​en dendrímeros se pueden emplear para formación de imágenes in vivo. Los dendrímeros pueden inyectarse fácilmente a través del tejido con un procedimiento muy similar a los indicadores de calcio ampliamente utilizados. 20 Una vez en el tejido, los indicadores se difunden muy lentamente, allowing de imagen a largo plazo antes de que el drenaje del tejido completo. Los resultados típicos se muestran en la Figura 4. Fluoresceína (verde) y rodamina señales (rojo) se han obtenido de forma simultánea con 820 nm de excitación y el mapa de relación fue construida sobre una base píxel por píxel, de forma similar a vivir mediciones células. En particular, los indicadores se localizan en el espacio extracelular; las áreas no fluorescentes en la imagen identifican cuerpos celulares o los vasos sanguíneos pequeños. Con el fin de verificar la respuesta del sensor de pH, hemos propuesto el uso de hipercapnia. De hecho, el dióxido de carbono se sabe que altera el equilibrio de los tampones carbonato en la sangre y tejidos, lo que resulta en una acidificación de los tejidos. 21 como se muestra en la Figura 4b, la inhalación de 30% de CO 2 es suficiente para inducir una fuerte respuesta de la sensor que es completamente reversible al volver a la ventilación del ratón. Estos resultados demuestran el potencial de los sensores basados ​​en dendrímeros para resaltar fisiológica y PAthological cambios de pH en las células vivas e in vivo.

Figura 1
Figura 1. Síntesis de sensores basados ​​en dendrímeros representación esquemática de sensor de pH basado en dendrímero. El mismo procedimiento puede aplicarse a prácticamente todos los dendrímero amina-cojinete (izquierda). El producto se obtuvo a través de una reacción de conjugación única seguida de diálisis. Haga clic aquí para ver más grande la figura .

Figura 2
Figura 2. In vitro de valoración del pH para un sensor a base de dendrímero. a) Respuesta de la fluoresceína indicador de pH y b) la iReferencia nternal, rodamina, sin ningún cambio en el rango de pH fisiológico.

Figura 3
Figura 3. Los resultados representativos de formación de imágenes de pH en las células HeLa que viven. a) Confocal de imágenes del canal de fluoresceína (izquierda), el canal de rodamina (centro) y pH mapa radiométrico (derecha). b) Calibración de pH con ionóforos. c) representativas mapas radiométricos de las células sujetadas a diferentes pH. . Reproducido de Albertazzi L, Brondi M, Pavan GM, Sato SS, et al (2011) Indicadores fluorescentes Dendrímero basados ​​en:.. In Vitro e In Vivo Aplicaciones PLoS ONE 6 (12), e28450. doi: 10.1371/journal.pone.0028450

Figura 4
Figura 4. de formación de imágenes de pH en elcerebro de ratón anestesiado. un) canal verde y rojo (simultáneamente excitado a 820 nm) y el pH mapa radiométrico. B) típica respuesta del sensor a la hipercapnia (30% de CO 2). Adaptado de:. Reproducido de Albertazzi L, Brondi M, Pavan GM, Sato SS, et al (2011) Indicadores fluorescentes Dendrímero basados ​​en:.. In Vitro e In Vivo Aplicaciones PLoS ONE 6 (12), e28450. doi:. 10.1371/journal.pone.0028450 Haga clic aquí para ver más grande la figura .

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Discussion

Los pasos críticos para formación de imágenes de pH éxito con sensores basados ​​en dendrímeros son: i) la selección del andamio dendríticas correcta y el número de indicadores conjugados a la misma y ii) la optimización de protocolo de entrega sensor en células o in vivo.

El procedimiento de síntesis es bastante fácil y se puede aplicar prácticamente a cada polímero hiperramificado amina-cojinete. Los sensores se pueden obtener de dendrímeros disponibles comercialmente y colorantes activada con NHS en un solo paso. Creemos que este procedimiento modular y sencilla será beneficioso para la aplicación subsiguiente de tales sensores para una variedad de cuestiones biológicas. La purificación se puede lograr de manera efectiva por diálisis para eliminar los colorantes no conjugados. La selección del andamio dendríticas es crucial y depende de la aplicación específica deseada. Diferentes dendrímeros han demostrado tener localizaciones peculiares dentro de las células debido a interacciones específicas con sestructuras ubcellular. Dendrímeros neutrales (por ejemplo acetilado G4 PAMAM) no muestran ninguna interacción dentro de las células y muestran una localización difusa. Por lo tanto representan una buena opción para una proyección de imagen de células enteras. Por el contrario cargado positivamente dendrímeros de generaciones diferentes (de G2 a G6) interacciones electrostáticas pantalla con carga negativa biomoléculas (es decir, ARN) que resulta en la localización celular específica. Dendrímeros catiónicos son por tanto ideales para la imagen-orgánulo específico.

La elección de los colorantes de detección es crítica. Varios indicadores de pH y tintes de pH insensible con emisión de color diferente y H + afinidad (pK) están disponibles. Probamos muchas combinaciones de tintes diferentes y los mejores resultados se obtuvieron con fluoresceína y tetrametilrodamina. Este par proporcionar una buena respuesta al pH en el intervalo fisiológico (pKa = 6,4) y es compatible con comúnmente utilizados configuraciones de filtro microscopía. Para diferentes necesidades, como la medicións en diferente rango de pH, se pueden requerir alguna optimización. Cabe destacar que no todos los indicadores conserven sus propiedades (brillo, PK) en la conjugación dendrímero 5 Este comportamiento depende tanto de tinte y estructuras de dendrímeros,. Sin embargo, hemos sido capaces de informar de varios indicadores donde las propiedades fotofísicas de los indicadores no se ven afectadas de manera significativa. 17 Si este es el caso, se aconseja la conjugación de los colorantes a través de un enlazador con el fin de minimizar las interacciones dendrímero en colorantes. Varios colorantes reactivos están disponibles comercialmente con espaciadores alquilo o 22 en enlazadores de PEG alternativos se puede utilizar. También el número de indicadores y la relación de los indicadores de referencia a los tintes en el andamio es importante. La proporción ideal depende de la sensibilidad espectral de la configuración de la microscopía utilizado y de la muestra biológica de interés 5,17. Aunque puede ser necesaria alguna reparación, el procedimiento sintético muy fácil y rápido facilitará en gran medida el proceso. Finalmenteel grado de funcionalización del dendrímero, es decir, el porcentaje de grupos terminales del dendrímero que se conjuga con colorantes, podría influir en los resultados de los indicadores. Para evitar cualquier problema de solubilidad, se aconseja funcionalización de aproximadamente el 10% -20% de los grupos terminales del dendrímero. En el caso de los dendrímeros pegilados Sin embargo, debido a PEG contribución a la solubilidad, una funcionalización completa se puede lograr. Esto también puede limitar la presencia no deseada de FRET y otros fenómenos de extinción entre los colorantes conjugados.

Los dendrímeros son no permeable a las células, pero la entrega intracelular se puede lograr a través de la electroporación. Se empleó el protocolo del fabricante ADN-transfección de la línea celular de interés sin modificaciones adicionales. Un parámetro importante es la concentración del dendrímero en el tampón de electroporación, en particular en el caso de los indicadores con pobre brillo o dendrímeros que a altas concentraciones podrían ser tóxicos para las células. Bajo concentrations de dendrímero se traducirá en mala señal dentro de las células, mientras que las altas concentraciones causan toxicidad e inducir la muerte celular. La concentración ideal depende de la pareja dendrímero / indicador, así como de la configuración de imagen disponible y puede necesitar algo de optimización. Si un electroporador no está disponible en el laboratorio, la microinyección podría representar una alternativa válida. Sin embargo, esta es una técnica de una sola célula y hará que la adquisición de un número significativo de células fotografiados más laborioso.

El procedimiento de sensores de formación de imágenes es muy flexible y se puede adaptar fácilmente para varias configuraciones de microscopía. Hemos informado anteriormente el uso de los sensores en un sistema confocal con filtros Acusto óptica sintonizables 5,17 sino conjuntos de filtros FITC / TRITC estándar también se puede utilizar. Cuando se obtiene una concentración intracelular óptima, de formación de imágenes de pH es sencillo. Le proponemos optimizar la intensidad del láser, pinhole y detectores de ganar en un gran rango de sensor intracelularconcentraciones antes de ejecutar la calibración de pH con ionóforos. Si la misma configuración microscopia se utiliza en las mismas condiciones la calibración podría ser utilizado para todos los experimentos. Aquí proponemos imagen radiométrica del sensor para evitar la dependencia de la concentración y artefactos. Otra interesante metodología para lograr que se representa por medio de sondas basadas en toda la vida con elegancia para mostradas por Vinogradov y colaboradores 15 y ambos presentan ventajas y desventajas opciones. Mediciones de por vida no requieren ninguna corrección, ya que son procedimientos de concentración independiente y calibración intrínsecamente suelen ser más fáciles y más estable. Por otra parte, un solo color se utiliza para evitar las complicaciones y la posible aberración inducida por la formación de imágenes radiométrica de verde a rojo. Sin embargo, sólo pocas sondas de por vida efectivas están disponibles mientras que una gran variedad de sondas basadas en intensidad son comercialmente accesibles. El equipo requerido para la imagen radiométrica es más simple y más probable disponibles en el mayorinstalación de microscopía stándar. Mediciones de toda la vida, además, están intrínsecamente lento y no se pueden aplicar a seguir los procesos biológicos rápidos. Por lo tanto la elección entre estas dos técnicas depende fuertemente de la instrumentación disponible y en el proceso biológico específico de interés.

Aunque conceptualmente similar, formación de imágenes in vivo es más difícil que en el cultivo celular. Relación señal a ruido se reduce por la dispersión y las interacciones con los tejidos puede influir en la respuesta del sensor. Por otra parte, la difusión a través del tejido y por lo tanto las fugas del indicador de la región de interés representan un problema adicional no está presente para las mediciones intracelulares en cultivo. Por estas razones, la elección del indicador es crucial. Mientras que para las mediciones intracelulares mayoría de los dendrímeros trabajan excelentemente (G4, G4-Ac, G6, híbridos PAMAM-PEG), para la detección in vivo se recomienda el uso de dendrímeros pegilados. 17 Indeed esta arquitectura es particularmente efectiva para este propósito, por varias razones: i) el PEG aumentar el tamaño del dendrímero y reduce su fuga del tejido, ii) el enlazador PEG minimiza la extinción como resultado de tinte tinte y tinte de dendrímero interacciones y iii) el PEG protege a los colorantes del tejido evitando la pérdida de la función a menudo observado después de la inyección de tejido de sensores. La calidad de la detección del pH depende fuertemente de la inyección con éxito de una cantidad suficiente de dendrímero en el tejido. Cuando esto se logra el procedimiento de formación de imágenes y el análisis de datos son similares a lo que ya se informó para el cultivo de células. Esta es una clara demostración de la eficacia del sensor in vivo y se puede utilizar como un control interno de la actividad de indicador antes de cualquier medición.

Creemos que estos resultados, junto con los procedimientos detallados presentados en este trabajo permitirán la aplicación de sensores basadas en dendrímeros para resaltar Physcambios iológica y patológicas de pH en las células vivas e in vivo.

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Disclosures

Por defecto: Los autores tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Conversaciones útiles con ISJA de Feijter y Matt Baker Se agradecen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PAMAM G4 Sigma-Aldrich 412449
Carboxyfluorescein NHS ester Life technologies C-1311
TMR NHS ester Life technologies C-1171
DMSO Sigma-Aldrich D8418
Dyalsis bags Spectrum Labs 132117
WillCo Dishes WillCo Wells GWSt-3512
Urethane Sigma-Aldrich U2500

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References

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Albertazzi, L., Storti, B., Brondi, M., Sulis Sato, S., Michele Ratto, G., Signore, G., Beltram, F. Synthesis, Cellular Delivery and In vivo Application of Dendrimer-based pH Sensors. J. Vis. Exp. (79), e50545, doi:10.3791/50545 (2013).

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