Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

גילוי של פתוגנים תאיים חדשים על ידי Amoebal Coculture וגישות Amoebal העשרה

Published: October 27, 2013 doi: 10.3791/51055
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Microbiology, University Hospital Center and University of Lausanne

Summary

coculture Amoebal היא מערכת תרבית תאים באמצעות אמבות חסיד לגדול באופן סלקטיבי פתוגנים תאיים מסוגלים להתנגד תאי phagocytic כגון אמבות ומקרופאגים. בכך הוא מהווה כלי מפתח כדי לגלות חומרים מזהמים חדשים. העשרת Amoebal מאפשרת גילוי של מיני amoebal החדשים ושל החיידקים תאיים הספציפיים שלהם.

Abstract

פתוגנים תאיים כגון legionella, mycobacteria ואורגניזמים כמו כלמידיה קשים לבודד מפני שהם לעתים קרובות לגדול בצורה גרועה או בכלל לא בתקשורת סלקטיבית המשמשים בדרך כלל כדי לטפח חיידקים. מסיבה זו, רבים של פתוגנים אלה התגלו רק לאחרונה או בעקבות התפרצויות חשובות. פתוגנים אלה קשורים לעתים קרובות עם אמבות, המשמשים כמארח תאים ומאפשרות את ההישרדות וצמיחה של החיידקים. בכוונתנו כאן כדי לספק הדגמה של שתי טכניקות המאפשרות בידוד ואפיון של פתוגנים תאיים הנמצאים בדגימות קליניות או סביבתיות: coculture amoebal והעשרת amoebal. coculture Amoebal מאפשר התאוששות של חיידקים תאיים על ידי inoculating המדגם נחקר על דשא amoebal שיכול להיות נגוע וlysed ידי החיידקים תאיים בהווה במדגם. העשרת Amoebal מאפשרת התאוששות של אמבות הווה במדגם קליני או סביבתי. ההוא יכול להוביל לגילוי של מיני amoebal חדשים, אלא גם של חיידקים תוך תאי חדשים צומחים במיוחד באמבות אלה. יחד, שתי טכניקות אלה לעזור לגלות חיידקים תאיים חדשים מסוגלים לגדול באמבות. בגלל היכולת שלהם להדביק אמבות ולהתנגד phagocytosis, חיידקים תאיים אלה עשויים גם לברוח phagocytosis ידי מקרופאגים וכך, להיות פתוגניים לאאוקריוטים גבוהים יותר.

Introduction

לפני הופעתו של אבחון מולקולרי, מיקרואורגניזמים הנמצאים בנישות סביבתיות או בדגימות קליניות לעתים קרובות זוהו על ידי טיפוחם בתקשורת סלקטיבית שונה, בעיקר על אגר בצלחות פטרי. הפנוטיפ של מושבות חיידקים והפעילות המטבולית שלהם ולאחר מכן אפשר סיווג חיידקים ברמת מין. גם מרק יכול לשמש כדי להגדיל את הרגישות של זיהוי. עם זאת, שתי הטכניקות לא מאפשרות ההתאוששות של חיידקים שגדלים לאט או בכלל לא בתקשורת אלה. זו הסיבה מדוע גישות מולקולריות משמשות כל כך נרחבת בימינו. עם זאת, זיהוי של ה-DNA מספק אין מושג על יכולת הקיום של החיידקים. יתר על כן, לעומת זאת לתרבות, גישות מולקולריות לא לגרום למתח שיכול להיות מאופיין נוסף.

לומדים פתוגנים שגדלים בצורה גרועה על תקשורת מוצקה או שתאי הצורך לגדול הוא מסובך. רוב אלה "קשים לגדול" חיידקים הם סופית אניניםחיידקי acellular, לעתים קרובות גילו ואפיין הבא התפרצויות גדולות כפי שהיה במקרה של pneumophila הלגיונלה. חיידק זה התאפיין בעקבות התפרצות שהתרחשה במהלך כינוס של לגיון האמריקאי. רבים ככל 182 אנשים נדבקו ו29 מתו עקב 1,2 דלקת ריאות חמור. מאוחר יותר הראה כי אמבות היו המארחים הטבעיים של חיידק זה, וכי נוכחותם ברשתות מערכת מיזוג אוויר במלון ומים הייתה במקורו של פרוץ מחלת הלגיונרים שנקרא 3.

האמבות נמצאות ברחבי העולם והיו מבודדות מהקרקע, אוויר, מים ורירית האף של מתנדבים אנושיים (הנסקרת ב 4). אמבות "חיים ללא" אלה הן בדרך כלל החלוקה באופן עצמאי בסביבה, אך ייתכן שמדי פעם לפלוש מארחים מתירנית 5. הזנת אמבות במיקרואורגניזמים שונים באמצעות phagocytosis ועיכול lysosomal לאחר מכן על ידי הי"דdrolases 6. חיידקים תאיים פקולטטיביים או לחייב רבים מסוגלים להתנגד לעיכול ובכך להדביק ולחלק באמבות כמו למשל חיידקים או mycobacteria קשורות כלמידיה הלגיונלה, (הנסקרת ב 7 ו -8). אמבות חיים נטולי סיכוי לייצג את המאגר פוטנציאלי חשוב עבור חיידקים תאיים שעדיין לא התגלו. זה הוביל את הקבוצה שלנו ליישם בלוזאן שתי טכניקות עיקריות, הנקראות coculture amoebal והעשרת amoebal, שאפשרו לקבוצות שונות כדי לבודד כמה מיקרואורגניזמים תאיים לחייב חדשים מדגימות סביבתיות שונות 9-15.

מאז אמבות הן phagocytes המקצועי מרעה על חיידקים, חיידק מסוגל להתנגד phagocytosis ולגדול בתוך הפרוטיסטים אלה עשויים גם ליישב phagocytes אדם ולהיות פתוגניים כלפי בני אדם. זה הודגם באופן חלקי עבור חלק מחיידקים הקשורים לכלמידיה, כגון Waddlia צndrophila. וו chondrophila יכול לגדול לא רק באמבות, אלא גם בכמה סוגי תאים, כגון תאי יונקים אפיתל, מקרופאגים, ושורות תאי דגי 16-18. Coculture amoebal מופיע גם רלוונטי לאיתור חיידקים תאיים בדגימות קליניות 19,20, כוללים צואה שהם מזוהמים בכבדות עם מיני חיידקים שונים 21.

כאן אנו מתארים את השלבים העיקריים של coculture amoebal והעשרת amoebal, כוללים (א) טיפול בדגימות קליניות או סביבתיות, (ב) הגידול של אמבות בתקשורת axenic ועל דשא חיידקים של Escherichia coli ו (ג) הבחירה ואפיון של חיידקים תוך תאיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Amoebal Coculture

1.1 הכנה דגימות

  1. מדגם סביבה
    1. דגימות מים
      סנן את דגימת המים (500 מיליליטר לליטר 1) דרך קרום גודל נקבובית 0.22 מיקרומטר. לאחר מכן, לנער את הקרום בPAS הבינוני מלוח אמבה עמוד (120 מ"ג של NaCl, 4 מ"ג של 4 MgSO • 7H 2 O, 4 מ"ג של CaCl 2 • 2H 2 O, 142 מ"ג של Na 2 HPO 4, ו136 מ"ג KH 2 PO 4 ב1 ליטר של מים מזוקקים).
    2. דגימות מוצקות
      Resuspend דגימות מוצקות כמו דגימות קרקע או חול ודגימות מוצקות למחצה כגון בוצה משופעלת במים מזוקקים או PBS ולסנן אותם דרך קרום גודל נקבובית 0.22 מיקרומטר. לאחר מכן, לנער את הקרום בPAS.
    3. דגימות מזוהמות מאוד עם אמבות ופרוטוזואה אנדוגני
      משקעים ראשון דגימות על ידי צנטריפוגה הנמוכה מהירות (180 XG) עבורr 10 דקות או לסנן אותו דרך קרום גודל נקבובית 5 מיקרומטר. יתר על כן לעבד את supernatant (בהתאמה התסנין), כמו ב1.1.1.
      הערה: טכניקות טיהור אחרות עשויות לשמש כדי לטהר נוסף דגימות סביבתיות: מחממים את המדגם ב50 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות או לטפל עם פתרונות חומצי או בסיסיים 14.
  2. מדגם קליני
    לעבד דגימות קליניות בהתאם למאפיינים פיסיקלי כימי שלהם. נוזלי סינון או צנטריפוגה כדי להסיר זיהומים גדולים. Resuspend דגימות מוצקות. כדי להשתמש ברקמות, טוחן אותם, למשל באמצעות homogeneiser dounce או חרוזי זכוכית, וlyse התאים לשחרר את החיידקים תוך תאיים.

1.2 הכנת אמבות

  1. הכנת מרק
    הכן את אמצעי התקשורת הבאה: מדיה עשירה המכילה peptone, תמצית שמרים וגלוקוז (PYG; של peptone proteose 100 גרם, 10 גרם של תמצית שמרים, 4.9 גרם של 4 MgSO • 7H 2O, 5 גרם של נתרן ציטרט • 2H 2 O, 0.1 גרם של Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2 • 6 שעות 2 O, 1.7 גרם של KH 2 PO 4, 1.97 גרם של Na 2 HPO 4 • 7H 2 O , 45 גרם של גלוקוז, ו0.295 גרם של CaCl 2 ב 5 ליטר של מים מזוקקים) ובינוני שאינו תזונתי כגון PAS למיני Acanthamoeba.
  2. תרבות Amoebal
    1. טפחו את האמבות (מעדיף Acanthamoeba castellanii ATCC 30010 או polyphaga א לינק-AP1) ב ° C25 בצלוחיות תרבית תאים המכילות 30 מיליליטר של מדיום PYG.
    2. לקצור את האמבות ידי טלטול נמרץ של הבקבוק וצנטריפוגה ההשעיה התא 10 דקות ב 1,500 x גרם. שטוף את הכדור פעמיים עם מדיום PAS. ספירת התאים בשקופית טמבלית ולהתאים את עוצמת הקול כדי לקבל השעיה של 5 x 10 5 תאים לכל מיליליטר.
    3. מעביר את ההשעיה amoebal לmicroplates. השתמש 1 מיליליטר לכל טוב ל12 - ו24 wצלחות ell, 500 μl לצלחות 48 היטב ו300 μl לצלחות 96 היטב. דגירה microplate לפחות שעה 2 ב 25 ° C. זה מאפשר שיקוע וחיבור של האמבות לתחתית היטב כל אחד.

1.3 Coculture

  1. חיסון לדוגמא
    1. לחסן את הצלחת מ2.3.3 עם דילולים סידוריים של המדגם מ1.1 או 1.2, בדרך כלל סדרת דילול פי 10 עם, החל מדגם חי 100 μl.
    2. צנטריפוגה microplate ב1,800 XG עבור 10 דקות למשקעים על דשא amoebal מיקרואורגניזמים שעלולים להיות נוכח במדגם. זה מגביר את הקשר וphagocytosis של מיקרואורגניזמים על ידי אמבות.
    3. דגירה צלחות דקות 45 ב ° C25 ולשטוף שלוש פעמים עם PAS ידי החלפת מדיה עם PAS הטרי. הוסף 1 מיליליטר לכל טוב של PAS עם או בלי תוספת של אנטיביוטיקה (סטרפטומיצין, פניצילין, גנטמיצין ו / או vancomycin), בהתאם לbacteriמיני אל שהם חיפשו.
    4. דגירה microplate ב32 ° C באווירת humidified להימנע מיצירת ביצי קיימא של האמבות. שים לב היטב כל יום עם אובייקטיבי 20X כדי לזהות נוכחות של החיידקים הפולשים וlysing אמבות.
    5. במקרה של התפרקות לבצע תת על אמבות טריות ידי inoculating של cocultures 100 μl לmonolayer של כ -10 5 אמבות / 2 סנטימטר. כדי לבודד במיוחד בהתחשב מיני חיידקים, לחסן גם תקשורת אגר ספציפית המיועדת לחיידקים אלה (אגר כלומר BCYE לspp הלגיונלה.).
    6. בהעדר תמוגה, לקחת מcocultures 100 μl ארבעה עד שבעה ימים לאחר החיסון הראשון ולחסן תרבות amoebal טרי של 900 μl בצלחת 24 גם. אם תמוגה המהירה של אמבות הוא ציין בלי התפשטות של חיידקים, נגיף עשוי להיות נוכח. במקרה זה, לסנן את supernatant ב0.22 מיקרומטר ולהשתמש בהשעיה המסוננת להדביק אמבות טריות.

    1.4 בידוד ואפיון בקטריאלי

    1. צביעת חיידקים
      בצע cocultures ישירות על coverslips זכוכית ב24 גם microplates. הסר את המדיום ולבצע צביעה או immunofluorescence.
      1. מכתים Romanowsky השתנה
        1. בואו יבש coverslip. לטבול את coverslip חמש פעמים בפתרון מקבע (2 מ"ג / ליטר הירוק מהיר במתנול).
        2. לטבול חמש הפעמים coverslip בפתרון מכתים אני (1.22 g / L Eosine G בpH חיץ פוספט 6.6)
        3. לבסוף, לטבול את coverslip 5 פעמים בפתרון מכתים השני (thiazine 1.1 g / L בpH חיץ פוספט 6.6).
        4. יש לשטוף את המדגם עם מים מזוקקים. בואו יבש ולצפות על ידי מיקרוסקופ.
      2. מכתים Ziehl-Neelsen
        1. בואו יבש coverslip. כסה את המדגם עם fuchsin Ziehl. מחממים את הצבע עם להבה עד אדים מופיעים.
        2. מגניב בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות לפחותולשטוף עם מים מזוקקים. כסה את המדגם עם 3% פתרון חומצה הידרוכלורית בisopropanol למשך 2 דקות ולשטוף עם מים מזוקקים.
        3. כסה ל30 שניות עם מתילן כחול ולשטוף עם מים מזוקקים. בואו יבש ולצפות על ידי מיקרוסקופ 22.
      3. מכתים Gimenez
        1. הכן פתרון מניות fuchsin בסיסי על ידי ערבוב של 10% fuchsin הבסיסי 100 מיליליטר (10 גרם של fuchsin הבסיסי ב100 אתנול מיליליטר 95%), 250 מיליליטר של 4% פנול מימיים ו650 מיליליטר של מים מזוקקים. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות לפני השימוש.
        2. בואו coverslip לייבש ולתקן על ידי העברתו דרך להבה. כסה את המדגם עם fuchsin טרי המסונן בסיסי (4 מיליליטר של פתרון מניות fuchsin בסיסי ב10 מיליליטר של M 0.1 חיץ פוספט נתרן, pH 7.45) למשך 2 דקות.
        3. יש לשטוף את המדגם עם מים ודגירה בירוק מלכיט (0.8% במים מזוקקים) ל10 שניות. יש לשטוף שוב עם מים וחזור מכתים ירוק מלכיט. יש לשטוף שוב עם מים. בואו coverslip יבש, מ 'ount אותו, ולבחון על ידי מיקרוסקופ 23.
      4. Immunofluorescence
        1. תקן את coverslip על ידי דוגרים במתנול למשך 5 דקות או עם paraformaldehyde 4% עבור 10 דקות.
        2. לשטוף שלוש פעמים עם PBS ו דגירה עבור שעה 2 בפתרון חסימה (BSA 5%, 0.1% Saponin PBS) בטמפרטורת חדר.
        3. דגירה coverslip עבור שעה 1 בחסימת תמיסה המכילה נוגדנים שהועלו נגד מיקרואורגניזם של עניין.
        4. שטוף שוב שלוש פעמים PBS ודגירה עבור שעה 1 עם שני נוגדנים מכוונים נגד הנוגדן הראשוני והצמודים לfluorophore. לשטוף שלוש פעמים עם PBS, הר coverslip ולבחון על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
    2. גילוי ה-DNA על ידי PCR
      תמצית ה-DNA 100-200 μl של coculture amoebal. זיהוי מיקרואורגניזמים עם פריימרים אוניברסליים מיקוד גן 16S rRNA או פריימרים ספציפיים למין של עניין, כגון mycobacteria 24 , Legionella 25 או חברי 26 Chlamydiales.

    2. העשרת Amoebal

    2.1. הכנת מדגם

    Resuspend דגימות מוצקות או חצי מוצקה בPAS ידי vortexing. צנטריפוגה ההשעיה במהירות נמוכה (180 XG) במשך 10 דקות. זה מאפשר העשרה של אמבות חיים ללא בגלולה. Supernatant יכול לשמש לcoculture amoebal והגלול להעשרת amoebal 21.

    2.2. הכנה בינונית

    1. הוסף 1.5 גרם של אגר לשל PAS 100 מיליליטר וחיטוי דקות 15 בינוניות ב121 ° C. יוצקים את המדיום החם בצלחות פטרי ולתת לחזק בטמפרטורת חדר.
    2. לגדול Escherichia coli (ATCC 25922) בLB או thioglycolate מרק לילה בשעה 37 ° C. שטפו את החיידקים פעמיים עם PBS ו resuspend אותם במדיום PAS. לדלל 10x בPAS והתפשט 2-3 מיליליטר של דילול זה על צלחת אגר PAS ולתת להתייבש.

    ass = "jove_step"> 2.3. חיסון לדוגמא

    הוסף ירידה של מדגם (או חתיכת המסנן) בצד אחד של הצלחת ולתת לו לזרום על צלחת פטרי כדי ליצור קו במרכז הצלחת.

    2.4. צמיחת Amoebal ותת amoebal

    1. שים לב לצלחת פטרי מדי יום. אם מול הגירת amoebal מזוהה, לגזור חתיכה קטנה של אגר בחזית ההגירה ולחסן צלחת פטרי NNA טרי מכוסות בדשא של א ' coli.
    2. חזור על reinoculation מספר פעמים בהתאם לטוהר של המדגם, כדי שתהיה לי תרבות טהורה של זן amoebal נתון.

    2.5. אפיון אמבות וחיידקים

    1. לגרד את תאי resuspend אותם PAS.
    2. תמצית ה-DNA ולקבוע את זהותו של אמבות ו / או endosymbionts חיידקים על ידי PCR וסדר (ההגברה 16S rRNA לחיידקים, שו"ת. 18S rRNA לאמבות ורצף, לדוגמא).
      3. <li> השתמש בתאים מגורדים אלה בPAS לחסן אמבות טריות ולבצע coculture amoebal כדי לזהות חיידקים ואולי בהווה במדגם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שימוש coculture amoebal והעשרת amoebal, מגוון רחב של חיידקים פתוגניים ו / או סביבתיים כולה התגלה (טבלת 1).

coculture Amoebal היה בשימוש על ידי הקבוצה ואחרים שלנו לנתח דגימות סביבתיות, מתקני טיהור מים ומערכות הפצת מים. מגוון רחב של מיקרואורגניזמים יכול להיות מבודד עם טכניקה זו. החיידקים הנפוצים ביותר שבודדו על ידי coculture amoebal חברים בסוג Mycobacterium שיכול להיות התאוששו ממתקני טיפול במים ומרשתות מים 13,14,24,27,28. הלגיונלה ומיני α-proteobacteria יכולים גם להיות מבודדות מצמחים לטיפול במים ומרשתות מים חולים 14,24,28-31. מינים הקשורים לכלמידיה כמה גם בודדו ממי נהר ומתקנים לטיפול במים, כמו למשל lausannensis אסטרלה (איורים 2 ב-C 12,15,32,33.

ss = "jove_content"> שימוש coculture amoebal, וירוסי ענק שונים נתגלו, כגון Mimivirus, Marseillevirus וLausannevirus 34-36. וירוסים אלה כולם מסוגלים להדביק ולהתרבות בתוך אמבות ולהציג שלב ליקוי אופייני לאורח החיים הנגיפי שלהם. Mimivirus נחשב לפתוגן ריאה אנושי עדין שכן הוא היה מעורב בזיהום מקרי של טכנאי מעבדה שסבל מדלקת ריאות 37. פתוגניות פוטנציאלית של וירוסים ענק אחרים עדיין צריכה להיחקר.

העשרת Amoebal שימשה לעתים קרובות במקביל לamoebal coculture. לכן, כאשר חוקרים מערכת מפעל לטיפול במים וברשת מים במורד הזרם, 25 זני amoebal שונים זוהו, מתוכם 12 תואם מינים חדשים 14. האמבות היו נוכחים בכל שלב של טיהור מים והפצה, המצביעות על התנגדות של הפרוטיסטים אלה כדי ozonation וכלורינציה. שיתוף חיידקים תאייםULD גם להתגלות באמבות אלה, מראה את החשיבות של אמבות ילידים בהעברה של חיידקים תאיים 14. במחקר אחר, אמבות יכולה להיות מבודדות ממערכת חלוקת מים של בית חולים 24. רוב גדול של הזנים מבודדים במחקר זה תואם vermiformis Hartmannella, שהוא באופן טבעי מסוגל לשרוד בטמפרטורות גבוהות יחסית. כמה חיידקים, כגון הלגיונלה pneumophila ניתן היו לזהות באמבות ילידי 24. דוגמא נוספת של חיידקים שנמצאו באמבה ספציפית היא acantamoebae Parachlamydia. חיידק הקשורים לכלמידיה זה היה מבודד מרירית האף של נשים מתנדבות על ידי העשרת amoebal (איור 2 א) 9, והוא סוכן פוטנציאלי של דלקת ריאות 38. זה מראה את החשיבות של אמבות בתחזוקה והפיזור של חיידקים פתוגנים שעלולה להיות פתוגניים במיוחד עבור immunocompromis שובed חולים 39.

איור 1
איור 1. קווי המתאר של coculture amoebal והעשרת amoebal המתארת ​​את השלבים החשובים של שתי הטכניקות הללו. (מעובד מתוך 40). לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.

איור 2
איור 2. דוגמאות של חיידקים שהתגלו על ידי coculture amoebal וההתבוננות שלהם עם שיטות צביעה שונות.) הכתמה של אמבות coccus הדבקה של Parachlamydia acanthamoebae הול עם Romanowsky שיטת 24 שעות שונה לאחר הדבקה, עם הגדלה של 1,000 X. חיידקים הם מוכתמים בכחול (rrows). לפנה"ס) במיקרוסקופ אלקטרונים של אסטרלה lausannensis מראה את מורפולוגיה הכוכב הטיפוסית של גופים יסודיים (חיצים).

טבלת 1. דוגמאות של חיידקים מסוגים שונים שהתגלו על ידי coculture amoebal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

coculture Amoebal והעשרת amoebal שיטות יעילים שאפשרו את בידודם של מינים רבים של חיידקים וamoebal חדשים. תוצאות שהושגו עם שיטות אלה לאשר את הקיום בכל מקום של שני אמבות וחיידקים עמידים לאמבה בסביבה, ודבר המעניין ביותר ברשתות מים מעשה ידי אדם שנחשבים להיות נשלטו על ידי טיפולים כימיים כגון הכלרה וozonation. coculture Amoebal והעשרת amoebal הן כלים חיוניים לבודד ולטפח מיקרואורגניזמים פוטנציאליים פתוגניים אלה ולהשיג זנים בתרבות טהורה על מנת אז ללמוד הביולוגיה ופתוגניות שלהם עוד יותר. לאחרונה, שיטה זו הותאמה לבידוד תפוקה גבוהה של וירוסים ענקיים 41. באופן דומה, coculture amoebal עלול להיות אוטומטי ומשמש כטכניקה שגרתית כדי לבדוק את איכות מיקרוביולוגית של דגימות סביבתיות ומערכות מים מעשה ידי אדם, כגון מי שתייה.

coculture Amoebal יכוללהתבצע עם מינים שונים של אמבות. אנחנו בדרך כלל מעדיפים להשתמש castellanii Acanthamoeba או א polyphaga שכן הם נוטים פחות ליצירת ביצי קיימא מאשר vermiformis Hartmannella ומאז הם מפגינים ספקטרום מארח גדול יחסית. מינים אחרים עשויים לשמש אבל הפרוטוקול והמרק צריך להיות מותאם. זה כבר הוכיח לאחרונה כי א lenticulana (ATCC 30841) ניתן להשתמש באותם תנאים כמו א castellanii או א יש polyphaga אבל רגישות שונה לזיהום 42. כדי למנוע יצירת ביצי קיימא, חשוב להשתמש בטמפרטורה נמוכה יחסית דגירה (להלן 30 מעלות צלזיוס) וכדי לשמור על אווירת humidified.

ראויים לציון, השכפול המתמשך של סימביוזת amoebal לא יוביל בהכרח לתמוגה amoebal וכאשר דווקא מחפש בסימביוזה, הקרנה על ידי מיקרוסקופ ו / או PCR צריכה להתבצע באופן שיטתי. כדי להימנע מתמוגה או ניתוק של ce amoebal LLS בשל יתר חיידקים, כדאי לבצע חיסון של דגימות מזוהמות בכבדות באמצעות דילולים סדרתי של פי 10.

עם זאת, יש טכניקות אלה מגבלות. בשל השימוש במיני amoebal יחיד, coculture amoebal יכול שלא לאפשר את הבידוד של חיידקים שישמשו כמאגר נוסף מיני amoebal. יתר על כן, מיני amoebal ספציפיים כגון ייתכן שלא יוכלו להתרבות בE. מדשאות וcoli ניתן על ידי העשרת amoebal שלא נענו. בהתאם למאפיינים של החיידקים או האמבות נחקרו, ייתכן שיהיה צורך לבחון את אמצעי המדיה שונה, מיני amoebal שונים ומיני חיידקים שונים כדי להאכיל את האמבות (Enterobacter doacae וכמה זני Pseudomonas חלופות טובות). זיהום חיידקים של אמבות או מדיה המשמשות לcoculture amoebal עלול להתרחש ועלול להוביל לתוצאות חיוביות כוזבות. ביקורת שלילית היא אפוא חובה להימנע מתוצאות חיוביות כוזבות כזה.

תוכן "> לסיכום, coculture amoebal והעשרת amoebal שתי גישות משלימות, שמייצגות כלים מעניינים לציין את האקולוגיה ומגוון הביולוגי של אמבות חופשיות החי ושל חיידקים עמידים לאמבות. טכניקות אלו מאפשרות הגילוי של מינים רבים חדשים, כוללים אמבות, חיידקים ווירוסים ענק, ויצרו את הבסיס למחקרים עתידיים כדי לחקור את פתוגניות של מיקרואורגניזמים אלה רומן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

אנו מודים ליחסי ציבור. ברנרד לה סקולה לעצות טכניות מועילות ודיון מעניין על coculture amoebal והעשרת amoebal. אנו מודים גם לד"ר וינסנט תומאס על עזרתו ביישום הטכניקה במעבדה שלנו.

Materials

מעמד דוגמאות מינים הפניה
α-proteobacteria Odyssella thelassonicensis 10
ב-proteobacteria cepacia Burkholderia 36
g-proteobacteria drancourtii הלגיונלה 26
Chlamydiae אסטרלה lausannensis 30
Flavobacteriae Amoebophilus asiaticus 37
Actinobacteria spp mycobacteria. 38
Name Company Catalog Number Comments
Glucose monohydrate Merck, Darmstadt, Germany 108342
0.22 μm pore size membrane Merck Millipore, Darmstadt, Germany SCVPU11RE
proteose peptone Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ 211693
yeast extract Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ 212750
Cell culture flasks Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ 353135
Kova slide Hycor, Indianapolis, IN 87144
cell culture microplates Corning Inc, Corning, NY 3524
Diff-Quik staining kit Siemens Healthcare diagn., Munich, Germany 130832
Ziehl fuchsin Fluka, St-Louis, MI 21820
basic fuchsin Sigma, St-Louis, MI 857843
Phenol Sigma, St-Louis, MI P1037 Corrosive and mutagenic
malachite green oxalate Fluka, St-Louis, MI 63160
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA 15710
Saponin Sigma, St-Louis, MI 84510

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fraser, D. W., et al. Legionnaires' disease: description of an epidemic of pneumonia. New Engl. J. Med. 297, 1189-1197 (1977).
  2. McDade, J. E., et al. Legionnaires' disease: isolation of a bacterium and demonstration of its role in other respiratory disease. New Engl. J. Med. 297, 1197-1203 (1977).
  3. Rowbotham, T. J. Preliminary report on the pathogenicity of Legionella pneumophila for freshwater and soil amoebae. J. Clin. Pathol. 33, 1179-1183 (1980).
  4. Rodriguez-Zaragoza, S. Ecology of free-living amoebae. Crit. Rev. Microbiol. 20, 225-241 (1994).
  5. Booton, G. C., Visvesvara, G. S., Byers, T. J., Kelly, D. J., Fuerst, P. A. Identification and distribution of Acanthamoeba species genotypes associated with nonkeratitis infections. J Clin. Microbiol. 43, 1689-1693 (2005).
  6. Brussow, H. Bacteria between protists and phages: from antipredation strategies to the evolution of pathogenicity. Molecular microbiology. 65, 583-589 (2007).
  7. Greub, G., Raoult, D. Microorganisms resistant to free-living amoebae. Clin. Microbiol. Rev. 17, 413-433 (2004).
  8. Thomas, V., McDonnell, G., Denyer, S. P., Maillard, J. Y. Free-living amoebae and their intracellular pathogenic microorganisms: risks for water quality. FEMS Microbiol Rev. 34, 231-259 (2010).
  9. Birtles, R. J., Rowbotham, T. J., Storey, C., Marrie, T. J., Raoult, D. Chlamydia-like obligate parasite of free-living amoebae. Lancet. 349, 925-926 (1997).
  10. Amann, R., et al. Obligate intracellular bacterial parasites of acanthamoebae related to Chlamydia spp. Appl. Environ. Microbiol. 63, 115-121 (1997).
  11. Birtles, R. J., et al. Candidatus Odyssella thessalonicensis' gen. nov., sp. nov., an obligate intracellular parasite of Acanthamoeba species. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50, 63-72 (2000).
  12. Thomas, V., Casson, N., Greub, G. Criblamydia sequanensis, a new intracellular Chlamydiales isolated from Seine river water using amoebal co-culture. Environ. Microbiol. 8, 2125-2135 (2006).
  13. Pagnier, I., Raoult, D., La Scola, B. Isolation and identification of amoeba-resisting bacteria from water in human environment by using an Acanthamoeba polyphaga co-culture procedure. Environ. Microbiol. 10, 1135-1144 (2008).
  14. Thomas, V., Loret, J. F., Jousset, M., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoebae-resisting bacteria in a drinking water treatment plant. Environ. Microbiol. 10, 2728-2745 (2008).
  15. Corsaro, D., et al. Novel Chlamydiales strains isolated from a water treatment plant. Environ. Microbiol. 11, 188-200 (2009).
  16. Goy, G., Croxatto, A., Greub, G. Waddlia chondrophila enters and multiplies within human macrophages. Microbes Infect. 10, 556-562 (2008).
  17. Kebbi-Beghdadi, C., Cisse, O., Greub, G. Permissivity of Vero cells, human pneumocytes and human endometrial cells to Waddlia chondrophila. Microbes Infect. 13, 566-574 (2011).
  18. Kebbi-Beghdadi, C., Batista, C., Greub, G. Permissivity of fish cell lines to three Chlamydia-related bacteria: Waddlia chondrophila, Estrella lausannensis and Parachlamydia acanthamoebae. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 63, 339-345 (2011).
  19. Fry, N. K., Rowbotham, T. J., Saunders, N. A., Embley, T. M. Direct amplification and sequencing of the 16S ribosomal DNA of an intracellular Legionella species recovered by amoebal enrichment from the sputum of a patient with pneumonia. FEMS Microbiol. Lett. 67, 165-168 (1991).
  20. Rowbotham, T. J. Isolation of Legionella pneumophila serogroup 1 from human feces with use of amebic cocultures. Clin. Infect. Dis. 26, 502-503 (1998).
  21. Greub, G., La Scola, B., Raoult, D. Amoebae-resisting bacteria isolated from human nasal swabs by amoebal coculture. Emerging Infect. Dis. 10, 470-477 (2004).
  22. Isenberg, H. D. Clinical microbiology procedures handbook. , (1992).
  23. Gimenez, D. F. Staining Rickettsiae in Yolk-Sac Cultures. Stain Technol. 39, 135-140 (1964).
  24. Thomas, V., Herrera-Rimann, K., Blanc, D. S., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoeba-resisting bacteria in a hospital water network. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2428-2438 (2006).
  25. Miyamoto, H., et al. Development of a new seminested PCR method for detection of Legionella species and its application to surveillance of legionellae in hospital cooling tower water. Appl. Environ. Microbiol. 63, 2489-2494 (1997).
  26. Lienard, J., et al. Development of a new chlamydiales-specific real-time PCR and its application to respiratory clinical samples. J. Clin. Microbiol. 49, 2637-2642 (2011).
  27. Wang, Y., Ogawa, M., Fukuda, K., Miyamoto, H., Taniguchi, H. Isolation and identification of mycobacteria from soils at an illegal dumping site and landfills in Japan. Microbiol. Immunol. 50, 513-524 (2006).
  28. Corsaro, D., Pages, G. S., Catalan, V., Loret, J. F., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoeba-associated bacteria in water treatment plants. Int. J. Hygiene Environ. Health. 213, 158-166 (2010).
  29. La Scola, B., et al. Legionella drancourtii sp. nov., a strictly intracellular amoebal pathogen. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54, 699-703 (2004).
  30. Thomas, V., Casson, N., Greub, G. New Afipia and Bosea strains isolated from various water sources by amoebal co-culture. Syst. Appl. Microbiol. 30, 572-579 (2007).
  31. La Scola, B., et al. Amoeba-resisting bacteria and ventilator-associated pneumonia. Emerging Infect. Dis. 9, 815-821 (2003).
  32. Collingro, A., et al. Recovery of an environmental Chlamydia strain from activated sludge by co-cultivation with Acanthamoeba sp. Microbiology. 151, 301-309 (2005).
  33. Lienard, J., Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. Estrella lausannensis, a new star in the Chlamydiales order. Microbes Infect. 13, 1232-1241 (2011).
  34. La Scola, B., et al. A giant virus in amoebae. Science. 299, 2033 (2003).
  35. Boyer, M., et al. Giant Marseillevirus highlights the role of amoebae as a melting pot in emergence of chimeric microorganisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 21848-21853 (2009).
  36. Thomas, V., et al. Lausannevirus, a giant amoebal virus encoding histone doublets. Environ. Microbiol. 13, 1454-1466 (2011).
  37. Raoult, D., Renesto, P., Brouqui, P. Laboratory infection of a technician by mimivirus. Ann. Internal Med. 144, 702-703 (2006).
  38. Greub, G. Parachlamydia acanthamoebae, an emerging agent of pneumonia. Clin. Microbiol. Infect. 15, 18-28 (2009).
  39. Lamoth, F., Greub, G. Amoebal pathogens as emerging causal agents of pneumonia. FEMS Microbiol. Rev. 34, 260-280 (2010).
  40. Lienard, J. G. Ch. 6. Environmental microbiology, current technology and water applications. Ashbolt, K., Sen, N. J. , Caister Academic Press. 143-162 (2011).
  41. Boughalmi, M., et al. High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment. Environ. Microbiol. , (2012).
  42. Ovrutsky, A. R., et al. Cooccurrence of Free-Living Amoebae and Nontuberculous Mycobacteria in Hospital Water Networks, and Preferential Growth of Mycobacterium avium in Acanthamoeba lenticulata. Appl. Environ. Microbiol. 79, 3185-3192 (2013).

Tags

אימונולוגיה גיליון 80 מיקרוביולוגיה סביבתית מיקרוביולוגיה של הקרקע מיקרוביולוגיה ימית אמבות מיקרואורגניזמים coculture מחייבות את חיידקים תאיים
גילוי של פתוגנים תאיים חדשים על ידי Amoebal Coculture וגישות Amoebal העשרה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jacquier, N., Aeby, S., Lienard, J., … More

Jacquier, N., Aeby, S., Lienard, J., Greub, G. Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches. J. Vis. Exp. (80), e51055, doi:10.3791/51055 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter