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Immunology and Infection

Amoebal coculture और Amoebal संवर्धन दृष्टिकोण से नई intracellular रोगज़नक़ों की डिस्कवरी

Published: October 27, 2013 doi: 10.3791/51055
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Microbiology, University Hospital Center and University of Lausanne

Summary

Amoebal coculture चुनिंदा ऐसे अमीबा और मैक्रोफेज के रूप में phagocytic कोशिकाओं का विरोध कर intracellular रोगज़नक़ों बढ़ने के अनुयायी अमीबा का उपयोग एक सेल संस्कृति प्रणाली है. यह इस प्रकार नए संक्रामक एजेंटों को खोजने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है. Amoebal संवर्धन नई amoebal प्रजातियों की और उनके विशिष्ट intracellular बैक्टीरिया की खोज की अनुमति देता है.

Abstract

ऐसे लीजोनेला, माइक्रोबैक्टीरिया और क्लैमाइडिया तरह जीवों के रूप में intracellular रोगज़नक़ों वे अक्सर सब पर आमतौर पर बैक्टीरिया खेती करने के लिए उपयोग किया जाता है कि चयनात्मक मीडिया पर खराब या नहीं बढ़ने की वजह से अलग करना मुश्किल है. इस कारण से, इन रोगजनकों के कई केवल हाल ही में खोज या महत्वपूर्ण प्रकोप पीछा कर रहे थे. ये रोगजनकों अक्सर मेजबान सेल के रूप में सेवा और बैक्टीरिया के अस्तित्व और विकास के लिए अनुमति देते हैं जो अमीबा, के साथ जुड़े रहे हैं. Amoebal coculture और amoebal संवर्धन: हम नैदानिक ​​या पर्यावरणीय नमूने में intracellular रोगज़नक़ों के अलगाव और लक्षण मौजूद अनुमति देते हैं कि दो तकनीकों के एक प्रदर्शन प्रदान करने के लिए यहाँ चाहते हैं. Amoebal coculture नमूने में मौजूद intracellular जीवाणु से संक्रमित और lysed जा सकता है कि एक amoebal लॉन पर जांच नमूना inoculating द्वारा intracellular जीवाणुओं की वसूली की अनुमति देता है. Amoebal संवर्धन एक नैदानिक ​​या पर्यावरणीय नमूने में अमीबा की वसूली वर्तमान की अनुमति देता है. गुलेकिन यह भी इन अमीबा में विशेष रूप से बढ़ रही है नए intracellular बैक्टीरिया की नई amoebal प्रजातियों की खोज का कारण बन सकता है. साथ में, इन दो तकनीकों अमीबा में विकसित करने में सक्षम नई intracellular बैक्टीरिया को खोजने के लिए मदद करते हैं. क्योंकि अमीबा को संक्रमित और phagocytosis का विरोध करने की क्षमता की वजह से, इन intracellular जीवाणु भी मैक्रोफेज द्वारा phagocytosis बच सकता है, जिससे eukaryotes के लिए रोगजनक हो.

Introduction

आणविक निदान के आगमन से पहले, पर्यावरण niches में या नैदानिक ​​नमूनों में मौजूद सूक्ष्मजीवों अक्सर मुख्य रूप से पेट्री डिश में अगर पर, विभिन्न चयनात्मक मीडिया पर उन्हें खेती से पता चला रहे थे. बैक्टीरियल कालोनियों और उनके चयापचय गतिविधि के phenotype तो प्रजातियों स्तर पर बैक्टीरियल वर्गीकरण की अनुमति दी. रसा भी पता लगाने की संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, दोनों तकनीकों पर इन सभी मीडिया पर धीरे धीरे या नहीं बढ़ने कि बैक्टीरिया की वसूली की अनुमति नहीं है. यह आणविक दृष्टिकोण इतना व्यापक रूप से आजकल प्रयोग किया जाता है कारण है. फिर भी, डीएनए का पता लगाने के बैक्टीरिया की व्यवहार्यता पर कोई सुराग प्रदान करता है. इसके अलावा, इसके विपरीत संस्कृति को, आणविक दृष्टिकोण आगे होती जा सकता है कि एक तनाव में परिणाम नहीं है.

विकसित करने के लिए ठोस मीडिया या कि जरूरत कोशिकाओं पर खराब हो जाना कि रोगजनकों पढ़ाई करना जटिल है. इनमें से अधिकांश बैक्टीरिया दुराराध्य intr हैं "मुश्किल विकसित करने के लिए"अकोशिकीय बैक्टीरिया, अक्सर खोज की और यह लीजोनेला pneumophila के लिए मामला था के रूप में बड़े प्रकोप निम्नलिखित विशेषता है. यह जीवाणु एक अमेरिकी सेना सम्मेलन के दौरान हुई कि एक प्रकोप के बाद होती थी. कई के रूप में 182 के रूप में व्यक्तियों संक्रमित और 29 की वजह से एक गंभीर निमोनिया 1,2 को मृत्यु हो गई. यह बाद में अमीबा प्राकृतिक इस जीवाणु के मेजबान और होटल एयर कंडीशनिंग प्रणाली और पानी के नेटवर्क में अपनी उपस्थिति तथाकथित लीजन रोग 3 के फैलने के मूल में था कि थे कि प्रदर्शन किया गया.

अमीबा दुनिया भर में मौजूद हैं और मिट्टी, हवा, पानी और (4 में समीक्षा) मानव स्वयंसेवकों की नाक mucosa से अलग थे. ये "मुक्त रहने वाले" अमीबा आम तौर पर वातावरण में स्वायत्त बांट रहे हैं, लेकिन कभी - कभी अनुमोदक मेजबान 5 आक्रमण कर सकते हैं. हरियाणा द्वारा phagocytosis और बाद में lysosomal पाचन के माध्यम से विभिन्न सूक्ष्मजीवों पर अमीबा फ़ीडdrolases 6. कई ऐच्छिक या लाचार intracellular जीवाणु पाचन विरोध और इस तरह संक्रमित हैं और उदाहरण लीजोनेला, क्लैमाइडिया से संबंधित बैक्टीरिया या माइक्रोबैक्टीरिया के लिए के रूप में अमीबा में विभाजित (7 समीक्षा की और 8) करने में सक्षम हैं. मुक्त रहने वाले अमीबा की संभावना की खोज अभी तक नहीं किया गया है कि intracellular बैक्टीरिया के लिए एक महत्वपूर्ण संभावित जलाशय का प्रतिनिधित्व करते हैं. इस लुसाने में विभिन्न समूहों के विभिन्न पर्यावरणीय नमूने 9-15 से कई नए लाचार intracellular सूक्ष्मजीवों को अलग करने की अनुमति दी है जो amoebal coculture और amoebal संवर्धन नामक दो मुख्य तकनीकों, लागू करने के लिए हमारे समूह का नेतृत्व किया.

अमीबा बैक्टीरिया पर चराई पेशेवर फ़ैगोसाइट हैं, phagocytosis विरोध करने के लिए और इन प्रोटिस्ट अंदर विकसित करने में सक्षम एक जीवाणु भी मानव फ़ैगोसाइट उपनिवेश और मनुष्यों के प्रति रोगजनक हो सकता है. यह आंशिक रूप से इस तरह के Waddlia चो के रूप में कुछ क्लैमाइडिया से संबंधित बैक्टीरिया, के लिए प्रदर्शन किया गयाndrophila. डब्ल्यू chondrophila अमीबा में भी है लेकिन इस तरह के स्तनधारी उपकला कोशिकाओं, मैक्रोफेज, और मछली सेल लाइनों 16-18 के रूप में कई प्रकार की कोशिकाओं में न केवल विकसित कर सकते हैं. amoebal coculture भी भारी अलग प्रजातियों के जीवाणु 21 के साथ दूषित कर रहे हैं जो मल सहित नैदानिक ​​नमूनों 19,20, में intracellular बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए प्रासंगिक प्रतीत होता है.

Axenic मीडिया पर अमीबा (ख) के विकास और Escherichia कोलाई की एक जीवाणु लॉन पर और (ग) चयन और लक्षण वर्णन, यहाँ हम पर्यावरण या नैदानिक ​​नमूनों की (एक) उपचार सहित, amoebal coculture और amoebal संवर्धन के प्रमुख कदम का वर्णन intracellular जीवाणुओं की.

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Protocol

1. Amoebal coculture

1.1 नमूना तैयार

  1. पर्यावरण नमूना
    1. पानी के नमूने
      0.22 सुक्ष्ममापी ताकना आकार झिल्ली के माध्यम से पानी के नमूने (1 एल के लिए 500 मिलीलीटर) तक. फिर, (पृष्ठ के अमीबा खारा मध्यम पीए में झिल्ली हिला NaCl के 120 मिलीग्राम, 4 MgSO की 4 मिलीग्राम • 7 2 हे, 2 CaCl की 4 मिलीग्राम • 2H 2 हे, ना 2 4 HPO के 142 मिलीग्राम, और के.एच. की 136 मिलीग्राम आसुत जल का 1 एल में 2 पीओ 4).
    2. ठोस नमूने
      ऐसे आसुत जल या पीबीएस में सक्रिय कीचड़ के रूप में मिट्टी या रेत के नमूने और अर्द्ध ठोस नमूनों की तरह ठोस नमूने Resuspend और 0.22 सुक्ष्ममापी ताकना आकार झिल्ली के माध्यम से फिल्टर. फिर, पीए में झिल्ली हिला.
    3. अत्यधिक अंतर्जात अमीबा और प्रोटोजोआ के साथ दूषित नमूने
      पहले कम गति centrifugation (180 XG) के लिए से नमूने तलछटआर, 10 मिनट या एक 5 माइक्रोन रोमकूप आकार झिल्ली के माध्यम से यह फिल्टर. इसके अलावा 1.1.1 में के रूप में, सतह पर तैरनेवाला (क्रमशः छानना) की प्रक्रिया.
      नोट: 30 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर नमूना गर्मी या अम्लीय या बुनियादी समाधान 14 के साथ इलाज: अन्य परिशोधन तकनीक आगे नमूने पर्यावरण शुद्ध करना इस्तेमाल किया जा सकता है.
  2. क्लीनिकल नमूना
    उनके भौतिक रासायनिक गुणों के आधार पर चिकित्सीय नमूने की प्रक्रिया. बड़े दोष को दूर करने के लिए फिल्टर या अपकेंद्रित्र तरल पदार्थ. ठोस नमूने Resuspend. , ऊतकों का उपयोग एक Dounce homogeneiser या ग्लास मनकों का उपयोग करके उदाहरण के लिए, उन्हें पीस, और intracellular जीवाणु मुक्त करने के लिए कोशिकाओं lyse करने के लिए.

1.2 अमीबा तैयारी

  1. शोरबा तैयारी
    ; Proteose peptone की 100 ग्राम, खमीर निकालने के 10 ग्राम, 4 MgSO • 7 2 की 4.9 ग्राम peptone, खमीर निकालने और ग्लूकोज (PYG युक्त एक अमीर मीडिया: निम्नलिखित मीडिया की तैयारीहे, सोडियम साइट्रेट की 5 ग्राम • 2H 2 हे, फे (एनएच 4) के 0.1 जी 2 (एसओ 4) 2 • 6 2 हे, के.एच. 2 पीओ 4, ना 2 4 HPO की 1.97 ग्राम की 1.7 ग्राम • 7 2 हे , ग्लूकोज की 45 ग्राम, और आसुत जल के 5 एल में 2 CaCl की 0.295 ग्राम) और इस तरह एकैंथअमीबा प्रजातियों के लिए पीए के रूप में एक गैर पोषक मध्यम.
  2. Amoebal संस्कृति
    1. PYG माध्यम के 30 मिलीलीटर युक्त सेल संस्कृति बोतल में 25 डिग्री सेल्सियस पर अमीबा (preferentially एकैंथअमीबा castellanii ATCC 30010 या ए polyphaga लिंक-AP1) खेती.
    2. कुप्पी की जोरदार झटकों से अमीबा फसल और 1500 x जी पर 10 मिनट के लिए सेल निलंबन अपकेंद्रित्र. पीए के माध्यम से दो बार गोली धो लें. एक Kova स्लाइड में कक्षों की गणना और मिलीलीटर प्रति 5 x 10 5 कोशिकाओं का एक निलंबन प्राप्त करने के लिए मात्रा समायोजित करें.
    3. Microplates में amoebal निलंबन स्थानांतरण. और 24-W - 1 से 12 के लिए अच्छी तरह से प्रति मिलीलीटर का प्रयोग करेंपक्ष प्लेटें, 48 अच्छी तरह प्लेटें और 96 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए 300 μl के लिए 500 μl. 25 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 2 घंटे के लिए microplate सेते यह अच्छी तरह से अवसादन और अमीबा की कुर्की प्रत्येक के नीचे करने के लिए अनुमति देता है.

1.3 coculture

  1. नमूना टीका
    1. Undiluted नमूने के 100 μl के साथ शुरू, आमतौर पर 10 गुना कमजोर पड़ने श्रृंखला के साथ, 1.1 या 1.2 से नमूने के धारावाहिक dilutions के साथ 2.3.3 से थाली टीका लगाना.
    2. नमूने में सूक्ष्मजीवों संभवतः उपस्थित amoebal लॉन पर तलछट को 10 मिनट के लिए 1800 XG पर microplate अपकेंद्रित्र. इस अमीबा से संपर्क और सूक्ष्मजीवों के phagocytosis बढ़ जाती है.
    3. 25 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए प्लेटें सेते हैं और ताजा पीए के साथ मीडिया की जगह से पीए के साथ तीन बार धोएं. Bacteri के आधार पर (स्ट्रेप्टोमाइसिन, पेनिसिलिन, जेंटामाइसिन और / या vancomycin) के साथ या एंटीबायोटिक दवाओं के अलावा बिना पीए के प्रति अच्छी तरह से 1 मिलीलीटर, जोड़ेंके लिए खोज कर रहे हैं कि अल प्रजातियों.
    4. अमीबा की परिकोष्ठन से बचने के लिए एक humidified वातावरण में 32 डिग्री सेल्सियस पर microplate सेते हैं. अमीबा हमलावर और lysing बैक्टीरिया की उपस्थिति का पता लगाने के लिए एक 20X उद्देश्य से दैनिक अच्छी तरह से प्रत्येक को ध्यान से देखें.
    5. सेल के मामले में, के बारे में 10 5 अमीबा / 2 सेमी की एक monolayer को cocultures के 100 μl inoculating द्वारा ताजा अमीबा पर एक उपसंस्कृति प्रदर्शन करते हैं. विशेष रूप से किसी दिए गए बैक्टीरियल प्रजातियों को अलग करने के लिए, इन बैक्टीरिया (लीजोनेला एसपीपी के लिए यानी BCYE अगर.) के लिए बनाया गया विशेष अगर मीडिया भी टीका लगाना.
    6. सेल के अभाव में, चार से सात दिन पहले टीका के बाद cocultures के 100 μl ले और एक 24 अच्छी तरह से थाली में 900 μl की एक ताजा amoebal संस्कृति टीका लगाना. अमीबा की तेजी सेल बैक्टीरिया के प्रसार के बिना मनाया जाता है, कोई वायरस मौजूद हो सकता है. इस मामले में, 0.22 माइक्रोन से कम सतह पर तैरनेवाला फ़िल्टर और ताजा अमीबा को संक्रमित करने के लिए फ़िल्टर निलंबन का उपयोग करें.

    1.4 बैक्टीरियल अलगाव और लक्षण

    1. बैक्टीरियल धुंधला
      Microplates 24 अच्छी तरह से कांच coverslips पर सीधे cocultures प्रदर्शन करना. मध्यम निकालें और धुंधला हो जाना या immunofluorescence प्रदर्शन करते हैं.
      1. संशोधित Romanowsky धुंधला
        1. Coverslip सूखी हैं. Coverslip लगानेवाला समाधान (2 मिलीग्राम / एल फास्ट ग्रीन मेथनॉल में) में पांच बार विसर्जित कर दिया.
        2. धुंधला समाधान में coverslip पांच बार विसर्जित मैं (1.22 छ / एल Eosine जी फॉस्फेट बफर पीएच 6.6 में)
        3. अंत में, धुंधला समाधान द्वितीय (फॉस्फेट बफर पीएच 6.6 में 1.1 ग्राम / एल thiazine) में coverslip 5 बार विसर्जित कर दिया.
        4. आसुत जल से नमूना कुल्ला. सूखा और माइक्रोस्कोपी द्वारा निरीक्षण करते हैं.
      2. Ziehl-Neelsen धुंधला
        1. Coverslip सूखी हैं. Ziehl fuchsin साथ नमूना कवर. वाष्पकणों प्रकट जब तक एक लौ के साथ डाई गरम करें.
        2. कम से कम 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर कूलऔर आसुत पानी से कुल्ला. 2 मिनट के लिए isopropanol में 3% हाइड्रोक्लोरिक एसिड समाधान के साथ नमूना कवर और आसुत पानी से कुल्ला.
        3. नीले methylene साथ 30 सेकंड के लिए कवर और आसुत पानी से कुल्ला. सूखा और माइक्रोस्कोपी 22 से निरीक्षण करते हैं.
      3. Gimenez धुंधला
        1. 100 10% बुनियादी fuchsin की मिलीलीटर (100 मिलीलीटर 95% इथेनॉल में बुनियादी fuchsin के 10 ग्राम), 250 मिली 4 से% जलीय फिनोल और आसुत पानी की 650 मिलीलीटर के मिश्रण से एक बुनियादी fuchsin शेयर समाधान तैयार करें. उपयोग करने से पहले 48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
        2. Coverslip लौ के माध्यम से इसे पारित करके सूखे और ठीक करने दें. 2 मिनट के लिए (10 मिलीलीटर एम 0.1 के सोडियम फास्फेट बफर, पीएच 7.45 में बुनियादी fuchsin शेयर समाधान के 4 मिलीलीटर) हौसले से फ़िल्टर की बुनियादी fuchsin साथ नमूना कवर.
        3. पानी के साथ नमूना कुल्ला और 10 सेकंड के लिए मैलाकाइट हरे (आसुत जल में 0.8%) में सेते हैं. पानी के साथ फिर से कुल्ला और मैलाकाइट हरी धुंधला दोहराएँ. पानी के साथ फिर से कुल्ला. Coverslip सूखी, एमयह ount, और माइक्रोस्कोपी 23 से निरीक्षण करते हैं.
      4. Immunofluorescence
        1. 10 मिनट के लिए 4% 5 मिनट के लिए या paraformaldehyde के साथ मेथनॉल में incubating द्वारा coverslip ठीक करें.
        2. पीबीएस के साथ तीन बार धोएं और कमरे के तापमान पर (पीबीएस में 0.1% सैपोनिन 5% बीएसए) अवरुद्ध समाधान में 2 घंटे के लिए सेते हैं.
        3. ब्याज की सूक्ष्मजीव के खिलाफ उठाया एंटीबॉडी युक्त अवरुद्ध समाधान में 1 घंटे के लिए coverslip सेते हैं.
        4. पीबीएस में फिर से तीन बार धोएं और प्राथमिक एंटीबॉडी के खिलाफ निर्देशित और एक fluorophore से जुड़ा हुआ एक माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ 1 घंटे के लिए सेते हैं. पीबीएस के साथ तीन बार धोएं, coverslip माउंट और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा निरीक्षण करते हैं.
    2. पीसीआर से डीएनए का पता लगाने
      Amoebal coculture की 100 से 200 μl से डीएनए निकालने. ऐसे माइक्रोबैक्टीरिया 24 के रूप में ब्याज की प्रजातियों के लिए -16 rRNA जीन या विशिष्ट प्राइमरों को लक्षित सार्वभौमिक प्राइमरों के साथ सूक्ष्म जीवाणुओं का पता लगा, लीजोनेला 25 या Chlamydiales 26 के सदस्य हैं.

    2. Amoebal संवर्धन

    2.1. नमूना तैयार

    Vortexing द्वारा पीए में ठोस और अर्द्ध ठोस नमूने Resuspend. 10 मिनट के लिए कम गति (180 XG) पर निलंबन अपकेंद्रित्र. इस गोली में मुक्त रहने वाले अमीबा के संवर्धन की अनुमति देता है. सतह पर तैरनेवाला amoebal coculture और amoebal संवर्धन 21 के लिए गोली के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

    2.2. मध्यम तैयारी

    1. पीए के 100 मिलीलीटर के लिए अगर की 1.5 ग्राम जोड़ें और 121 डिग्री सेल्सियस पर मध्यम 15 मिनट आटोक्लेव पेट्री डिश में गर्म मध्यम डालो और कमरे के तापमान पर जमना.
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात लेग या thioglycolate शोरबा में Escherichia कोलाई (ATCC 25,922) हो जाना पीबीएस के साथ दो बार बैक्टीरिया धोएं और पीए मध्यम में resuspend. पीए में 10x पतला और एक पीए अगर प्लेट पर इस कमजोर पड़ने के 2-3 मिलीलीटर फैला है और सूखी हैं.

    थाली के एक तरफ नमूना की एक बूंद (या फिल्टर का एक टुकड़ा) जोड़ें और यह डिश के केंद्र में एक लाइन फार्म को पेट्री डिश पर प्रवाह करते हैं.

    2.4. Amoebal विकास और amoebal उपसंस्कृति

    1. दैनिक पेट्री डिश को ध्यान से देखें. एक amoebal प्रवास सामने पाया जाता है, माइग्रेशन मोर्चे पर अगर एक छोटा सा टुकड़ा काट और ई. के एक लॉन के साथ कवर एक ताजा NNA पेट्री डिश टीका लगाना कोलाई.
    2. एक दिया amoebal तनाव का एक शुद्ध संस्कृति के क्रम में, नमूना की शुद्धता पर निर्भर करता है reinoculation कई बार दोहराएँ.

    2.5. अमीबा और बैक्टीरिया लक्षण वर्णन

    1. परिमार्जन कोशिकाओं और पीए में resuspend.
    2. डीएनए निकालने और पीसीआर और अनुक्रमण (बैक्टीरिया के लिए -16 rRNA प्रवर्धन, resp. 18S rRNA अमीबा और अनुक्रमण के लिए, उदाहरण के लिए) द्वारा अमीबा और / या बैक्टीरियल endosymbionts की पहचान निर्धारित.
      3. <ली> ताजा अमीबा टीका लगाना और नमूने में संभवतः मौजूद बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए एक amoebal coculture प्रदर्शन करने के लिए पास में इन scraped कोशिकाओं का प्रयोग करें.

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Representative Results

Amoebal coculture और amoebal संवर्धन का उपयोग करना, पर्यावरण और / या रोगजनक बैक्टीरिया की एक पूरी श्रृंखला (1 टेबल) की खोज की थी.

Amoebal coculture नमूने पर्यावरण, जल उपचार संयंत्रों और जल वितरण प्रणाली का विश्लेषण करने के लिए हमारे समूह और अन्य लोगों द्वारा इस्तेमाल किया गया था. सूक्ष्मजीवों का एक व्यापक रेंज है कि इस तकनीक के साथ अलग किया जा सकता है. amoebal coculture द्वारा पृथक सबसे आम बैक्टीरिया जल उपचार संयंत्रों से और पानी नेटवर्क 13,14,24,27,28 से बरामद किया जा सकता है कि माइकोबैक्टीरियम जीनस के सदस्य हैं. लीजोनेला और α-proteobacteria प्रजातियां भी जल उपचार संयंत्रों से अलग किया जा सकता है और अस्पताल पानी नेटवर्क 14,24,28-31 से. कई क्लैमाइडिया से संबंधित प्रजातियां भी उदाहरण एस्ट्रेला lausannensis (आंकड़े 2 बी सी 12,15,32,33 के लिए के रूप में, नदी के पानी और जल उपचार सुविधाओं से अलग थे.

34-36 के रूप में, खोज रहे थे. ये वायरस सभी को संक्रमित और गुणा अमीबा के भीतर और उनके वायरल जीवन शैली के विशिष्ट ग्रहण चरण पेश करने के लिए सक्षम हैं. यह निमोनिया 37 से पीड़ित जो एक प्रयोगशाला तकनीशियन की एक आकस्मिक संक्रमण में फंसा था क्योंकि mimivirus एक हल्के मानव फेफड़े रोगज़नक़ के रूप में माना जाता है. अन्य विशाल वायरस के संभावित pathogenicity अभी भी जांच करने की आवश्यकता है.

Amoebal संवर्धन अक्सर coculture amoebal के समानांतर में इस्तेमाल किया गया था. एक जल उपचार संयंत्र प्रणाली और नीचे की ओर पानी के नेटवर्क की जांच इस प्रकार, जब 25 विभिन्न amoebal उपभेदों 12 नई प्रजातियों से 14 corresponded, जिनमें से खोजा गया है. अमीबा ozonation और क्लोरीनीकरण करने के लिए इन प्रोटिस्ट की एक प्रतिरोध का संकेत है, जल शोधन और वितरण के हर कदम पर मौजूद थे. Intracellular बैक्टीरिया सहuld भी intracellular बैक्टीरिया 14 के संचरण में स्वदेशी अमीबा के महत्व को दिखा रहा है, इन अमीबा में पता लगाया जा. एक अन्य अध्ययन में, अमीबा एक अस्पताल में 24 की जल वितरण प्रणाली से अलग किया जा सकता है. इस अध्ययन में अलग उपभेदों के एक बड़े बहुमत स्वाभाविक रूप से अपेक्षाकृत उच्च तापमान पर जीवित करने में सक्षम है, जो Hartmannella vermiformis के लिए corresponded. ऐसे लीजोनेला pneumophila के रूप में कई बैक्टीरिया, स्वदेशी अमीबा 24 में पता लगाया जा सकता है. एक विशिष्ट अमीबा में पाया बैक्टीरिया का एक और उदाहरण Parachlamydia acantamoebae है. इस क्लैमाइडिया से संबंधित जीवाणु amoebal संवर्धन (2A चित्रा) 9 से महिला स्वयंसेवकों की नाक mucosa से अलग और निमोनिया 38 के एक संभावित एजेंट है. यह फिर से immunocompromis के लिए विशेष रूप से रोगजनक हो सकता है कि बैक्टीरियल रोगज़नक़ों के रखरखाव और फैलाव में अमीबा का महत्व पता चलता है39 रोगियों एड.

चित्रा 1
चित्रा 1. Amoebal coculture और इन दो तकनीकों का महत्वपूर्ण कदम का वर्णन amoebal संवर्धन की रूपरेखा. (40 से अनुकूलित). बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. 1000 एक्स के एक बढ़ाई साथ संक्रमण के बाद संशोधित Romanowsky विधि 24 घंटा, साथ Parachlamydia acanthamoebae हॉल गोलाणु को संक्रमित अमीबा की amoebal coculture और विभिन्न धुंधला तरीकों के साथ अपने प्रेक्षण के द्वारा की खोज बैक्टीरिया के उदाहरण हैं. ए) धुंधला बैक्टीरिया (नीले रंग में दाग रहे हैं एकएस्ट्रेला की rrows). ई.पू.) इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी प्राथमिक निकायों (तीर) के विशिष्ट सितारा आकारिकी दिखा lausannensis.

तालिका 1. Amoebal coculture द्वारा की खोज की अलग अलग वर्गों से बैक्टीरिया के उदाहरण हैं.

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Discussion

Amoebal coculture और amoebal संवर्धन कई नए जीवाणु और amoebal प्रजातियों के अलगाव की अनुमति दी है कि कुशल तरीके हैं. इन तरीकों के साथ प्राप्त परिणामों अमीबा और वातावरण में अमीबा का विरोध बैक्टीरिया दोनों की सर्वव्यापक उपस्थिति की पुष्टि, और सबसे दिलचस्प बात यह है इस तरह के क्लोरीनीकरण और ozonation के रूप में रासायनिक उपचार से नियंत्रित किया जा करने के लिए माना जाता है कि मानव निर्मित पानी के नेटवर्क में. Amoebal coculture और amoebal संवर्धन अलग करने और खेती इन संभावित रोगजनक सूक्ष्मजीवों और फिर आगे उनके जीव विज्ञान और pathogenicity का अध्ययन करने के क्रम में शुद्ध संस्कृति में उपभेदों प्राप्त करने के लिए आवश्यक उपकरण हैं. हाल ही में, इस विधि का विशाल वायरस 41 के उच्च throughput अलगाव के लिए अनुकूलित किया गया था. इसी तरह, amoebal coculture स्वचालित और पर्यावरण के नमूने और इस तरह के पीने के पानी के रूप में मानव निर्मित पानी की व्यवस्था, के सूक्ष्मजीवविज्ञानी गुणवत्ता का परीक्षण करने के लिए एक नियमित तकनीक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.

Amoebal coculture कर सकते हैंअमीबा की विभिन्न प्रजातियों के साथ प्रदर्शन किया. हम आम तौर पर एकैंथअमीबा castellanii या ए का उपयोग करना पसंद वे एक अपेक्षाकृत बड़े मेजबान स्पेक्ट्रम प्रदर्शन के बाद से वे Hartmannella vermiformis से परिकोष्ठन होने का खतरा कम कर रहे हैं और तब से polyphaga. अन्य प्रजातियों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन प्रोटोकॉल और शोरबा अनुकूलित किया जाना चाहिए. यह हाल ही में प्रदर्शित किया गया है कि ए lenticulana (ATCC 30841) ए के रूप में एक ही स्थितियों में इस्तेमाल किया जा सकता है castellanii या ए polyphaga लेकिन संक्रमण के लिए 42 अलग संवेदनशीलता है. परिकोष्ठन रोकने के लिए, यह (30 डिग्री सेल्सियस से नीचे) एक अपेक्षाकृत कम ऊष्मायन तापमान उपयोग करने के लिए और एक humidified वातावरण बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है.

उल्लेखनीय है, amoebal symbionts की निरंतर प्रतिकृति जरूरी amoebal सेल करने के लिए नेतृत्व नहीं करेंगे और विशेष रूप से symbionts की तलाश में, माइक्रोस्कोपी और / या पीसीआर द्वारा स्क्रीनिंग के लिए व्यवस्थित किया जाना चाहिए. Amoebal CE की सेल या टुकड़ी से बचने के लिए LLS कारण बैक्टीरियल अतिवृद्धि को, यह 10 गुना धारावाहिक dilutions उपयोग कर भारी दूषित नमूनों का टीका प्रदर्शन करने के लिए उपयोगी है.

फिर भी, इन तकनीकों सीमाएं हैं. कारण एक ही amoebal प्रजातियों का उपयोग करने के लिए, amoebal coculture जलाशय के रूप में एक और amoebal प्रजातियों का उपयोग करने वाले बैक्टीरिया के अलगाव की अनुमति नहीं हो सकता है. इसके अलावा, इस तरह के विशिष्ट amoebal प्रजातियों ई. पर पैदा करने में असमर्थ हो सकता है कोली लॉन और amoebal संवर्धन से याद किया जा सकता है. जांच बैक्टीरिया या अमीबा के गुणों पर निर्भर करता है, यह अमीबा (Enterobacter doacae और कुछ स्यूडोमोनास उपभेदों अच्छा विकल्प हैं) को खिलाने के लिए अलग मीडिया, विभिन्न amoebal प्रजातियों और विभिन्न प्रजातियों के जीवाणु परीक्षण करने के लिए आवश्यक हो सकता है. Amoebal coculture के लिए इस्तेमाल किया अमीबा या मीडिया के जीवाणु संक्रमण हो सकता है और झूठी सकारात्मक परिणाम दे सकते है. एक नकारात्मक नियंत्रण ऐसी झूठी सकारात्मक परिणाम से बचने के लिए इस प्रकार अनिवार्य है.

सामग्री "> अंत में, amoebal coculture और amoebal संवर्धन मुक्त रहने वाले अमीबा की और अमीबा का विरोध बैक्टीरिया की पारिस्थितिकी और जैव विविधता को निर्दिष्ट करने के लिए दिलचस्प उपकरण प्रतिनिधित्व करने वाले दो पूरक दृष्टिकोण हैं. इन तकनीकों में अमीबा सहित कई नई प्रजातियों की खोज की अनुमति बैक्टीरिया और विशाल वायरस, इन उपन्यास सूक्ष्मजीवों की pathogenicity जांच करने के लिए भविष्य के अध्ययन के लिए आधार बनाने.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

हम जनसंपर्क धन्यवाद. सहायक तकनीकी सलाह और amoebal coculture और amoebal संवर्धन पर रोचक चर्चा के लिए बर्नार्ड ला Scola. हम भी हमारी प्रयोगशाला में तकनीक को लागू करने में उनकी मदद के लिए डॉ. विन्सेंट थॉमस धन्यवाद.

Materials

वर्ग प्रजाति उदाहरण संदर्भ
α-proteobacteria Odyssella thelassonicensis 10
बी proteobacteria Burkholderia cepacia 36
जी proteobacteria लीजोनेला drancourtii 26
Chlamydiae एस्ट्रेला lausannensis 30
Flavobacteriae Amoebophilus asiaticus 37
Actinobacteria माइक्रोबैक्टीरिया एसपीपी. 38
Name Company Catalog Number Comments
Glucose monohydrate Merck, Darmstadt, Germany 108342
0.22 μm pore size membrane Merck Millipore, Darmstadt, Germany SCVPU11RE
proteose peptone Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ 211693
yeast extract Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ 212750
Cell culture flasks Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ 353135
Kova slide Hycor, Indianapolis, IN 87144
cell culture microplates Corning Inc, Corning, NY 3524
Diff-Quik staining kit Siemens Healthcare diagn., Munich, Germany 130832
Ziehl fuchsin Fluka, St-Louis, MI 21820
basic fuchsin Sigma, St-Louis, MI 857843
Phenol Sigma, St-Louis, MI P1037 Corrosive and mutagenic
malachite green oxalate Fluka, St-Louis, MI 63160
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA 15710
Saponin Sigma, St-Louis, MI 84510

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References

  1. Fraser, D. W., et al. Legionnaires' disease: description of an epidemic of pneumonia. New Engl. J. Med. 297, 1189-1197 (1977).
  2. McDade, J. E., et al. Legionnaires' disease: isolation of a bacterium and demonstration of its role in other respiratory disease. New Engl. J. Med. 297, 1197-1203 (1977).
  3. Rowbotham, T. J. Preliminary report on the pathogenicity of Legionella pneumophila for freshwater and soil amoebae. J. Clin. Pathol. 33, 1179-1183 (1980).
  4. Rodriguez-Zaragoza, S. Ecology of free-living amoebae. Crit. Rev. Microbiol. 20, 225-241 (1994).
  5. Booton, G. C., Visvesvara, G. S., Byers, T. J., Kelly, D. J., Fuerst, P. A. Identification and distribution of Acanthamoeba species genotypes associated with nonkeratitis infections. J Clin. Microbiol. 43, 1689-1693 (2005).
  6. Brussow, H. Bacteria between protists and phages: from antipredation strategies to the evolution of pathogenicity. Molecular microbiology. 65, 583-589 (2007).
  7. Greub, G., Raoult, D. Microorganisms resistant to free-living amoebae. Clin. Microbiol. Rev. 17, 413-433 (2004).
  8. Thomas, V., McDonnell, G., Denyer, S. P., Maillard, J. Y. Free-living amoebae and their intracellular pathogenic microorganisms: risks for water quality. FEMS Microbiol Rev. 34, 231-259 (2010).
  9. Birtles, R. J., Rowbotham, T. J., Storey, C., Marrie, T. J., Raoult, D. Chlamydia-like obligate parasite of free-living amoebae. Lancet. 349, 925-926 (1997).
  10. Amann, R., et al. Obligate intracellular bacterial parasites of acanthamoebae related to Chlamydia spp. Appl. Environ. Microbiol. 63, 115-121 (1997).
  11. Birtles, R. J., et al. Candidatus Odyssella thessalonicensis' gen. nov., sp. nov., an obligate intracellular parasite of Acanthamoeba species. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50, 63-72 (2000).
  12. Thomas, V., Casson, N., Greub, G. Criblamydia sequanensis, a new intracellular Chlamydiales isolated from Seine river water using amoebal co-culture. Environ. Microbiol. 8, 2125-2135 (2006).
  13. Pagnier, I., Raoult, D., La Scola, B. Isolation and identification of amoeba-resisting bacteria from water in human environment by using an Acanthamoeba polyphaga co-culture procedure. Environ. Microbiol. 10, 1135-1144 (2008).
  14. Thomas, V., Loret, J. F., Jousset, M., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoebae-resisting bacteria in a drinking water treatment plant. Environ. Microbiol. 10, 2728-2745 (2008).
  15. Corsaro, D., et al. Novel Chlamydiales strains isolated from a water treatment plant. Environ. Microbiol. 11, 188-200 (2009).
  16. Goy, G., Croxatto, A., Greub, G. Waddlia chondrophila enters and multiplies within human macrophages. Microbes Infect. 10, 556-562 (2008).
  17. Kebbi-Beghdadi, C., Cisse, O., Greub, G. Permissivity of Vero cells, human pneumocytes and human endometrial cells to Waddlia chondrophila. Microbes Infect. 13, 566-574 (2011).
  18. Kebbi-Beghdadi, C., Batista, C., Greub, G. Permissivity of fish cell lines to three Chlamydia-related bacteria: Waddlia chondrophila, Estrella lausannensis and Parachlamydia acanthamoebae. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 63, 339-345 (2011).
  19. Fry, N. K., Rowbotham, T. J., Saunders, N. A., Embley, T. M. Direct amplification and sequencing of the 16S ribosomal DNA of an intracellular Legionella species recovered by amoebal enrichment from the sputum of a patient with pneumonia. FEMS Microbiol. Lett. 67, 165-168 (1991).
  20. Rowbotham, T. J. Isolation of Legionella pneumophila serogroup 1 from human feces with use of amebic cocultures. Clin. Infect. Dis. 26, 502-503 (1998).
  21. Greub, G., La Scola, B., Raoult, D. Amoebae-resisting bacteria isolated from human nasal swabs by amoebal coculture. Emerging Infect. Dis. 10, 470-477 (2004).
  22. Isenberg, H. D. Clinical microbiology procedures handbook. , (1992).
  23. Gimenez, D. F. Staining Rickettsiae in Yolk-Sac Cultures. Stain Technol. 39, 135-140 (1964).
  24. Thomas, V., Herrera-Rimann, K., Blanc, D. S., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoeba-resisting bacteria in a hospital water network. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2428-2438 (2006).
  25. Miyamoto, H., et al. Development of a new seminested PCR method for detection of Legionella species and its application to surveillance of legionellae in hospital cooling tower water. Appl. Environ. Microbiol. 63, 2489-2494 (1997).
  26. Lienard, J., et al. Development of a new chlamydiales-specific real-time PCR and its application to respiratory clinical samples. J. Clin. Microbiol. 49, 2637-2642 (2011).
  27. Wang, Y., Ogawa, M., Fukuda, K., Miyamoto, H., Taniguchi, H. Isolation and identification of mycobacteria from soils at an illegal dumping site and landfills in Japan. Microbiol. Immunol. 50, 513-524 (2006).
  28. Corsaro, D., Pages, G. S., Catalan, V., Loret, J. F., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoeba-associated bacteria in water treatment plants. Int. J. Hygiene Environ. Health. 213, 158-166 (2010).
  29. La Scola, B., et al. Legionella drancourtii sp. nov., a strictly intracellular amoebal pathogen. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54, 699-703 (2004).
  30. Thomas, V., Casson, N., Greub, G. New Afipia and Bosea strains isolated from various water sources by amoebal co-culture. Syst. Appl. Microbiol. 30, 572-579 (2007).
  31. La Scola, B., et al. Amoeba-resisting bacteria and ventilator-associated pneumonia. Emerging Infect. Dis. 9, 815-821 (2003).
  32. Collingro, A., et al. Recovery of an environmental Chlamydia strain from activated sludge by co-cultivation with Acanthamoeba sp. Microbiology. 151, 301-309 (2005).
  33. Lienard, J., Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. Estrella lausannensis, a new star in the Chlamydiales order. Microbes Infect. 13, 1232-1241 (2011).
  34. La Scola, B., et al. A giant virus in amoebae. Science. 299, 2033 (2003).
  35. Boyer, M., et al. Giant Marseillevirus highlights the role of amoebae as a melting pot in emergence of chimeric microorganisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 21848-21853 (2009).
  36. Thomas, V., et al. Lausannevirus, a giant amoebal virus encoding histone doublets. Environ. Microbiol. 13, 1454-1466 (2011).
  37. Raoult, D., Renesto, P., Brouqui, P. Laboratory infection of a technician by mimivirus. Ann. Internal Med. 144, 702-703 (2006).
  38. Greub, G. Parachlamydia acanthamoebae, an emerging agent of pneumonia. Clin. Microbiol. Infect. 15, 18-28 (2009).
  39. Lamoth, F., Greub, G. Amoebal pathogens as emerging causal agents of pneumonia. FEMS Microbiol. Rev. 34, 260-280 (2010).
  40. Lienard, J. G. Ch. 6. Environmental microbiology, current technology and water applications. Ashbolt, K., Sen, N. J. , Caister Academic Press. 143-162 (2011).
  41. Boughalmi, M., et al. High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment. Environ. Microbiol. , (2012).
  42. Ovrutsky, A. R., et al. Cooccurrence of Free-Living Amoebae and Nontuberculous Mycobacteria in Hospital Water Networks, and Preferential Growth of Mycobacterium avium in Acanthamoeba lenticulata. Appl. Environ. Microbiol. 79, 3185-3192 (2013).

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Jacquier, N., Aeby, S., Lienard, J., Greub, G. Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches. J. Vis. Exp. (80), e51055, doi:10.3791/51055 (2013).

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