Summary
アメーバ共培養は、選択的アメーバおよびマクロファージなどの食細胞に耐え細胞内病原体を成長させるために接着性アメーバを用いた細胞培養系である。したがって、新たな感染性病原体を発見するための重要なツールを表しています。アメーバ濃縮は、新たアメーバ種とそれらの特異的な細胞内細菌の発見を可能にする。
Abstract
このようなレジオネラ、マイコバクテリアおよびクラミジア様生物などの細胞内病原体は、彼らは多くの場合、全く通常の細菌を培養するために使用されている選択培地上で悪いか成長しないために分離することは困難である。このため、これらの病原体の多くは、ごく最近になって発見されたり、重要な発生を、以下の通りであった。これらの病原体は、しばしば、宿主細胞として機能し、細菌の生存および増殖を可能アメーバ、関連付けられている。アメーバ共培養及びアメーバ濃縮：私たちは、臨床的または環境試料中の細胞内病原体の単離および特徴が存在できるように2つの技術のデモを提供するために、ここにいきたいと考えています。アメーバ共培養は、試料中に存在する細胞内細菌に感染して溶解することができるアメーバの芝生の上に調査したサンプルを接種することにより、細胞内細菌の回収を可能にする。アメーバ濃縮は、臨床的または環境試料中のアメーバの回復が存在できます。目だけでなく、これらのアメーバで特異的に成長している新たな細胞内細菌の新たなアメーバ種の発見につながることができている。一緒に、これら2つの技術がアメーバに増殖することができる新たな細胞内細菌を発見するのに役立ちます。なぜならアメーバ感染し、食作用に抵抗するそれらの能力のために、これらの細胞内細菌はまた、マクロファージによる貪食を逃れる可能性があり、従って、高等真核生物に対して病原性である。
Introduction
分子診断の出現する前に、環境ニッチや臨床サンプル中に存在する微生物は、多くの場合、主にペトリ皿に寒天上に、別の選択培地上で培養することによって検出された。細菌コロニーとその代謝活性の表現型は、その後、種レベルで細菌の分類を可能にした。ブロスはまた、検出の感度を増加させるために使用されてもよい。しかし、両方の技術は、これらすべてのメディアにゆっくりか成長した細菌の回復を認めていない。これは、分子のアプローチは非常に広く、最近使用されている理由です。それにもかかわらず、DNAの検出は、細菌の生存には何の手掛かりを提供しません。また、逆に文化に、分子のアプローチをさらに特徴づけることができるひずみを生じない。
成長する固体培地またはその必要性細胞にあまり増殖する病原体を研究することは複雑である。これらの「成長させることは困難」細菌のほとんどは気難しいINTRです無細胞、細菌、頻繁に発見され、それがレジオネラ·ニューモフィラの場合と同様に大規模な流行、以下を特徴とする。この細菌は米国在郷軍人会の大会中に発生した発生後特徴付けられた。できるだけ多く182のような人が感染していたと29は、重症肺炎の1,2に死亡した。それは後にアメーバがこの細菌の自然宿主であることを示したし、そのホテルの空調システムにおけるプレゼンスと水ネットワークは、いわゆるレジオネラ病3の発生の原点にあったことだった。
アメーバは、世界中に存在し、土壌、大気、水、（4に概説されている）ヒトのボランティアの鼻粘膜から単離した。これらの「自由生活」アメーバは一般的な環境で自律的に分裂しているが、時折許容宿主5に侵入することがあります。 HYによる食作用およびその後のリソソーム消化を通して様々な微生物にアメーバフィードdrolases 6。多くの通性または偏性細胞内細菌は、消化に抵抗し、このように感染し、例レジオネラ 、 クラミジアに関連した細菌やマイコバクテリアに関してはアメーバに分ける（7に見直され、8）することができます。自由生活アメーバは、おそらくまだ発見されていない細胞内細菌のための重要な潜在的な貯水池を表しています。これはローザンヌに異なるグループは、様々な環境試料9月15日から、いくつかの新しい偏性細胞内微生物を分離するために許可されたアメーバの共培養及びアメーバ濃縮と呼ばれる二つの主要な技術を実装するために私たちのグループを主導した。
アメーバは細菌に放牧専門の食細胞であることから、食作用に抵抗し、これらの原生生物の内部で増殖することができる細菌は、人間の食細胞にコロニーを形成し、人間に向けた病原性かもしれません。これは、部分的なWaddlia町などの一部クラミジア関連細菌のために証明されたndrophila。 W·chondrophilaはアメーバではなく、哺乳動物の上皮細胞、マクロファージ、および魚類細胞株16〜18のようないくつかの細胞型だけでなく成長することができます。アメーバ共培養も大きく異なる細菌種21で汚染されているスツールを含む臨床サンプル19,20、細胞内細菌を検出するための関連が表示されます。
無菌メディアにアメーバの（b）の成長と大腸菌の細菌ローン上および（C）の選択および特性、ここで我々は、環境や臨床サンプルの（a）の治療を含む、アメーバの共培養及びアメーバ濃縮の主な手順を説明します細胞内細菌の。
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Protocol
1。アメーバの共培養
1.1サンプル調製
- 環境試料
- 水サンプル
0.22μmの孔サイズの膜を通して水サンプル（1 L 500 ml）を絞り込む。そして、ページのアメーバ生理食塩水媒体中のPASのNaCl（120ミリグラム、 硫酸マグネシウム4mgの•7H 2 O、塩化カルシウム2•2H 2 Oの4ミリグラムのNa 2 HPO 4の142ミリグラム、およびKHの136ミリグラムで膜を振る蒸留水1 L 2 PO 4）。 - 固体サンプル
蒸留水またはPBS中の活性汚泥などの土壌や砂のサンプルおよび半固体のサンプルのような固体試料を再懸濁し、0.22μmの孔サイズの膜を介してそれらをフィルタリング。その後、PASで膜を振る。 - 高度内因性アメーバ原虫で汚染サンプル
第一の低速遠心分離（180×g）でのfoによってサンプルを沈降rは10分以上5μmの孔サイズの膜を介して濾過する。さらに1.1.1のように、上清（それぞれろ液）を処理する。
注：他の汚染除去技術は、さらに環境サンプルを除染するために使用され得る：30分間50℃で試料を加熱または酸性もしくは塩基性溶液で処理する14。
- 水サンプル
- 臨床サンプル
それらの物理化学的特性に応じて、臨床サンプルを処理する。大規模な不純物を除去するフィルタまたは遠心分離機の液体。固体試料を懸濁します。 、組織を用いるダウンスhomogeneiserまたはガラスビーズを用いて、例えば、それらを粉砕し、細胞内細菌を解放するために細胞を溶解すること。
1.2アメーバ準備
- スープの準備
、プロテオースペプトン、100gの、酵母エキス10g、MgSO 4で •7H 2 4.9gのペプトン、酵母エキスおよびグルコース（PYGを含有するリッチ培地：次のメディアを調製O、クエン酸ナトリウム5gの•2H 2 O、Feの（NH 4）0.1gの2（SO 4）2•6H 2 O、KH 2 PO 4、のNa 2 HPO 4 1.97gの1.7gの•7H 2 Oグルコース45gを、蒸留水5中のLのCaCl 2 0.295 g）および、例えばアカントアメーバ種についてPAS等の非栄養培地。 - アメーバ文化
- PYG培地30mlを含む細胞培養フラスコ中で25℃で、アメーバ（優先アメーバカステラーニ ATCC 30010またはA.多食亜目のLinc-AP1）を栽培しています。
- フラスコを激しく振盪によりアメーバを収穫し、1,500 X gで10分間、細胞懸濁液を遠心分離。 PAS培地で2回ペレットを洗浄。 KOVAスライドに細胞を計数し、ミリリットル当たり5×10 5細胞の懸濁液を得るために音量を調整する。
- マイクロプレートにアメーバサスペンションを転送します。 12ウェル当たり1ミリリットルを使用する - と24-Wエルプレート、48ウェルプレートおよび96ウェルプレートを300μlの500μlの。 25℃で少なくとも2時間、マイクロプレートをインキュベートこれは、各ウェルの底にアメーバの沈降と添付が可能になります。
1.3共培養
- サンプル接種
- 希釈していない試料100μlを皮切りに、通常の10倍希釈系列で、1.1または1.2からのサンプルの段階希釈を2.3.3からプレートに接種。
- サンプル中の微生物が存在する可能性アメーバ芝生の上の堆積物に10分間1800×gでマイクロプレートを遠心分離する。これはアメーバによる接触や微生物の食作用を増大させる。
- 25°Cで45分間プレートをインキュベートし、新鮮なPASでメディアを置換することによりPASで三回洗浄する。または抗生物質を添加せずにPASのウェルあたり1ミリリットルを追加します（ストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシンおよび/またはバンコマイシン）、バクテリオに応じて検索される他種。
- アメーバのシストを避けるために、加湿雰囲気中で32℃でマイクロプレートをインキュベートする。アメーバに侵入し、溶解する細菌の存在を検出するために、20倍の対物レンズで毎日各ウェルを観察します。
- 溶解の場合は、約10 5アメーバ/ cm 2の単層に共培養液100μlを接種することによって、新鮮なアメーバにサブカルチャーを実行します。特に指定された細菌種を単離するために、これらの細菌（ レジオネラ属菌のためのすなわち BCYE寒天。）用に設計された特定の寒天培地にも接種する。
- 溶解がない場合には、四から七日最初の接種後の共培養液100μlを取り、24穴プレートに900μLの新鮮アメーバ文化を接種する。アメーバの急速な溶解が細菌の増殖せずに観察された場合、ウイルスが存在する可能性があります。この場合は、0.22ミクロンで、上清をフィルター処理し、新鮮なアメーバに感染するために濾過サスペンションを使用しています。
1.4細菌の単離と特性評価
- 細菌の染色
マイクロプレート24ウェルにカバーガラス上に直接共培養を行う。培地を除去し、染色または免疫蛍光を行う。- 修正されたロマノフスキー染色
- カバーガラスを乾燥させる。カバーガラスを固定液（2 mg / Lのファストグリーンメタノール中）で5回浸す。
- 染色溶液中でカバースリップを5回浸すI（リン酸緩衝液pH 6.6で1.22グラム/ LエオシンG）
- 最後に、染色溶液II（リン酸緩衝液pH 6.6中1.1グラム/ Lのチアジン）でカバースリップを5回浸す。
- 蒸留水でサンプルを洗浄します。乾燥させ、および顕微鏡によって観察する。
- チールネルゼン染色
- カバーガラスを乾燥させる。チールフクシンでサンプルをカバーしています。蒸気が表示されるまで炎で色素を加熱します。
- 少なくとも5分間、室温でクール蒸留水ですすいでください。 2分間のイソプロパノール中、3％の塩酸溶液でサンプルをカバーし、蒸留水ですすいでください。
- メチレンブルーで30秒間カバーし、蒸留水ですすいでください。乾燥させ、および顕微鏡22で観察します。
- ヒメネス染色
- 10％塩基性フクシン（100ミリリットルの95％エタノール中で塩基性フクシンの10g）を100mlの4％水性フェノール及び蒸留水650mlを250mlのを混合することによって塩基性フクシンのストック溶液を調製する。使用前に48時間、37℃でインキュベートする。
- カバーガラスを乾燥させ、炎を通過させることにより固定する。新たに濾過塩基性フクシン2分間（0.1ml、10mlのMリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.45で塩基性フクシンストック溶液4ml）でサンプルを覆う。
- 水でサンプルをすすぎ、10秒間マラカイトグリーン（蒸留水中0.8％）でインキュベートする。水で再び洗浄し、マラカイトグリーンの染色を繰り返します。再び水ですすいでください。カバーガラスを乾燥させ、Mそれをountし、顕微鏡23で観察します。
- 免疫蛍光
- 10分間、4％メタノール中で5分間インキュベートすることにより、またはパラホルムアルデヒドでカバーガラスを固定します。
- PBSで3回洗浄し、室温で溶液（5％BSA、PBS中0.1％サポニン）をブロックの中で2時間インキュベートする。
- 興味のある微生物に対して産生された抗体を含むブロッキング溶液中で1時間カバースリップをインキュベートする。
- PBS中で再び3回洗浄し、一次抗体に対する蛍光団にリンクされた二次抗体で1時間インキュベート。 PBSで3回洗浄、カバースリップをマウントし、蛍光顕微鏡で観察します。
- 修正されたロマノフスキー染色
- PCRによるDNA検出
アメーバ共培養の100〜200μLからDNAを抽出します。例えば、マイコバクテリア24種のような目的のために、16S rRNA遺伝子または特異的なプライマーを標的ユニバーサルプライマーを用いて微生物を検出する、レジオネラ25またはクラミジア 26のメンバー。
2。アメーバ濃縮
2.1。試料調製
ボルテックスにより、PAS中の固体や半固体試料を懸濁します。 10分間低速（180×g）で懸濁物を遠心分離する。これは、ペレットに自由生活アメーバの濃縮を可能にする。上清をアメーバ共培養し、アメーバ濃縮21用のペレットに使用することができます。
2.2。培地調製
- PASの100ミリリットルに寒天を1.5グラムを加え、121℃で培地15分オートクレーブペトリ皿に温培地を注ぎ、室温で固化してみましょう。
- 37℃で一晩、LBまたはチオグリコール酸ブロス中の大腸菌 （ATCC 25922）を育てるPBSで2回細菌を洗浄し、PAS培地で再懸濁します。 PASで10倍に希釈し、PAS寒天プレート上でこの希釈2-3ミリリットル広げて乾燥させます。
板の片面に試料の滴（又はフィルタの個数）を追加し、皿の中央に線を形成するペトリ皿上を流れてみましょう。
2.4。アメーバ成長とアメーバサブカルチャー
- 毎日のペトリ皿を観察します。アメーバ移行フロントが検出された場合、移行前に寒天の小片を切り出し、Eの芝生で覆われ、新鮮なNNAペトリ皿に接種大腸菌 。
- 所与アメーバ株の純粋培養物を得るために、試料の純度に応じて再接種を複数回繰り返す。
2.5。アメーバや細菌特性評価
- 細胞をこすり落とし、PASで再懸濁します。
- （例えば、アメーバおよび配列決定のために細菌の16SrRNA増幅、RESP。18S rRNAの）DNAを抽出し、PCRおよび配列決定によりアメーバおよび/または細菌内部共生の同一性を決定する。 <李は>新鮮アメーバに接種し、試料中に存在する可能性細菌を検出するためにアメーバの共培養を行うために、PASでこれらの掻きセルを使用。
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Representative Results
アメーバ共培養及びアメーバ濃縮を使用して、環境、および/ または病原性細菌の全範囲（ 表1）に発見された。
アメーバ共培養は、環境試料、水処理プラント、水分配システムを分析するために我々のグループ等で使用されていた。広範囲の微生物は、この技術を用いて単離することができた。アメーバ共培養により単離し、最も一般的な細菌は、水処理プラントからの水のネットワーク13,14,24,27,28から回収することができたマイコバクテリア属のメンバーである。 レジオネラ及びα-プロテオバクテリア種は、水処理プラントから単離することができるそして病院の水網14,24,28-31から。いくつかのクラミジア関連の種はまた、例えばエストレージlausannensis（ 図2B-C 12,15,32,33については、河川水と水処理施設から単離した。
34〜36のように、発見された。これらのウイルスは、すべての感染し、アメーバ内で増殖し、そのウイルスのライフスタイルの典型的な日食の位相を提示することができます。それは肺炎37苦しん検査技師の偶発的な感染に関与して以来ミミウイルスは穏やかなヒト肺病原体として考えられている。他の巨大なウイルスの潜在的な病原性はまだ調査される必要がある。
アメーバ濃縮は、しばしば共存アメーバを並列に使用した。従って、水処理プラントシステムと下流の水のネットワークを調査する場合、25個の異なるアメーバ株が検出されて、12が新種14に相当したが。アメーバはオゾンや塩素化へのこれらの原生生物の抵抗を示し、水の浄化、流通の各段階で存在した。細胞内細菌の共同自民も細胞内細菌14の伝達に先住民アメーバの重要性を示す、これらのアメーバで検出すること。別の研究では、アメーバは、病院24の配水系から単離することができた。この研究において単離された株の大多数は、天然に比較的高温で生存することができるHartmannella虫垂 、に相当した。このようなレジオネラ·ニューモフィラなど、いくつかの細菌は、先住民族のアメーバ24で検出することができた。特定のアメーバで見つかった細菌の別の例はParachlamydiaのacantamoebaeです。このクラミジアに関連する細菌は、アメーバ濃縮（ 図2A）9による女性のボランティアの鼻粘膜から単離され、肺炎38の潜在的な薬剤であるた。これもまたimmunocompromisに特に病原性である可能性があり、細菌の病原体のメンテナンスや分散液中のアメーバの重要性を示しています患者39エド 。
図1。アメーバ共培養し、これら2つの技術の重要なステップを記述したアメーバ濃縮の概要。（40より）。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。
図2。アメーバ共培養し、様々な染色法との観測によって発見された細菌の例。千Xの倍率での感染後に変更ロマノフスキー法24時間でParachlamydia acanthamoebaの複数形ホールの球菌感染するアメーバのA）の染色、細菌は（ブルーAで染色されるエストレージャのrrows）。BC）電子顕微鏡基本小体（矢印）の代表的なスターの形態を示すlausannensis。
| クラス | 種の例 | リファレンス | |
| α-プロテオバクテリア | Odyssella thelassonicensis | 10 | |
| B-プロテオバクテリア | バークホルデリア·セパシア | 36 | |
| G-プロテオバクテリア | レジオネラdrancourtii | 26 | |
| クラミジア | エストレージャlausannensis | 30 | |
| Flavobacteriae | Amoebophilus asiaticus | 37 | |
| 放線 | マイコバクテリア属。 | 38 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glucose monohydrate | Merck, Darmstadt, Germany | 108342 | |
| 0.22 μm pore size membrane | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | SCVPU11RE | |
| proteose peptone | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 211693 | |
| yeast extract | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 212750 | |
| Cell culture flasks | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 353135 | |
| Kova slide | Hycor, Indianapolis, IN | 87144 | |
| cell culture microplates | Corning Inc, Corning, NY | 3524 | |
| Diff-Quik staining kit | Siemens Healthcare diagn., Munich, Germany | 130832 | |
| Ziehl fuchsin | Fluka, St-Louis, MI | 21820 | |
| basic fuchsin | Sigma, St-Louis, MI | 857843 | |
| Phenol | Sigma, St-Louis, MI | P1037 | Corrosive and mutagenic |
| malachite green oxalate | Fluka, St-Louis, MI | 63160 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | 15710 | |
| Saponin | Sigma, St-Louis, MI | 84510 |
References
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免疫学、発行80、環境微生物学、土壌微生物学、微生物学、水、アメーバ、微生物、共培養、細胞内細菌を義務づける View Video
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