Summary
Este protocolo descreve o uso de braços de suporte de silicone em micro-como as superfícies de cultura maleáveis para a medição da contractilidade de células do músculo in vitro. Contração celular provoca flexão cantilever, que pode ser medido, registrado, e convertido em leituras de força, proporcionando um sistema não invasivo e escalável para medir a função contrátil in vitro.
Abstract
O desenvolvimento de ensaios in vitro preditivos e mais biologicamente relevantes baseia-se o avanço dos sistemas de cultura de células versáteis que facilitam a avaliação funcional das células semeadas. Para esse efeito, a tecnologia cantilever microescala oferece uma plataforma com a qual a medir a funcionalidade contráctil de uma gama de tipos de células, incluindo esquelético, cardíaco e células de músculo liso, através da avaliação da contracção induzida substrato flexão. Aplicação de matrizes cantilever multiplexados fornece os meios para o desenvolvimento moderado a protocolos de alto rendimento para a avaliação da eficácia do fármaco e toxicidade, o fenótipo da doença e progressão, assim como neuromusculares e outras interacções célula-célula. Este manuscrito apresenta pormenores para a fabricação de matrizes de cantiléver fiáveis para este fim, e os métodos necessários para células em cultura com sucesso sobre estas superfícies. Descrição mais detalhada é fornecida sobre as medidas necessárias para realizar anal funcionalysis de tipos de células contrátil mantida em tais matrizes, utilizando um novo sistema de laser e foto-detector. Os dados representativos fornecidos destaca a precisão e a natureza reprodutível da análise da função contráctil possível usar este sistema, bem como a grande variedade de estudos para que tal tecnologia pode ser aplicada. Ampla adoção bem sucedida deste sistema poderia fornecer aos investigadores os meios para realizar estudos de baixo custo rápidas e funcionais in vitro, levando a previsões mais precisas do desempenho do tecido, o desenvolvimento da doença ea resposta ao tratamento terapêutico romance.
Protocol
1. Cantilever Chip Fabrication
Pormenores ilustrados das etapas de fabricação descritos são proporcionados na Figura 1.
- Coloque wafers de silício sobre isolante (SOI) em um forno e leve ao forno a 125 ° C por 20 min para desidratar-los.
- Deposite um 1,5 um espessa camada de óxido de silício na camada alça do wafer SOI desidratado usando um Plasma avançado Chemical Vapor Deposition (PECVD) ferramenta.
- Coloque a bolacha sobre a rotação do mandril com a camada de revestimento do dispositivo virada para cima. Certifique-se de bolacha é centrado, dispensar 2 ml de P20 iniciador no centro da bolacha, e centrifugação a 3000 rpm durante 60 segundos a uma aceleração de 1000 rpm / seg. P20 primário promove a aderência de material fotosensitivo que a camada do dispositivo.
- Enquanto a bolacha ainda está no revestidor mandril rotação, dispensar 2 ml de S1818 fotorresistente no centro da bolacha, e centrifugação a 3000 rpm durante 60 segundos a uma aceleração de 1000 rpm / seg para obtain uma camada de 1,5 um de espessura de material fotosensitivo.
- Coloque a bolacha sobre uma placa quente e realizar um cozimento suave a 115 ° C durante 1 min.
- Realizar uma exposição UV contato duro usando um contato fotolitografia máscara alinhador, a fim de transferir o padrão da máscara cantilever para o fotorresiste sobre a camada de dispositivo. Calcule o tempo de exposição com base no valor da energia de exposição de 125 mJ / cm 2 para S1818 photoresist.
- Desenvolver o photoresist imergindo o wafer em um 726 MIF desenvolvedor photoresist para 1 min, agitando suavemente o wafer e para trás.
- Lavar a bolacha com (DI) de água ionizada-de e secá-lo, de preferência, usando um secador de rotação da ferramenta de enxaguamento (SRD).
- Remover o material fotoresistivo a partir da borda da pastilha (até 5 mm a partir da extremidade), utilizando um cotonete de algodão embebido em acetona.
- Coloque o wafer em uma ferramenta profunda Reactive Ion Etch (DRIE), com o lado da photoresist voltada para cima, e executar uma receita para gravar a camada de silício modelada através do devicamada ce. As funções da camada de óxido enterrado como uma parada de etch, por isso, realizar uma etch com 50% a 100% mais ciclos do que se espera que seja necessário para garantir a corrosão completa.
- Coloque a bolacha em uma solução de banho photoresist quente por 20 minutos para retirar o fotorresiste. Transfira a bolacha para uma quick-dump-enxaguadora (QDR) para lavar o wafer com água DI. Após a tira photoresist, coloque o wafer em uma ferramenta SRD para lavar e secar o wafer. Inspecione o wafer sob um microscópio para garantir o padrão cantilever aparece como esperado.
- Deposite um 1 mícron espessa camada de óxido de silício dopado com un na camada do wafer usando uma ferramenta de PECVD dispositivo. Funções desta camada de óxido como uma camada protetora para as consolas durante mais etapas de processamento.
- Coloque a bolacha sobre a rotação do mandril com o revestimento de camada punho virada para cima para iniciar o processamento do lado posterior do disco. Certifique-se de bolacha é centrado, dispensar 2 ml de P20 iniciador no centro da bolacha, e centrifugação a 3000 rpmpor 60 segundos a uma aceleração de 1000 rpm / seg.
- Enquanto a bolacha ainda está no revestidor mandril rotação, dispensar 2 ml de SPR220-4.5 fotorresistência sobre o centro da pastilha, e centrifugação a 2000 rpm durante 45 segundos a uma aceleração de 1000 rpm / seg para se obter um 6,5 uM camada espessa de photoresist.
- Coloque a bolacha em uma placa quente para efectuar uma aproximação suave cozer a 115 ° C durante 2 min.
- Usando um fotolitografia contato alinhador capazes de frente / trás alinhamento, alinhar a máscara de janela traseira para o padrão cantilever frente e realizar uma exposição UV contato duro para transferir o padrão da máscara de janela traseira do fotorresiste sobre a camada de alça. Use um tempo de exposição calculado com base no valor da energia de exposição de 480 mJ / cm 2 para SPR220-4.5 photoresist.
- Após a exposição à radiação UV, deixar as bolachas permanecer numa área escura durante 30 minutos antes do próximo passo de processamento.
- Desenvolver o fotorresistente por imersão a bolacha emum desenvolvedor 726 MIF photoresist por 2 min, agitando suavemente o wafer e para trás.
- Lavar a bolacha com (DI) de água ionizada-de e secá-lo, de preferência, usando um secador de rotação da ferramenta de enxaguamento (SRD).
- Coloque as bolachas em uma estufa a 90 ° C durante 12 hr.
- Etch a camada de óxido de silício sobre a parte traseira da bolacha usando um sistema de RIE com gases fluorados e uma receita para gravar óxido. O óxido modelado na parte traseira da pastilha actua como uma máscara de corrosão para o tratamento posterior. Inspeccionar as bolachas sob um microscópio para assegurar que o óxido de silício na janela é exposta completamente gravado.
- Remover o material fotoresistivo sobre a borda da pastilha (até 5 mm a partir da extremidade), utilizando um cotonete de sala limpo embebido em acetona.
- Coloque a bolacha numa ferramenta com DRIE e executar uma receita para gravar a camada de alça modelada a uma profundidade de 500 mm com o funcionamento enterrado camada de óxido como um batente de corrosão. Dividir este etch em várias execuções para evitar um aquecimento excessivo dabolacha, que provoca corrosão inconsistente do silício. Esta etapa etch remove completamente o silício por baixo das consolas.
- Executar um passo de ataque químico húmido utilizando 25% de produto corrosivo HF diluído, para retirar a camada de óxido enterrado abaixo dos braços de suporte e a camada de óxido de protecção na parte superior dos braços de suporte.
NOTA: Este passo liberta a superfície de fundo dos braços de suporte de silício e também abre uma janela de baixo para fornecer um acesso para sondar o cantilever com o laser. - Lavar a bolacha usando uma série de banhos de água DI e cuidadosamente seca com azoto. Uma vez que os cantilevers são suportados apenas em suas bases, não use sprays fortes de água DI ou gás inerte directamente nas consolas.
- Clivar as fichas individuais a partir da bolacha com as linhas clivam produzidos durante o passo de pega camada de corrosão.
Cultura 2. celular
- Prepare 13F lamelas de acordo com métodos previamente publicados 17.
NOTA: Se 13F enseadarslips não estão disponíveis, qualquer superfície hidrofóbica com um ângulo de contacto acima de 95 ° pode ser usado. - Esterilizar fichas cantilever e 13F lamelas numa solução de etanol a 70% e deixar secar ao ar numa câmara de fluxo.
- Coloque fichas cantilever individuais no alto de 13F lamelas dentro de um padrão de 12 poços.
- Revestir as consolas com o biopolímero ou modificação superficial optimizada para o tipo de célula a ser utilizado de acordo com os protocolos de cultura de células padrão.
- Re-suspender as células no seu meio de crescimento específica para a concentração desejada.
NOTA: Este protocolo resulta em um grande número de células que caem através da janela do cantilever e que não aderem à superfície cantilever desejado. Preparações de células deve, portanto, ser feita 3-4x mais concentrado do que para os preparativos lamela normal. Por exemplo, a sementeira de células satélites do músculo esquelético de rato é tipicamente levada a cabo usando uma densidade de sementeira de aproximadamente 500 a 700 células / mm quadrado 15,16, E são utilizados com substratos cantilever a 2.000 células / mm quadrado. Experiências de optimização deve ser levada a cabo com as novas fontes de células para determinar uma densidade de sementeira apropriada. - Pipete 200 pi da suspensão de células sobre a superfície do chip de cantilever, garantindo a bolha de forma cobre as janelas totalmente cantilever. Se o meio de mechas através da janela e não forma uma bolha estática na parte superior dos braços de suporte substituir a lamela 13F e Reattempt o chapeamento.
- Transferir a placa contendo as fichas para uma incubadora e permitir que as células a aderir durante pelo menos 1 hora (preferencialmente 2-3 h).
- Após este período de chapeamento, utilizar uma pinça estéril para transferir o chip a um bem limpo, sem uma lamela 13F, e superior a cultura com 1 ml de meio de crescimento.
- Retorne a placa para a incubadora.
- Manter as células de acordo com o seu protocolo padrão para a manutenção in vitro em lamelas. Para as células de músculo esquelético,um interruptor de composição do meio que induz a formação de miotubo uma vez as células se tornavam confluentes será necessário.
3 Configuração de Hardware e Software de Análise cantilever deflexão
- Coloque um prato de cultura para a fase de aquecimento de um microscópio vertical electrofisiologia.
- Adicionar 3 ml do meio de alimentação das células encontra-se suspensa em (+ HEPES 10 mM) para a fase de microscópio aquecida.
- Montar os eléctrodos de aço inoxidável sobre o interior da placa de cultura aquecido a uma distância de 15 mm, e ligá-los a um gerador de impulsos, capaz de produzir impulsos de estimulação do campo de intensidade variável, da frequência e da forma de onda, para permitir que o sistema para produzir estimulação do campo de células, quando apropriado.
- Parafuso de um laser de hélio-néon, montado em fases de translação XY, para o lado de baixo da mesa de microscópio e ajustá-lo de modo que o feixe de laser é dirigida através da base do prato de cultura aquecido a um ângulo de 30 ° relativE para o plano do cantilever.
- Tranque um módulo fotodetector quadrante, montado em estágios de translação XY, ao lado de baixo do palco microscópio e ajustar a posição para que as terras de feixe de laser refletido no centro dos quatro quadrantes. Figura 2 apresenta uma visão geral da configuração do hardware necessário para a implementação do protocolo descrito.
- Escreva um programa de software para controlar os atuadores lineares que fazem a varredura através das consolas. Escrever o programa de software, com referência ao diagrama de fluxo representado na Figura 3. A interface gráfica programado para utilização com este sistema é fornecida na Figura 4.
4 Gravação cantilever deflexão de dados
- Ligue o hardware e software de análise cantilever associado.
- Insira o termistor fase aquecida para o meio e esperar por ele para ler 37 ° C.
- Insira o chip cantilever no palco com a cantilevers voltadas para o lado direito do palco.
- Ligue a fonte de luz do microscópio.
- Concentre o microscópio para trazer as extremidades dos braços de suporte em vista e usar o software de controlo do laser / foto-detector para posicionar o feixe de laser na extremidade do braço de suporte 1 NOTA: Assumindo que os braços de suporte estão orientadas para a direita do palco, um cantilever é aquele posicionado no canto superior esquerdo da matriz e os números de correr para 16 no canto inferior esquerdo. Cantilever 17 está na posição superior direito e é executado a 32 na parte inferior direita (Figura 5A).
- Pressione o botão "Play" no software de gravação.
- Posicione a foto-detector para que o sinal lê "0" em ambos x e y quadros, ajustando os motores de passo que controlam o fotodetector.
- Jogo 1 em cantilever posição no software de controlo do laser / fotodetector (Figura 4).
- Mova o laser até a ponta do cantilever 16, repita o passo 4.7., E definir cantilever 16 posição no software de controle do laser / foto-detector.
- Mova o laser até a ponta do cantilever 32, repita o passo 4.7., E definir cantilever 32 posição no software de controle do laser / foto-detector.
- Mova o laser até a ponta do cantilever 17, repita o passo 4.7., E definir cantilever 17 posição no software de controle do laser / foto-detector.
- Desligue a fonte de luz do microscópio e a luz do teto no laboratório.
- Pressione o botão "record" no software de gravação.
- Defina o hardware gerador de pulso de 40 ms, 5 V pulsos com uma frequência de 1 Hz, e ligar a máquina.
NOTA: Opcionalmente, empregam protocolos de estimulação otimizadas para fontes de células específicas, neste ponto, as definições indicados são orientações baseadas em dados coletados através de fontes humanas e células de roedores 12,13,15,16. - Usando o software de controle do laser / fotodetector, definir o hardware para fazer a varredura em toda a matriz de 32 cantilever, parando por 5 segundos a cada um eme.
- Quando a digitalização dos 32 consolas está completa, desligue o estimulador, em seguida, parar o software de gravação e abrir o arquivo de dados.
- Examine o rastreamento gravado a partir de cada cantilever para a evidência de atividade contrátil. Tome nota de cada cantilever com respostas positivas. A contracção é definido como um pico se a deformação é, pelo menos, 0,1 V, acima da linha de base.
- Remova todos os cantilevers não-responsivos a partir do protocolo de digitalização no software de controle do laser / foto-detector.
- As consolas activas podem então ser varrida novamente, sem estimulação, a fim de obter uma leitura da actividade contráctil espontânea da célula.
- Varreduras executado com ou sem campo amplo estimulação eléctrica, a seguir à adição de um composto terapêutico para o meio, a fim de observar o seu efeito sobre a saída funcional das células cultivadas.
- Realizar avaliação de fadiga ao estimular eletricamente as células por longos períodos e níveis de análise de contr actility para medir quanto tempo leva para o pico de força para cair abaixo de um limite específico.
- Em experimentos onde os neurônios motores são mantidos em co-cultura com o músculo, medir a formação junção neuromuscular através de um tratamento de motoneuron-miotubo cantilever co-culturas com um estimulante neuronal (como o glutamato) ou inibidor sináptico (por exemplo, D-tubocurarina) e digitalização para aumentos e reduções na atividade espontânea, respectivamente 16.
- Realizar exames específicos como ditado pelas necessidades dos experimentos planejados.
5 Análise de Dados cantilever deflexão
- Utilização modificado equações de Stoney 15 (descrito abaixo) para converter os dados da linha suspensa em bruto de deflexão (em volts) em um visor de tensão na camada de células ou miotubos (em Pascal), e uma medição directa da força contráctil celular (em nano-Newtons):
ad / 51866 / 51866eq1.jpg "/> Equação 1
Equação 2 - Onde δ = cantilever ponta tensões de deflexão e produzido pela miotubo, σ c = tensão produzida pelo miotubo, assumindo um filme de espessura uniforme a toda a largura do braço de suporte, C = o coeficiente de detector específico do sistema de tensão relativa à posição do laser sobre a foto -detector, θ = o ângulo do laser e do detector em relação ao plano do cantilever, Si = E o módulo de elasticidade de silício, Si = t a espessura do braço de suporte, t f = espessura miotubo, v = proporção de Si de veneno silício, L = comprimento do cantilever, comprimento P = caminho do laser de ponta cantilever ao detector, e w
- Assumindo que o miotubo é um filme uniforme, a força no miotubo é igual à força no filme, levando a Equação 3, igualando o cálculo da força de tensão e área de secção do cruzamento célula assumiu que foi utilizado para a aplicação de Stoney de equação.
Equação 3 - Após a coleta de dados funcionais, corrigir fichas cantilever para análise imunocitoquímica ou utilizar células de proteína ou DNA análise usando técnicas convencionais.
- Opcionalmente, as células voltem para a incubadora, em vez de se preparar para a análise molecular, a fim de reavaliar o desempenho funcional em um momento posterior de ponto.
Equação 2 Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cultura bem sucedida de células contrácteis em cantiléver é um procedimento relativamente simples, utilizando técnicas padrão de cultura de células (Figura 5). A percentagem de consolas de apoio células contratantes irá variar dependendo do tipo de célula que está sendo examinado e técnica de cultura específica empregada. Usando células embrionárias primárias derivadas de rato membros posteriores, actividade contráctil foi detectada em 12% das consolas analisados (n = 4). Análise da função contrátil usando o sistema de laser e fotodetector descrito fornece dados em tempo real precisos relativos à maturidade funcional das células semeadas. O uso de software electrofisiológico padrão pode então ser usado para analisar os dados em bruto, facilitando o cálculo das propriedades funcionais relevantes, tais como a força de pico, tempo para o pico de força e de tempo para metade relaxamento, conforme ilustrado na Figura 7. Subsequente recolha de dados a partir de culturas tratadas com compostos terapêuticos permiteComparação de propriedades funcionais com e sem adição do fármaco, permitindo assim a avaliação da actividade do composto e subsequente previsão de respostas in vivo. Além disso, protocolos de estimulação estendidos fornecem os meios para avaliar as taxas de fadiga em células em cultura, ampliando, assim, o nível de dados fisiológicos obtidos a partir deste sistema (Figura 8).
A cultura cantilever pode ser modificado para incluir os neurónios motores em cultura com o sistema músculo-esquelético miotubos 16, de modo a permitir a avaliação da formação de sinapses neuromusculares in vitro (Figura 9). Nessas culturas, as taxas de actividade contráctil espontânea são comparadas com as taxas de contracção em resposta ao tratamento com um estimulante especifica dos neurónios, tal como glutamato. Qualquer aumento de glutamato induzida observadas nas taxas de contração sugerem que a ativação de neurônios em cultura, levando à liberação de acetilcolina e mio subseqüenteativação tubo. O tratamento com inibidores sinápticas, tais como a acetilcolina bloqueador do receptor D-tubocurarina, conduzindo à cessação da actividade induzida pelo glutamato proporcionam mais evidência da presença de sinapses neuromusculares funcionais nestas culturas 16.
Figura 1 Esquema de fluxo de processo de fabricação detalhando cantilever. Os números listados no diagrama de fluxo de correlacionar os passos do protocolo na seção de métodos intitulado "fabricação de chips em balanço." Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Equipamentodetalhes do sistema de laser / fotodetector utilizado para avaliar a contração celular em consolas. (A) Fotografia do microscópio eletrofisiológico modificado utilizado para avaliação cantilever. O laser (i) e fotodetector (ii) são montados embaixo do palco em estágios de translação XY. Um prato de cultura transparente é montado na fase (iii), que permite a passagem do laser para a matriz através do braço de suporte inferior do palco. (B) Esquema "top-down" em perspectiva da platina do microscópio. XY estágios de translação permitir o movimento do laser e fotodetector em ambos os planos X e Y (setas vermelhas), facilitando o movimento do laser para interrogar cada cantilever em uma matriz. Chips de Cantilever (iii) deve ser colocado na fase com os braços de suporte voltados para a direita da fase para que o sistema possa funcionar correctamente. (C) acima da fotografia de laser (i) efotodetector (ii) montado por baixo da platina do microscópio. O laser é posicionado num ângulo de 30 ° em relação ao plano do chip cantilever (θ) (D). Fecha-se uma fotografia da placa de cultura. Broad-campo estimulação elétrica é aplicada por meio de um par de eletrodos de prata posicionados distantes 15 mm (iv). Um elemento de aquecimento (v) ligado ao lado inferior do prato é utilizado para manter a cultura a 37 ° C durante a análise. O controle de temperatura é dinâmica, e regulamentada por meio de um termistor colocado no meio (não mostrado). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 Fluxograma da lógica do software para controle subjacente. digitalização do software laser e fotodetector dois loops de controle de movimento: um loop principal de entrada do usuário e um loop que controla o movimento de varredura. Setup é realizada enquanto no circuito principal, seguido pela ativação do segundo ciclo de médio a coleta de dados de alto rendimento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 Interface gráfica do usuário do software usado para controlar as posições de laser e fotodetector durante a avaliação cantilever. (A) Botões para controlar manualmente as posições de laser e fotodetector em ambos planos X e Y. (B) Os comandos de configuração manualmente as posições dos quatro consolas de canto (1, 16, 17 e 32), permitindo assim que o software paraextrapolar as posições das restantes consolas na matriz. (c) os controlos que permite aos usuários selecionar quais consolas a incluir em cada varredura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 Imagens de um chip cantilever construído sob encomenda para utilização neste sistema, e imagens representativas de células mantidas em superfícies similares. (A) A fotografia de um single, chip de cantilever personalizado construído. Cada chip contém 32 cantilevers dispostas em duas fileiras de 16 Cantilever 1 está posicionado no canto inferior esquerdo da imagem e cantilever 32 no canto superior direito. Batatas fritas são em cantilever (B) imagem de contraste de fase de células primárias de rato de músculo esquelético de 15 x 15 mm 2. Cultivadas em cantilevers. Cada braço de suporte é de 750 um de comprimento, 100 mm de largura e 4 mm de espessura. (C) coloração imunocitoquímico de miotubos de rato primária mantida em cantilever. As células foram coradas utilizando uma sonda de anticorpos para Myosin pesado Chain. Note-se a aparência estriada da fibra cultivadas, indicando a maturação das máquinas contráctil. Bordas marquises foram artificialmente destacado nesta imagem para fornecer uma indicação de escala. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 Esquema ilustrando os termos usados nas equações de Stoney para derivar força produzida por miotubos em consolas. Δ = cantilever ponta deflexão e estresse produzido pelo miotubo, CDetector = o coeficiente específico do sistema de tensão relativa à posição do laser sobre o fotodetector, θ = o ângulo do laser e do detector em relação ao plano do cantilever, Si = E o módulo de elasticidade de silício, Si = t as espessuras de o cantilever, t f = espessura miotubo, v Si = relação do veneno de silício, o comprimento L = cantilever, eo comprimento P = caminho do laser de ponta cantilever ao detector. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7. dados brutos representativos e análise de forma contráctil utilizando o sistema de cantilever descrito. (A) Exemplo de um traço de dados brutos a partir do amplo campo de estimulação elétrica de miotubos primários de rato em consolas. Top traço = deflexão de laser (em volts) no eixo-x, o que indica longitudinalmente pressão sobre o braço de suporte. Traço Médio = deflexão de laser (em volts) no eixo y, que indica a tensão de torção através do braço de suporte. Traço inferior = Indicação da posição temporal do impulsos eléctricos utilizados para provocar a contracção de miotubo neste sistema. (B) Utilizando o software padrão electrofisiologia, é possível medir a força máxima (PF), tempo para o pico de força (PTT) e do tempo de meia relaxamento (meia RT) a partir dos dados brutos recolhidos. (C) Collated dados de contração (n = 11) de ratos primário myotubes músculo esquelético. Aplicação da equação de uma Stoney modificada permite o cálculo de estresse cantilever de leituras de dados brutos em Volts. A partir destes dados, cálculo directo da força (em Newton) também pode ser gerado. Os dados publicados reimpressos wpermissão om 13. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8 Os dados representativos que demonstram a análise de fadiga do músculo esquelético em culturas cantilever. Os dados em bruto (em volts) foi convertido a uma medição de força de miotubos (em nano-Newtons) e re-desenhado. Dados ilustra magnitude das contrações miotubo sobre consolas em resposta a uma Hz amplo campo elétrico pulsos após 0 min (traço preto) e 120 minutos (gray traço) da estimulação contínua. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9 vestígios representativos da análise de uma co-cultura de músculo-esquelético de motoneurónios mantida em cantiléver, demonstrando os efeitos funcionais de estimulação de motoneurónios com e sem a adição de um agente bloqueador neuromuscular. De dados em bruto (em volts) foi convertido para uma medição de miotubo força (em nano-Newtons) e re-desenhado. (A) de medição das contracções espontâneas por os miotubos cultivadas sem estimulação neuronal. (B) de medição de contracção miotubo após a estimulação neural por meio da adição de 200 uM de glutamato. (C) Medição de contração miotubo seguinte glutamato e 12,5 uM tratamento D-tubocurarina. Os dados publicados Reproduzido com permissão 16. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
As tabelas a seguir listam os reagentes específicos utilizados para células de cultura nos experimentos de validação descritos, bem como os equipamentos necessários para realizar a avaliação de cantilever. Por favor, note que os reagentes de cultura utilizados não são necessárias e este sistema deve ser facilmente integrado com os protocolos de cultura de qualquer laboratório de manutenção de células contráteis in vitro. Os reagentes listados são fornecidos devem investigadores deseja repetir os resultados experimentais específicas descritas.
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Discussion
Os passos críticos na análise de microescala consolas para a evidência de contracção celular são o posicionamento do braço de suporte do chip dentro da platina do microscópio e do subsequente alinhamento do laser e foto-detector, com a ponta dos braços de suporte de canto na matriz. Se isso não for feito de forma precisa, em seguida, o software não será capaz de extrapolar as posições das restantes consolas na matriz, potencialmente levando ao acúmulo de falsos negativos durante a coleta de dados. Os operadores devem ter o cuidado de assegurar que o chip cantilever é deitada nivelada com o fundo da placa de cultura antes de calibrar as posições de laser. Se o chip fica com um ângulo no prato, ela irá alterar o percurso do feixe de laser desviado e confundir a recolha de dados.
A mesa de ar funcional deve ser empregado para anular as vibrações fundo durante a coleta de dados. A pequena espessura (cerca de 4 mm) dos braços de suporte usado neste estudo provides alta sensibilidade para a actividade contráctil, mas tem o efeito colateral do aumento da sensibilidade às vibrações. Os operadores devem ter o cuidado de se deslocar no hardware o mínimo possível durante a gravação de dados, para reduzir leituras de fundo. Finalmente, ao colocar o chip cantilever no palco, tomar cuidado para garantir o chip não entra em contato com os estimulantes eletrodos de prata na cultura também. Aplicação de estimulação de amplo campo com o eléctrodo de tocar o chip irá alterar o percurso de corrente e ter um impacto negativo sobre a capacidade do sistema para estimular eficazmente as células cultivadas.
A fim de obter leituras mais precisas de produção de força em miotubos músculo esquelético, é altamente recomendável realizar imunomarcação das células cultivadas análise uma vez funcional é completa. As equações listadas requerem entrada de área de secção transversal de um miotubos (CSA), a fim de calcular a força. Apesar de um valor assumido pode ser usado com base em previous dados, medição de CSA exata de um miotubo usando técnicas de imagem confocal irá fornecer uma estimativa mais precisa da força exercida pela miotubo contratação. Relacionando dados de contração matérias com as características físicas da célula em questão é valioso em resultados normalização em várias consolas e entre as condições experimentais de 15, e, portanto, fundamental para a geração de previsões precisas de respostas teciduais inteiras ao tratamento medicamentoso ou doença. Equações de Stoney assumir os miotubos examinados abrangem todo o comprimento do cantilever assim esforço deve ser feito para incluir somente os dados obtidos a partir de células que cumprem essa suposição. Se isso não for possível, a análise de elemento finito podem ser utilizados para proporcionar uma medição precisa da força de miotubos menores como anteriormente publicado 15. Este método de análise é muito mais trabalho intensivo e, portanto, inadequado para aplicações de taxa de transferência mais elevados, mas pode ser necessário se optimizadoculturas de células em conformidade com os pressupostos da Stoney não pode ser obtida.
Como já foi dito, os parâmetros de cultura podem ser transferidos a partir de preparações de lamelas convencionais. No entanto, é aconselhável considerar a utilização de composições de meio sem soro e substratos não biológicos para utilização deste sistema em aplicações de pesquisa de fármacos. Devido à natureza indefinida de soros de animais, o efeito de novas terapias podem ser confundidos pela inclusão desses aditivos no meio de cultura. Formulações de meios isentos de soro estão disponíveis tanto para as culturas de roedor e de músculo esquelético humano 18-21 e proporcionar um ambiente mais controlado, bem definida para realizar a avaliação do composto. Da mesma forma, a utilização de revestimentos biológicos (colagénio, laminina, etc) sobre consolas apresenta variabilidade para as preparações de células que são evitados através da aplicação de substratos não-biológicos. A deposição de monocamadas auto-montadas de silano sobre as superfícies de cultura demonstraram extensively para apoiar a adesão e desenvolvimento de vários tipos de células 16,18,20,22-31, e representam os meios para gerar superfícies totalmente definidas de uma forma fiável e repetível.
Devido ao intervalo de células contrácteis presentes em sistemas de mamíferos, a aplicação deste modelo para testes in vitro é relativamente larga. Embora optimizada utilizando células do músculo esquelético, o sistema é potencialmente aplicáveis para suavizar as células musculares e cardiomiócitos assim, o fornecimento de meios para realizar uma rápida avaliação das respostas de dose de novas terapêuticas nestas células em tempo real. Chips de cantilever atuais consistem em uma matriz de 32 consolas (Figura 5A), mas pode ser facilmente alterado para incluir muitos mais. Análise de tais matrizes produz um número substancial de pontos de dados a partir de uma única cultura, aumentando assim grandemente o poder estatístico das diferenças observadas. Como evidenciado na Figura 8, células cultivadasneste sistema de sofrer de fadiga ao longo do tempo, em resposta a estimulação contínua de amplo campo, permitindo que a avaliação dos efeitos da droga sobre os níveis de resistência das células in vitro. adição de neurónios motores da inervação do presente modelo de cultura também permite a avaliação da formação de sinapses, através de medição do músculo contracção em resposta aos estimulantes neuronais (Figura 9). Embora a medição de parâmetros funcionais de linha de base em um ensaio multiplex (Figura 7) tem vantagens óbvias sobre avaliação biomolecular padrão de culturas in vitro, a capacidade de avaliar a funcionalidade neuromuscular e a capacidade de resistência de células semeadas aumenta grandemente a aplicabilidade deste modelo para o rastreio de drogas e aplicações de modelagem doença. A técnica descrita oferece investigadores os meios para executar baixo custo avaliação rápida e funcional de ambas as células musculares saudáveis e doentes in vitro. A versatilidade do sistema de cultura, e a hIGH nível de detalhe funcional obtido a partir da análise dos dados brutos, deve produzir previsões mais precisas de respostas in vivo de tecidos para novos desafios patológicos e químicos.
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Acknowledgments
Esta pesquisa foi financiada pelo Instituto Nacional de números de subsídios Saúde R01NS050452 e R01EB009429. Fabricação dos chips cantilever foi realizada externamente por colaboradores no Centro de Nanofabricação localizado na Universidade de Cornell. Todos os equipamentos utilizados no processo de fabricação cantilever foi localizado nesta instalação. Um agradecimento especial a Mandy Esch e Jean-Matthieu Prot para a sua assistência com cantilever micro-fabricação. Animação de vídeo de funcionalidade cantilever foi gerada por Charles Hughes, Alex Zelenin e Eric Imperiale do Lab Realidade Sintética na UCF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary rat muscle growth medium | |||
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| B27 (50x) | Life Technologies | 17504044 | 1x |
| Glutamax (100x) | Life Technologies | 35050061 | 1x |
| G5 supplement | Life Technologies | 17503-012 | 1x |
| Glial-Derived Neurotrophic Factor | Cell sciences | CRG400B | 20 ng/ml |
| Brain-Derived Neurotrophic Factor | Cell sciences | CRB600B | 20 ng/ml |
| Ciliary Neurotrophic Factor | Cell sciences | CRC400A | 40 ng/ml |
| Neurotrophin-3 | Cell sciences | CRN500B | 20 ng/ml |
| Neurotrophin-4 | Cell sciences | CRN501B | 20 ng/ml |
| Acidic Fibroblast Growth Factor | Life Technologies | 13241-013 | 25 ng/ml |
| Cardiotrophin-1 | Cell sciences | CRC700B | 20 ng/ml |
| Heparin Sulphate | Sigma | D9809 | 100 ng/ml |
| Leukemia Inhibitory Factor | Sigma | L5158 | 20 ng/ml |
| Vitronectin | Sigma | V0132 | 100 ng/ml |
| Primary rat muscle differentiation medium | |||
| NB Activ 4 | Brain Bits LLC | NB4-500 | |
| Equipment | |||
| Class 2 red diode laser | Newport | ||
| Photo-detector | Noah Industries | ||
| Model 2100 Pulse stimulator | A-M systems | ||
| Multiclamp 700B Digitizer | Axon Instruments | ||
| Patch clamp microscope and stage | Olympus | ||
| Delta T4 culture dish controller | Bioptechs | ||
| Axoscope software | Molecular Devices | ||
| LabVIEW software | National Instruments | ||
| 37 oC, 5% CO2 incubator | NAPCO | ||
| Class 2 microbiological flow hood | Labconco | ||
| Pipettes and tips | Eppendorf |
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