Summary
Bu protokol, in vitro kas hücrelerinin kasılma ölçmek için esnek kültür yüzeyleri olarak mikro silikon konsolun kullanımını tarif etmektedir. Hücresel kasılması, ölçülen kaydedilen ve in vitro kontraktil fonksiyon ölçmek için non-invazif ve ölçeklenebilir sisteminin temin edilmesiyle, kuvvet çıktılan dönüştürülebilir dirsekli bükme neden olur.
Abstract
Daha fazla ön ve biyolojik olarak uygun in vitro tahlillerin gelişimi tohumlanmış hücrelerin fonksiyonel değerlendirilmesini sağlamak çok yönlü hücre kültür sistemlerinin ilerlemesi dayanmaktadır. Bu amaçla, mikro konsol bükme teknolojisi daralma kaynaklı alt tabakanın değerlendirilmesi yoluyla, iskelet, kalp ve düz kas hücreleri dahil hücre tipleri, bir dizi kasılma işlevselliğini ölçmek için hangi ile bir platform sunuyor. Birden fazla mesaj göndermiş konsol dizilerin uygulanması ilaç yeterlilik ve toksisitesini, hastalığın ilerlemesini fenotip ve yanı sıra, kas ve diğer hücre-hücre etkileşimleri değerlendirmek için yüksek verimli protokollere orta geliştirmek için bir araç sağlar. Bu yazıda, bu amaç için güvenilir bir konsol dizileri imal edilmesi için ayrıntıları ve bu yüzeyler üzerinde başarıyla kültürü hücreleri için gerekli olan bir yöntem sağlar. Ayrıca açıklama fonksiyonel anal gerçekleştirmek için gerekli adımlar sağlanırkontraktil hücre tipleri Ysis yeni lazer ve foto-dedektör sistemi kullanarak bu tür diziler üzerinde muhafaza. Vurgular hassasiyet ve bu sistem ile mümkün kontraktil fonksiyonun tekrar analiz tekrarlanabilir niteliği verilen temsili veriler, hem de çalışma geniş olan bu tür önlemlerin hale gelebilir. Bu sistemin başarılı yaygınlaşmasının araçlarla araştırmacılar doku performansı, hastalık gelişimi ve yeni terapötik tedaviye yanıtın daha doğru tahminlere yol açan, in vitro hızlı, düşük maliyetli fonksiyonel çalışmalar yapmak sağlayabilir.
Protocol
1. Konsol Chip Fabrikasyon
Açıklanan imalat adımlarının gösterilen ayrıntıları Şekil 1 'de verilmiştir.
- Bir fırın içinde silikon üzerinde yalıtkan (SOI) gofret yerleştirin ve bunları kurutmak için 20 dakika boyunca 125 ° C'de pişirilir.
- Bir plazma kullanılarak susuz SOI gofretin sap tabakası üzerine silikon oksit, 1.5 mikron kalınlığında bir tabaka yatırın kimyasal buhar çöktürme (PECVD) aracı artırıldı.
- Cihaz katman yukarı bakacak şekilde spin lak mandrenin gofret yerleştirin. , Gofret merkezli olduğundan emin olun 1,000 rpm / saniye bir hızlanma 60 saniye boyunca 3000 rpm'de gofret merkezinde ve spin P20 astar 2 ml dağıtmak. P20 astar cihaz fotorezist tabakaya yapışmasını teşvik etmektedir.
- Gofret spin lak mandrenin görünse de, o ile 1000 rpm / saniye oranında hızı 60 saniye boyunca 3000 rpm'de S1818 gofretin ortasına ışığa ve spin 2 ml dağıtmakFotorezist 1.5 mikron kalınlığında bir tabaka btain.
- Sıcak bir plaka üzerinde gofret yerleştirin ve 1 dakika boyunca 115 ° C'de bir fırında yumuşak gerçekleştirin.
- Cihaz üzerinde bir tabaka ışığa için konsol maskeden desen transfer etmek için bir iletişim fotolitografi maske hizalama kullanılarak sert kontakt UV ışınlarına maruz kalma gerçekleştirin. 125 mj / S1818 fotodirenç için cm 2 poz enerji değerine göre pozlama süresini hesaplayın.
- Hafifçe ileri ve geri gofretin çalkalayarak, 1 dakika boyunca 726 MIF fotorezist geliştirici gofret daldırarak fotorezist geliştirir.
- De-iyonize (DI) su ile durulayın gofret ve tercihen bir sıkma durulama kurutma makinesi (SRD) aracını kullanarak, kurutun.
- Aseton batırılmış bir pamuk bez kullanılarak (kenardan 5 mm kadar) gofretin kenarından fotorezist çıkarın.
- Fotorezist tarafı yukarı bakacak şekilde, bir Derin Reaktif İyon Asitli (DRIE) aracında gofret yükleyin ve devi ile desenli silikon tabakasını etch için bir reçete çalıştırınce katmanı. Bir aşındırma durak olarak gömülü oksit katmanı işlevleri, yani tam bir iz sağlamak için gerekli olması beklenmektedir% 100'den daha fazla döngü için% 50 ile bir iz gerçekleştirin.
- Fotorezist şerit 20 dakika boyunca sıcak bir fotorezist Banyo çözeltisi içindeki gofret yerleştirin. DI su ile gofret durulayın hızlı-dökümü-rinser (QDR) gofret aktarın. Fotorezist şerit ardından, durulama ve gofretin kuruması için SRD aracında gofret yükleyin. Beklendiği gibi konsol desen görünür sağlamak için bir mikroskop altında gofret kontrol edin.
- Bir PECVD alet gofretin cihaz katmanda un katkılı bir silikon oksit 1 mikron kalınlığında bir tabaka bırakın. Daha fazla işlem kademesi sırasında konsollar için koruyucu tabaka olarak bu oksit tabakası çalışır.
- Gofretin arka tarafının başlatmak üzere yukarı bakacak şekilde sap tabakası ile dönel kaplayıcı aynası üzerine, gofret yerleştirin. Olun gofret 3000 rpm'de P20 gofretin ortasına astar ve spin 2 ml dağıtılması, ortalanır1000 rpm / saniye oranında hızı 60 sn.
- Gofret spin lak mandrenin görünse de, bir 6.5 mikron kalınlığında bir tabaka elde edilmesi için 1000 rpm / saniye oranında hızı 45 saniye boyunca 2000 rpm'de gofretin merkezi ve spin üzerine SPR220-4.5 fotodirenç 2 ml dağıtmak Fotorezist.
- 2 dakika boyunca 115 ° C'de bir fırında yumuşak gerçekleştirmek için bir yakınlık sıcak bir plaka üzerinde gofret yerleştirin.
- Ön / arka uyum yeteneğine sahip bir fotolitografya temas hizalama kullanarak, ön yan konsol desen arka pencere maske hizalayın ve kolu katmanda fotodirenç için arka pencere maskeden desen transfer etmek için bir sert kontakt UV maruziyetini gerçekleştirin. 480 mj / SPR220-4.5 fotodirenç için cm 2 poz enerji değerine göre hesaplanan bir pozlama süresi kullanın.
- UV'ye maruz kalmadan sonra, çok ince bisküviler bir sonraki işleme aşamasından önce 30 dakika süre ile karanlık bir yerde kalmasını sağlar.
- Gofretin daldırarak fotorezist geliştirilmesi2 dakika süre ile, 726 MIF fotorezist geliştirici hafifçe ileri ve geri gofreti çalkalandı.
- De-iyonize (DI) su ile durulayın gofret ve tercihen bir sıkma durulama kurutma makinesi (SRD) aracını kullanarak, kurutun.
- 12 saat boyunca 90 ° C'de bir fırında gofret yerleştirin.
- Florlu gazlar ile RIE sistemi ve oksit gravür için bir tarifi kullanarak gofret ters silikon oksit tabakası etch. Gofretin ters desenli oksit daha sonraki işlemler için bir aşındırma maske olarak görev yapar. Maruz kalan penceresinde silikon oksit tamamen kazınmış olduğundan emin olmak için bir mikroskop altında gofret kontrol edin.
- Aseton batırılmış bir bez kullanılarak temiz oda (kenardan 5 mm kadar) gofretin kenarında fotorezist çıkarın.
- Bir DRIE aracında gofret yüklemek ve bir aşındırma durak olarak gömülü oksit tabakası işleyişi ile 500 um'lik bir derinliğe desenli tabaka sap oyulması için bir tarifi çalıştırın. Aşırı ısınmasını önlemek için birden çok çalışır içine bu etch bölünmüşsilikon tutarsız aşındırma neden gofret. Bu aşındırma adımı tamamen dirseklerin altında silikon kaldırır.
- Dirseklerin altında gömülü oksit tabakası ve dirseklerin üstüne koruyucu oksit katman şerit,% 25 sulandırılmış HF pürüzlendirici kullanan bir ıslak aşındırma adımı gerçekleştirir.
Not: Bu adım silikon konsolun alt yüzeyi serbest bırakır ve aynı zamanda lazer ile dirsekli araştırmak için bir erişim sağlamak için altına bir pencere açar. - DI su banyoları dizi ve azot ile dikkatlice kuru kullanarak gofret durulayın. Konsollar kendi üslerinde yalnızca desteklenen yana, doğrudan dirseklerin üzerine DI su veya inert gaz güçlü spreyler kullanmayın.
- Sap tabakası aşındırma adımı esnasında üretilen klevajın çizgileri boyunca gofret bireysel fiş bölmektedir.
2. Hücre Kültürü
- Daha önce yayınlanmış yöntemlerden 17'ye göre 13F lamelleri hazırlayın.
NOT: Eğer 13F koyrslips mevcut değildir, 95 ° C'nin üzerindeki bir temas açısına sahip herhangi bir hidrofobik yüzey kullanılabilir. - Konsol cips ve% 70 etanol çözeltisi içinde 13F lamelleri sterilize ve bir akış kaputu kurumaya bırakın.
- Bir standart 12 plaka içindeki 13F lamelleri üstüne bireysel konsol cips yerleştirin.
- Kaplayın hücre tipi için optimize biyopolimer veya yüzey modifikasyonu ile dirsekleri standart hücre kültür protokollere göre kullanılır.
- Istenen konsantrasyona kendi özel büyüme ortamında hücrelerin yeniden askıya.
NOT: Bu protokol konsol penceresinden düşen ve istenilen konsol yüzeyine yapışan olmayan hücrelerin önemli bir sayıda neden olur. Hücre preparasyonlar, bu sebepten, standart preparatları için bir örtücü cam, daha konsantre 3-4x yapılmalıdır. Örneğin, sıçan iskelet kas uydu hücreleri, tipik olarak tohumlama 500-700 hücre / mm kare 15,16 ilk önce tohum ekme yoğunluğu kullanılarak yürütülürVe / meydan aa 2000 hücre olacak şekilde konsol alt tabakalar kullanılmaktadır. Optimizasyon deneyler, uygun bir tohum yoğunluğu belirlemek için yeni bir hücre kaynakları ile yapılmalıdır. - Orta kabarcık tamamen konsol pencere kapsayan sağlanması konsol çip yüzeyi üzerine, hücre süspansiyonu 200 ul pipetle. Orta pencereden fitiller ve dirseklerin üstüne bir statik kabarcık oluşturmak vermezse 13F lamel değiştirmek ve kaplama reattempt.
- Bir kuluçka yongası içeren plaka aktarın ve hücreler, en az 1 saat (tercihen 2-3 saat) boyunca yapışmaya izin verir.
- Bu kaplama tamamlandıktan sonra, büyüme ortamı, 1 ml kültür, bir 13F lamel olmaksızın temiz bir çukuruna çipi transferi, ve en fazla steril forseps kullanır.
- Inkübatör plaka dönün.
- Lamelleri in vitro bakım için standart bir protokole uygun hücreleri korumak. Iskelet kası hücreleri için,Hücreler birleştiklerinde, gerekli olacaktır hale kez ortam bileşiminin bir anahtar miyotüp oluşumunu tetiklemek için karıştırılabilir.
Konsol Saptırma Analiz için Donanım ve Yazılım 3.Kurulum
- Dik elektrofizyoloji mikroskop aşamasında içine ısıtılmış kültür çanak yerleştirin.
- Isıtılmış mikroskop kademesine ile henüz (+ 10 mM HEPES) içinde süspanse edilmektedir besleme ortamının 3 ml ilave edilir.
- 15 mm'lik bir ayırma mesafesi ile ısıtılmış kültür çanak iç paslanmaz çelik elektrotlar monte ve bir darbe üreteci arasında değişen yoğunlukta, frekans ve dalga biçimi alan uyarım darbelerini üretebilen bağlamak, sistem alan uyarımı üretmek için izin Uygun zaman hücrelerin.
- , Mikroskop tablonun alt tarafına, X ve Y platformlarının üzerine monte edilen bir helyum-neon lazer cıvata ve lazer ışını, bir 30 ° 'lik açı relativ de ısıtılmış kültür çanak tabanı boyunca yönlendirilecek şekilde ayarlayınkonsolun düzlemine e.
- , Mikroskop sahne alt etmek, XY öteleme aşamalarında üzerine monte edilmiş bir kadran fotoğraf-dedektör modülü cıvata ve 4 kadranın merkezinde yansıyan lazer ışını topraklar. Şekil 2, böylece konumunu ayarlamak kurmak donanımın bir bakış sağlar Açıklanan protokol uygulanması için gerekli.
- Cantilevers üzerinden tarama doğrusal aktüatörler kontrol etmek için bir yazılım program yazın. Şekil 3'te sunulan akış şemasına değini ile yazılım programı yazmak. Bu sistem ile kullanılmak üzere programlanmış bir grafik arayüz Şekil 4'te sunulmuştur.
4. Kaydı Konsol Sapma Veri
- Konsol analiz donanımı ve ilgili yazılımlar açın.
- Ortama ısıtılmış sahne termistoru yerleştirin ve 37 ° C okumak için sabırsızlanıyorum.
- Cantileve ile aşamaya konsol çipi takınSahnenin sağ tarafında yönelmiştir rs.
- Mikroskop ışık kaynağı açın.
- Konsol varsayarsak sahnenin sağında, konsol 1 yöneliktir: görünüm içine konsolun kenarlarını getirmek ve konsol 1. NOT ucunda lazer ışını konumlandırmak için lazer / fotoğraf dedektör kontrol yazılımı kullanmak için Odak mikroskop Dizinin sol üst konumlandırılmış biridir ve sayılar sol alt aşağı 16 çalıştırın. Konsol 17 sağ üst pozisyonda ve sağ alt (Şekil 5A) içinde 32 hareket eder.
- Basın kayıt yazılımı üzerinde "oynamak".
- Sinyal foto-dedektörü kontrol kademeli motora ayarlayarak, x ve y çerçeveleri hem de "0" okur, böylece foto-dedektörü yerleştirin.
- Lazer / fotoğraf-detektör kontrol yazılımı Set konsol 1 pozisyon (Şekil 4).
- . Adımı 4.7 tekrarlayın, konsolun 16 ucuna lazer taşıyın ve cantilev seter lazer / fotoğraf-detektör kontrol yazılımı 16 pozisyon.
- Lazer / fotoğraf-detektör kontrol yazılımı adımı 4.7. Ve set konsol 32 pozisyonunu tekrar, konsolun 32 ucuna lazer taşıyın.
- Lazer / fotoğraf-detektör kontrol yazılımı adımı 4.7. Ve set konsol 17 pozisyonunu tekrar, konsolun 17 ucuna lazer taşıyın.
- Mikroskop ışık kaynağı ve laboratuarda havai ışığı kapatın.
- Kayıt yazılımı basın "rekor".
- 1 Hz frekansta 40 msn'de, 5 V bakliyat için nabız jeneratörü donanımı ayarlayın ve makineyi açın.
NOT: İsteğe bağlı olarak, bu noktada belirli bir hücre kaynakları için optimize edilmiş stimülasyon protokolleri istihdam, belirtilen ayarları insan ve kemirgen hücre kaynaklarının 12,13,15,16 kullanılarak toplanan verilere dayalı kurallar vardır. - Lazer / fotoğraf dedektör kontrol yazılımı kullanarak, her on 5 saniye durdurma, 32 konsol dizi boyunca tarama donanımı ayarlayınör.
- 32 konsolun Tarama işlemi tamamlandığında, daha sonra kayıt yazılımı ve veri dosyasını getirmek, uyarıcı kapatın.
- Kontraktil aktivite kanıt her bir dirsek gelen kaydedilen iz inceleyin. Olumlu tepkiler her konsolun bir kenara not edin. Saptırma taban üzerinde en az 0,1 V ise, bir daralma, bir tepe noktası olarak tanımlanır.
- Lazer / fotoğraf dedektör kontrol yazılımı üzerinde tarama protokolü herhangi bir sigara duyarlı konsol çıkarın.
- Aktif konsollar daha sonra hücrenin spontan kontraktil aktivitenin bir okuma almak için uyarı olmaksızın rescanned edilebilir.
- Kültürlenen hücrelerin fonksiyonel çıktıya üzerindeki etkisini gözlemlemek için ortama terapötik bir bileşik ilave edildikten sonra, ya da geniş alan elektriksel uyarımı olmaksızın taramaları çalıştırın.
- Elektriksel Uzun süre ve Contr tarama seviyeleri için hücreleri uyararak yorgunluk değerlendirmeler yürütmek actility belirli bir eşiğin altına düşmesi pik gücü için ne kadar sürdüğünü ölçmek için.
- Motor nöronlar, kas ile ko-kültür içinde muhafaza edilir deneylerde, nöromüsküler nöronal bir uyarıcı motonöron-miyotüp konsol ko-kültürler işlemi ile bağlantı oluşumu (glutamat gibi) veya sinaptik inhibitör ölçün (örneğin, D-tubokurarin) ve tarama spontan aktivitede artış ve azalışlar sırasıyla 16.
- Planlanan deneyler ihtiyaçlarına göre belirlenecektir gibi özel taramalar yapar.
Konsol Sapma Verilerin 5. Analiz
- Kullanım Stoney denklemleri 15 hücre tabakası veya miyotüp (Pascal), ve (nano-Newton) hücresel kasılma gücünün doğrudan ölçümü stres bir okuma içine (Volt) ham konsol sapma verilerini dönüştürmek için (aşağıda ayrıntılı) güncellendi:
reklam / 51866 / 51866eq1.jpg "/> Denklem 1
Denklem 2 - Δ = konsol ucu sapma ve stres miyotüp tarafından üretilen yerlerde, σ c üniforma kalın filmi konsol, C dedektörün tam genişliğini varsayarak miyotüp tarafından üretilen = stres, = fotoğrafın üstüne lazer konumuna gerilimi ilişkin sistemine özgü katsayısı -detector, θ = konsolun düzlemine lazer ve detektör açısının E Si silikon elastik modüle = t Si konsolun kalınlığı = t = f miyotüp kalınlığı v = Si oranı arasında Zehir silikon, L = konsol uzunluğu, dedektör konsol ucundan lazer P = yolu uzunluğu, w
- Düzgün bir film miyotüp olduğunu varsayarak, miyotüp yapan kuvvet Stoney uygulama için kullanılan stresten kuvvet hesaplama ve varsayılan hücre bir kesit alana eşitleyerek, 3. Denklem yol filmde kuvvete eşittir denklem.
Denklem 3 - Fonksiyonel Veri toplama, imünositokimyasal analizler için konsol fiş düzeltmek veya standart teknikler kullanılarak protein veya DNA analizi için hücreler kullanır.
- İsteğe bağlı olarak, daha sonraki bir zaman noktasında, işlevsel performansı yeniden değerlendirme amacıyla kuluçka yerine moleküler analiz için hazırlanırken hücreleri döner.
Denklem 2 Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dirseklerin kontraktil hücrelerinin başarılı kültürü, standart hücre kültürü teknikleri (Şekil 5) kullanılarak, nispeten basit bir işlemdir. Yakalanma hücreleri destekleyici dirseklerin yüzdesi, hücre tipine bağlı olarak değişir incelenmiş ve belirli bir kültür tekniği kullanılmış olmasıdır. Sıçan arka bacak türetilen birincil embriyonik hücreleri kullanarak, kontraktil aktivite incelendi konsolun tespit% 12 (n = 4). Açıklanan lazer ve foto-dedektör sistemi kullanılarak kasılma fonksiyonu analizi seribaşı hücrelerin işlevsel vadeye ilişkin kesin ve gerçek-zamanlı veri sağlar. Şekil 7'de gösterildiği gibi, standart elektrofizyolojik yazılımının kullanılması, daha sonra bu yarı gevşeme için tepe kuvveti, kuvvet zirve zaman ve zaman gibi uygun fonksiyonel özellikleri, hesaplanması kolaylaştıran, ham verileri analiz etmek için kullanılabilir. Daha sonra, veri toplama muamele edilmiş kültürlerden tedavi edici terkipler ile sağlarve ilaç ilavesi olmaksızın fonksiyonel özellikleri ile karşılaştırılması, böylece bileşik, aktivite ve in vivo tepkilerinin sonraki tahminler değerlendirilmesine olanak tanır. Ayrıca, genişletilmiş protokoller dolayısıyla bu sistem (Şekil 8) 'den elde fizyolojik veri düzeyini genişletilmesi, kültürlü hücrelerde yorgunluk oranlarını değerlendirmek için araçları sağlar.
Konsol, in vitro olarak kültürü nöromüsküler sinaps oluşumu (Şekil 9) değerlendirilmesine izin verecek şekilde. Gibi kültürlerde, spontan kontraktil aktivite oranları oranları ile karşılaştırıldığında, iskelet kası miyotüplerinin 16 ile kültür sisteminde, motor nöronlar için değiştirilebilir glutamat gibi bir nörona özgü uyarıcı ile muamele edilmesine cevaben, daralma. Daralma oranlarında gözlenen herhangi bir glutamat kaynaklı artışlara asetilkolin salımı ve ardından miyo yol kültürlenmiş nöronların aktivasyonunu göstermektedirtüp aktivasyonu. Glutamat kaynaklı etkinliğinin durdurulması yol açan bu tür asetilkolin reseptör tıkayıcı, D-tübokürarin sinaptik inhibitörleri ile tedavi, bu kültürlerde 16 fonksiyonel nöromüsküler sinaps varlığı ilişkin başka kanıtlar sağlar.
Şekil 1. Şematik ayrıntılarıyla konsol üretim süreç akış. Akış şemasında verilen numaralar başlıklı yöntemler bölümünde protokol adımlara korelasyon "Konsol çip fabrikasyon." Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. Donanımcantilevers hücresel daralma değerlendirmek için kullanılan lazer / fotoğraf-detektör sisteminin ayrıntıları. Konsol değerlendirilmesi için kullanılan modifiye elektrofizyolojik mikroskop (A) fotoğrafı. Lazer (i) ve foto-detektör (ii) XY öteleme aşamalarında sahnede altına monte edilir. Şeffaf bir kültür çanak sahnenin alt üzerinden konsol diziye lazer geçişine izin aşamasında (iii), üzerine monte edilir. (B) şematik "yukarıdan-aşağıya" mikroskop sahne perspektif. XY platformlarının, dizideki her dirsekli sorgulamak için lazer hareketini kolaylaştırmak, X ve Y düzlemleri (kırmızı oklar) hem de lazer ve fotodetektör hareketini sağlar. Konsol cips (iii) lazer (i) fotoğrafı Close up (C). Düzgün çalışması için sistemi için sırayla sahne sağa doğru bakacak çıkmalarıyla aşamaya konulmalı veFoto-detektör (ii) aşamasında mikroskop altına monte edilmiştir. Lazer konsol çip (θ) düzlemine göre 30 ° 'lik bir açı ile konumlandırılmıştır. (D) kültür çanağı fotoğrafı kadar kapatın. Elektriksel stimülasyon gümüş bir elektrot çifti aracılığıyla uygulanır geniş alan birbirinden 15 mm bir konuma (iv). Yemeğin alt tarafına bağlı bir ısıtma elemanı (V), analiz sırasında 37 ° C'de kültürü korumak için kullanılır. Sıcaklık kontrolü, dinamik ve orta (gösterilmemiştir) yerleştirilen bir termistör vasıtasıyla düzenlenir olduğunu. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Kontrol yazılımı yatan mantık Şekil 3. Akış şeması. kullanıcı girişi ve tarama hareketini denetleyen bir döngü için bir ana döngü: Lazer ve foto-detektör iki yazılım tarama kontrolü hareketini döngüler. Ana döngüsü içinde, yüksek hacimli veri toplama için orta için ikinci döngü aktivasyonu takip sırasında Kur yapılır. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Yazılımın Şekil 4. grafiksel kullanıcı arayüzü konsol değerlendirmesi sırasında lazer ve foto-detektör pozisyonlarını kontrol etmek için kullanılır. (A), düğmeler ve böylece el için yazılım sağlayan, el ile 4 köşe dirsekleri pozisyonlarını ayarlamak için kontrol eder. (B) X ve Y'nin her ikisi de düzlemde lazer ve foto-detektör pozisyonları kontrol (1, 16, 17 ve 32) içindizideki kalan konsolun pozisyonlarını tahmin. (C) Denetimler kullanıcıların dahil konsol hangi seçmek için izin her tarayın. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Bu sistem içinde kullanım için özel üretim konsol çipin 5. Görüntü Şekil ve benzeri yüzeylerde tutulan hücrelerin temsili görüntüler. Tek bir özel inşa konsol çip (A) Fotoğraf. Her çip sağ üst görüntü ve konsolun 32 sol alt konumlandırılmış 16. Cantilever 1 2 sıra halinde düzenlenmiş 32 konsol içerir. Konsol fiş 15 x 15 mm2. Primer fare iskelet kas hücreleri (B) faz kontrastlı dirsekteki büyütülürs. Her konsol kalın 750 100 mikron genişliğinde uzun um ve 4 mikron. (C) bir konsol üzerinde tutulan bir primer sıçan miyotüp imünositokimyasal leke. Hücreler, miyozin ağır zinciri için bir antikor probu kullanılarak boyandı. Kontraktil makine olgunlaşma gösteren kültür elyafın çizgili görünümünü unutmayın. Konsol kenarları yapay ölçekte bir gösterge sağlamak için bu görüntüde vurgulanmıştır. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Konsol üzerinde miyotüplerinin tarafından üretilen kuvvet türetmek için Stoney denklemlerinden kullanılan terimleri gösteren Şekil 6. şematik. Miyotüp, C tarafından üretilen δ = konsol ucu sapma ve stresdetektör = fotodetektör laser konuma gerilimi ile sisteme özel katsayısı θ = konsolun düzlemine lazer ve detektör açısının E Si silikon elastik modüle = t Si = kalınlıkları konsol, t f = miyotüp kalınlığı, v Si = silikon Zehrin oranı, L = konsol uzunluğu ve dedektöre konsol ucundan lazer P = yol uzunluğu. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 7. Temsilcisi ham veri ve açıklanan konsol sistemi kullanılarak kasılma formu analizi. (A) konsol üzerinde birincil sıçan miyotüplerinin geniş alan elektrik stimülasyonu bir ham veri iz örneği. Konsolun üstünde zorlanma uzunlamasına belirten Üst iz = x-ekseninde (Volt) lazer saptırma. Konsol üzerinde burulma gerginliğini gösteren Orta iz = y ekseninde (Volt) lazer saptırma. Alt iz = Bu sistemde miyotüp daralmayı ortaya çıkarmak için kullanılan elektrik sinyalleri zamansal konum göstergesi. (B) standart elektrofizyoloji yazılımı kullanarak, maksimum kuvvet (PF) ölçmek mümkündür, zaman yarısına kuvvet (TTP) ve zaman zirve Primer sıçan iskelet kası miyotüplerinin gelen toplanan ham verilerden gevşeme (1/2 RT) yapıldı. (C) Harmanlı daralma verileri (n = 11). Bir modifiye Stoney denkleminin Uygulama Volt ham veri okumalardan konsol stres hesaplanmasını sağlar. Bu verilerden, (Newton) kuvvet doğrudan bir hesaplama da oluşturulabilir. W yeniden basıldı yayınlanmış verilerinci izni 13. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil konsol kültürlerde iskelet kas yorgunluğu analizini gösteren 8. Temsilcisi verileri. (Volt) Ham veri miyotüp (nano-Newton) kuvvet ve yeniden çizilen bir ölçümü dönüştürüldü. Veri 0 dakika (siyah iz) ve sürekli stimülasyon 120 dakika (gri iz) sonra 1 Hz geniş alan elektriksel sinyallere yanıt olarak konsol üzerinde miyotüp kasılmalar büyüklüğünü göstermektedir. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Ve bir nöromüsküler blokerine eklenmeden, motonöron stimülasyon işlevsel etkilerini gösteren konsol üzerinde sağlanan iskelet kas motor nöron ko-kültür analizi Şekil 9. Örnek izler. (Volt) Ham veriler miyotüp bir ölçümü ile dönüştürüldü Kuvvet ve (nano Newton) yeniden işlenmiştir. nöronal uyarım olmadan kültürlenmiş miyotüplerinin spontan kasılmaları (A) ölçümü. 200 uM glutamat ilavesi yoluyla nöronal uyarım aşağıdaki miyotüp daralma (B) ölçümü. (C) Ölçüm glutamat ve 12.5 mcM D-tubokurarin tedavisi sonrasında miyotüp daralma. Izni 16 ile yeniden basıldı yayımlanan veriler. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Aşağıdaki tablolar konsol değerlendirmesini gerçekleştirmek için gerekli açıklanan doğrulama deneyleri kültür hücreleri kullanıldı özgü reaktifler yanı sıra ekipman listesi. Kullanılan kültür reaktifler gerekli değildir ve bu sistem kolayca in vitro kasılma hücreleri korumak herhangi bir laboratuar kültürü protokolleri ile entegre edilmesi gerektiğini lütfen unutmayın. Sağlanan listelenen reaktifler Araştırmacılar açıklanan belirli deney sonuçlarını tekrarlamak isteyen gerekir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hücresel daralma kanıt için mikro konsol analiz kritik adımlar mikroskop sahne içindeki konsol çip yerleştirme ve dizideki köşe konsolun ucuyla lazer ve foto-dedektör sonraki hizalama vardır. Bu doğru yapılmazsa, o zaman yazılım potansiyel veri toplama sırasında yanlış negatif birikimine neden, dizideki kalan konsolun pozisyonlarını hesaplamak için mümkün olacaktır. Operatörler konsol çip lazer pozisyonları kalibre önce kültür çanak alt ile aynı hizada yalan emin olmak için dikkatli olmalıdır. Çip çanak içinde bir açıda yer alır, bu bükülmüş lazer ışınının yolunu değiştirmek ve veri toplama karışacağı.
Fonksiyonel bir hava tablo veri toplama sırasında arka plan titreşimleri iptal etmek istihdam edilmelidir. Bu çalışmada kullanılan pr konsolun küçük bir kalınlık, (yaklaşık 4 um)ovides yüksek kontraktil aktivite duyarlılık, ama titreşimlere karşı duyarlılık artışı yan etkisi vardır. Operatörler arka plan okumaları azaltmak için, veri kayıt sırasında mümkün olduğunca az donanım dolaşmak için dikkat etmelisiniz. Aşamasında konsol çip yerleştirerek Son olarak, iyi kültüründe uyarıcı gümüş elektrotlar ile temas etmez çip sağlamak için dikkat. Çipi temas elektrod ile geniş alan uyarım uygulama akım yolunu değiştirebilir ve negatif etkili bir kültür hücrelerini uyarma sistemi yeteneğini etkileyecektir.
Iskelet kası miyotüplerinin kuvvet çıkışının daha doğru okuma elde etmek için, yüksek derecede bir kez tamamlandıktan işlevsel analiz, kültürlenen hücrelerin imüno-boyama yapılması tavsiye edilir. Listelenen denklemler kuvveti hesaplamak için bir miyotüp çapraz kesit alanı (CSA) girişini içerir. Varsayılan bir p değeri göre kullanılabilir olmakla birliktenceki verileri, sözleşme miyotüp tarafından uygulanan kuvvetin daha doğru bir tahmin sağlayacak konfokal görüntüleme teknikleri kullanılarak bir miyotüp kesin CSA ölçülmesi. Söz konusu hücrenin fiziksel özelliklerine, ham veriyi daralma ile birden fazla konsol üzerinde normalize sonuç olarak değerli ve deneysel koşullara 15 arasında, ve ilaç tedavisi veya hastalığa bütün doku yanıtlarının doğru tahminler üretmek için kritiktir. Stoney denklemleri incelendiğinde miyotüpleri yüzden çaba yalnızca bu varsayımı ile uyumlu hücrelerinden elde edilen verileri dahil yapılmalıdır konsolun boyunu kaplayacak varsayalım. Bu mümkün değilse, sonlu elemanlar analizi, daha önce 15 olarak yayınlanan küçük miyotüplerinin kuvvetin doğru bir ölçümünü sağlamak için kullanılabilir. Bu analitik yöntem çok daha emek yoğun ve dolayısıyla daha yüksek hacimli uygulamalar yakışmayan, ancak optimize gerekli olabilirStoney tahminlerine uygun hücre kültürleri elde edilemez.
Daha önce belirtildiği gibi, kültür parametreleri standart lamel hazırlıkları transfer edilebilir. Bununla birlikte, ilaç tarama uygulamalarda, bu sistemin kullanımı için serumsuz ortam bileşimleri ve biyolojik olmayan alt katmanlar kullandıkları dikkate için tavsiye edilir. Nedeniyle hayvan serasının tanımlanmamış olması nedeniyle, yeni tedavi etkisi kültür ortamında bu gibi katkı maddelerinin dahil edilmesi ile şaşırtıcı olabilmektedir. Serumsuz ortam formülasyonları kemirgen ve insan iskelet kası kültürleri 18-21 ve bileşik değerlendirme yapmak için bir daha kontrollü ve iyi tanımlanmış bir ortam sağlar hem de mevcuttur. Benzer şekilde, konsol biyolojik kaplamalar (Kollagen, laminin, vs) kullanımının biyolojik olmayan alt-tabakaların uygulanması ile önlenir hücre hazırlama değişkenlik getirmektedir. Kültür yüzeyleri üzerine silan kendinden düzenlenen tek katmanlarının yerleştirme ex gösterilmiştirtensively çok sayıda hücre tipinde 16,18,20,22-31 yapışmasını ve gelişimi, güvenilir ve tekrarlanabilir bir şekilde tam olarak tanımlanmış yüzeyler üretmek için araçlar temsil etmek.
Ötürü memeli sistemlerinde mevcut kontraktil hücre aralığı için in vitro deneyler için, bu modelin uygulanması nispeten geniştir. Iskelet kası hücreleri kullanılarak optimize edilmiş olsa da, sistem, gerçek zamanlı olarak bu hücrelerde yeni tedavi için doz cevabın değerlendirme yapmak için bir araç sağlayan, hem de kas hücreleri ve kardiyomiyositlerde pürüzsüz potansiyel olarak uygulanabilir. Şu konsol cips 32 cantilevers (Şekil 5A) bir dizi oluşur, ancak kolayca çok daha fazla dahil etmek için değişmiş olabilir. Bu tür dizilerin analizi böylece büyük ölçüde herhangi gözlenen farkların istatistiksel gücünü artırmak, tek bir kültürden veri noktaları önemli bir sayı üretir. Şekil 8, hücreler kültür kanıtlandığı gibiBu sistemde, bu kültür modele innerve motor nöronlarının in vitro. Addition hücrelerin dayanıklılık seviyeleri üzerindeki ilaç etkileri tahmin edilmesine izin sürekli geniş alan uyarımına tepki olarak zaman içinde yorgunluk geçmesi, aynı zamanda kas ölçümü yoluyla sinaps oluşumu değerlendirilmesine olanak sağlamaktadır nöronal uyarıcı tepki daralma (Şekil 9). Bir çoklu işlevsel tahlildeki başlangıç parametrelerinin ölçümü (Şekil 7), in vitro kültürler, standart biyomoleküler değerlendirilmesi göre avantajları vardır, nöromüsküler özelliğe tohumlu hücrelerin dayanıklılık kapasitesini değerlendirmek için yeteneği büyük ölçüde ilaç taraması için, bu modelde uygulanabilirliğini artırır ve hastalık modelleme uygulamaları. Açıklanan teknik araştırmacılar, in vitro sağlıklı ve hastalıklı kas hücreleri hem hızlı, düşük maliyetli fonksiyonel değerlendirmeyi gerçekleştirmek için araçları sunar. , Kültür sisteminin çok yönlülüğü ve hham verilerin analizinden elde fonksiyonel detay üksek düzeyi, yeni patolojik ve kimyasal zorluklara in vivo doku yanıtlarının daha doğru tahminler üretmek gerekir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu araştırma Sağlık hibe numaraları R01NS050452 ve R01EB009429 Ulusal Enstitüsü tarafından finanse edildi. Konsol cips imalatı Cornell Üniversitesi'nde bulunan Nanofabrikasyona Tesisinde işbirlikçileri tarafından dışarıdan gerçekleştirildi. Konsol üretim sürecinde kullanılan tüm ekipmanlar bu tesiste yer oldu. Konsol mikro-üretim ile yardım için Mandy Esch ve Jean-Matthieu Prot Special thanks. Konsol işlevsellik video animasyon UCF de Sentetik Gerçeklik Lab Charles Hughes, Alex Zelenin ve Eric Imperiale tarafından oluşturulmuştur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary rat muscle growth medium | |||
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| B27 (50x) | Life Technologies | 17504044 | 1x |
| Glutamax (100x) | Life Technologies | 35050061 | 1x |
| G5 supplement | Life Technologies | 17503-012 | 1x |
| Glial-Derived Neurotrophic Factor | Cell sciences | CRG400B | 20 ng/ml |
| Brain-Derived Neurotrophic Factor | Cell sciences | CRB600B | 20 ng/ml |
| Ciliary Neurotrophic Factor | Cell sciences | CRC400A | 40 ng/ml |
| Neurotrophin-3 | Cell sciences | CRN500B | 20 ng/ml |
| Neurotrophin-4 | Cell sciences | CRN501B | 20 ng/ml |
| Acidic Fibroblast Growth Factor | Life Technologies | 13241-013 | 25 ng/ml |
| Cardiotrophin-1 | Cell sciences | CRC700B | 20 ng/ml |
| Heparin Sulphate | Sigma | D9809 | 100 ng/ml |
| Leukemia Inhibitory Factor | Sigma | L5158 | 20 ng/ml |
| Vitronectin | Sigma | V0132 | 100 ng/ml |
| Primary rat muscle differentiation medium | |||
| NB Activ 4 | Brain Bits LLC | NB4-500 | |
| Equipment | |||
| Class 2 red diode laser | Newport | ||
| Photo-detector | Noah Industries | ||
| Model 2100 Pulse stimulator | A-M systems | ||
| Multiclamp 700B Digitizer | Axon Instruments | ||
| Patch clamp microscope and stage | Olympus | ||
| Delta T4 culture dish controller | Bioptechs | ||
| Axoscope software | Molecular Devices | ||
| LabVIEW software | National Instruments | ||
| 37 oC, 5% CO2 incubator | NAPCO | ||
| Class 2 microbiological flow hood | Labconco | ||
| Pipettes and tips | Eppendorf |
References
- Bischoff, R. Enzymatic liberation of myogenic cells from adult rat muscle. Anat. Rec. 180, 645-661 (1974).
- Yasin, R., et al. A quantitative technique for growing human adult skeletal muscle in culture starting from mononucleated cells. J. Neurol. Sci. 32, 347-360 (1977).
- Dennis, R. G., Kosnik, P. E., 2nd, Excitability and isometric contractile properties of mammalian skeletal muscle constructs engineered in vitro. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 36, 327-335 (2000).
- Khodabukus, A., Baar, K. Defined electrical stimulation emphasizing excitability for the development and testing of engineered skeletal muscle. Tissue Eng Part C Methods. 18, 349-357 (2012).
- Langelaan, M. L. P., et al. Advanced maturation by electrical stimulation: Differences in response between C2C12 and primary muscle progenitor cells. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 5, 529-539 (2011).
- Stephenson, G. M., O'Callaghan, A., Stephenson, D. G. Single-fiber study of contractile and biochemical properties of skeletal muscles in streptozotocin-induced diabetic rats. Diabetes. 43, 622-628 (1994).
- Harber, M., Trappe, S. Single muscle fiber contractile properties of young competitive distance runners. Journal of applied physiology (Bethesda, Md: 1985). 105, 629-636 (2008).
- Hvid, L. G., et al. Four days of muscle disuse impairs single fiber contractile function in young and old healthy men. Experimental gerontology. 48, 154-161 (2013).
- Edman, K. A.
- Krivickas, L. S., Walsh, R., Amato, A. A. Single muscle fiber contractile properties in adults with muscular dystrophy treated with MYO-029. Muscle Nerve. 39, 3-9 (2009).
- Sung, J. H., et al. Microfabricated mammalian organ systems and their integration into models of whole animals and humans. Lab on a chip. 13, 1201-1212 (2013).
- Wilson, K., Molnar, P., Hickman, J. J. Integration of functional myotubes with a Bio-MEMS device for non-invasive interrogation. Lab on a chip. 7, 920-922 (2007).
- Wilson, K., Das, M., Wahl, K. J., Colton, R. J., Hickman, J. Measurement of contractile stress generated by cultured rat muscle on silicon cantilevers for toxin detection and muscle performance enhancement. PLoS ONE. 5, (2010).
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C.
- Pirozzi, K. L., Long, C. J., McAleer, C. W., Smith, A. S., Hickman, J. J. Correlation of embryonic skeletal muscle myotube physical characteristics with contractile force generation on an atomic force microscope-based bio-microelectromechanical systems device. Applied physics letters. 103, 83108 (2013).
- Smith, A., Long, C., Pirozzi, K., Hickman, J. A functional system for high-content screening of neuromuscular junctions in vitro. Technology. 1, 37-48 (2013).
- Stenger, D. A., et al. Coplanar molecular assemblies of amino- and perfluorinated alkylsilanes: characterization and geometric definition of mammalian cell adhesion and growth. Journal of the American Chemical Society. 114, 8435-8442 (1992).
- Das, M., Rumsey, J. W., Bhargava, N., Stancescu, M., Hickman, J. J. A defined long-term in vitro tissue engineered model of neuromuscular junctions. Biomaterials. 31, 4880-4888 (2010).
- Rumsey, J. W., Das, M., Bhalkikar, A., Stancescu, M., Hickman, J. J. Tissue engineering the mechanosensory circuit of the stretch reflex arc: Sensory neuron innervation of intrafusal muscle fibers. Biomaterials. 31, 8218-8227 (2010).
- Das, M., Rumsey, J. W., Bhargava, N., Stancescu, M., Hickman, J. J. Skeletal muscle tissue engineering: A maturation model promoting long-term survival of myotubes, structural development of the excitation-contraction coupling apparatus and neonatal myosin heavy chain expression. Biomaterials. 30, 5392-5402 (2009).
- Das, M., et al. Developing a novel serum-free cell culture model of skeletal muscle differentiation by systematically studying the role of different growth factors in myotube formation. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 45, 378-387 (2009).
- Stenger, D. A., Pike, C. J., Hickman, J. J., Cotman, C. W. Surface determinants of neuronal survival and growth on self-assembled monolayers in culture. Brain research. 630, 136-147 (1993).
- Hickman, J. J., et al. Rational pattern design for in vitro cellular networks using surface photochemistry. Journal of Vacuum Scienc., & Technology A: Vacuum, Surfaces, and Films. 12, 607-616 (1994).
- Das, M., Molnar, P., Devaraj, H., Poeta, M., Hickman, J. J. Electrophysiological and morphological characterization of rat embryonic motor neurons in a defined system. Biotechnology progress. 19, 1756-1761 (2003).
- Rumsey, J. W., et al. Node of Ranvier formation on motor neurons in vitro. Biomaterials. 30, 3567-3572 (2009).
- Murugan, R., Molnar, P., Rao, K. P., Hickman, J. J. Biomaterial Surface patterning of self assembled monolayers for controlling neuronal cell behavior. International journal of biomedical engineering and technology. 2, 104-134 (2009).
- Guo, X., Johe, K., Molnar, P., Davis, H., Hickman, J. Characterization of a human fetal spinal cord stem cell line, NSI-566RSC, and its induction to functional motoneurons. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 4, 181-193 (2010).
- Varghese, K., et al. A new target for amyloid beta toxicity validated by standard and high-throughput electrophysiology. PLoS ONE. 5, e8643 (2010).
- Natarajan, A., et al. Patterned cardiomyocytes on microelectrode arrays as a functional, high information content drug screening platform. Biomaterials. 32, 4267-4274 (2011).
- Davis, H., et al. Rat Cortical Oligodendrocyte-Embryonic Motoneuron Co-Culture: An Axon-Oligodendrocyte Interaction Model. Journal of biomaterials and tissue. 2, 206-214 (2012).
- Natarajan, A., DeMarse, T., Molnar, P., Hickman, J. Engineered In Vitro Feed-Forward Networks. J Biotechnol Biomater. 3, 2 (2013).
